Name: Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Lernen Sie die Immunhistochemie des Drosophila-Puppenabdomens für Entwicklungsbiologie und genetische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinen im abdominalen Epithel.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation unterstützt.

1. Tag 1 Bevor Sie beginnen: Eine gesunde Bevölkerung von Fliegen sollte beibehalten unter Verwendung von Standard-Protokollen Kultivierung werden: remove Erwachsene aus Flaschen oder Ampullen nach 3-4 Tagen von Ei-legen und damit die Entwicklung auf eine konstante Temperatur bis wandernde 3 rd Larvenstadium initiieren pupariation gehen. Die Larven / Puppen Übergang wird durch die Bildung der prepupae (als 0 Stunden nach Puparium Bildung-APF) markiert. Immobile Puppen sind aus älteren Puppen durch ihre weiße Färbung und von Larven, die noch nicht pupariation durch ihre längliche, runde Form und Vorwölbung der vorderen Stigmen begonnen unterschieden. Sie benötigen: <ul><li> Ein Pinsel für das Sammeln Puppen </li><li> Eine feuchte Kammer zur Kultivierung von Puppen: Eine Petrischale mit benetzt Papiertuch ausgekleidet und mit Filterpapier für die verschiedenen Zeitpunkte der Erhebung, Genotyp und Geschlecht der Puppen markiert </li><li> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen Puppen </li></ul> Sammlung, Kultivierung und Inszenierung Puppen <ol><li> Mit einem benetzten Pinsel entfernen sanft 0HR APF Puppen aus der Kultur-Flaschen / Vials und legen Sie sie in den Deckel der feuchten Kammer. </li><li> Mit dem Pinsel und 1X PBS vorsichtig waschen die Puppen, um Schmutz aus der Puppe Fall entfernen </li><li> Gegebenenfalls Art der Puppen nach Geschlecht. Die Gonade Primordien der Puppen können verwendet werden, um den Geschlechtern zu sortieren. Die männlichen Keimdrüsen Primordien sind eine seitliche Paar transluzenten Scheiben leicht durch die Puppenstadium Nagelhaut ca. 2 / 3 über die gesamte Länge des Körpers 5 zu sehen. Die weibliche Gonade Primordien sind kleiner und nicht so leicht zu erkennen. </li><li> Legen Sie die Puppen in die entsprechend gekennzeichneten Position in der feuchten Kammer und zurück auf eine konstante Temperatur. Kultur an den entsprechenden Entwicklungs-Zeitpunkt. </li></ol> 2. Tag 2: Dissection, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: <ul><li> Dissection Stereomikroskop </li><li> Chirurgische Pinzette </li><li> Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen </li><li> Zwei neun und Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85) <ul><li> Fill Brunnen von einem Gericht mit 1X PBS: Dies ist die Spülung Gericht zur Reinigung zerlegt Puppen </li><li> Fill Bohrungen der zweiten Schale mit Fixierung Puffer </li></ul></li><li> Feuchten Kammer für die Antikörper-Inkubation. Wir verwenden Kunststoff verschließbaren Sandwich-Boxen mit benetzt Papierhandtücher ausgekleidet. </li><li> Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung) </li><li> Dissection Plattform: Clear Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband verklebt auf einer Seite </li><li> 1X PBS </li><li> p100 oder p200 Pipette </li></ul> Zergliederung <ol><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Puppen eine nach der anderen und sie auf die Zerlegung Plattform mit dem vorderen Ende der Puppen mit Blick auf den breitesten Breite des Bandes. Wenn Puppen übermäßig nass sind, zuerst blot sie trocken mit einem Papiertuch. </li><li> Bevor die Puppen ganz auf das Band geklebt haben, verwenden Sie einen Pinsel zu positionieren. </li><li> Lassen Sie die Puppen an der Luft trocknen und halten, um das Band (5-10 Minuten) </li><li> Mit dem chirurgischen Skalpell sezieren jeden Puppen bilateral. Dies geschieht am besten mit einer einzigen schnellen Schnitt von der vorderen bis zum hinteren Ende der Puppen erreicht. Wenn richtig gemacht, wird der Schnitt halbieren beiden vorderen und hinteren Luftlöcher Paaren. Dissect nicht mehr als 10 Puppen in einer Zeit, als Wasch-und Reinigungsmitteln die Proben schnell ist notwendig, um proteolytische Schädigung des Gewebes zu verhindern. </li><li> Mit einem Pinsel, Übertragung einer kleinen Menge 1X PBS in jedes seziert Puppen, um sie von dem Band zu lösen. </li></ol> Reinigung, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation <ol start="6"><li> Mit einem Paar chirurgische Pinzette fassen eine individuelle Puppe ein halb nach vorn und sofort eintauchen in eine Vertiefung der Spül-Schüssel. Die Dissektion Plattform soll durch die Spülung Schüssel auf dem Mikroskoptisch ersetzt werden. Die Puppen Fall sollte auf die Probe belassen werden, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist und die Proben sind bereit zur Montage. </li><li> Während noch Ergreifen der Puppe die Hälfte verwendet eines Pipettierautomaten vorsichtig abwaschen das innere Gewebe des Bauches. Zu viel Druck beim Waschen kann zum Verlust von Epithelzellen führen. </li><li> Sofortüberweisung das saubere Puppe Hälfte Fixierung Puffer bei Raumtemperatur und Verfahren die restlichen Puppe Hälften ähnlich. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Waschen von 20 Puppe Hälften sollte weniger als 5 Minuten. </li><li> Lassen Sie Puppen in Fixierung Puffer bei Raumtemperatur inkubieren für 1 (eine) Stunde. </li><li> Spülen festen Puppen 3x 5 Minuten in 1X PBS </li><li> Die Proben können sofort für die Immunhistochemie verarbeitet werden oder in 100% Ethanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu 3 Monaten ohne Verlust von Zellen oder Epitop Reaktivität. </li><li> Zum Speichern von Proben, äquilibrieren Proben durch eine VerdünnungSerie von PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bei Raumtemperatur für 20 Minuten in jeder Verdünnung vor der Übertragung zu 100% EtOH. </li><li> Proben müssen erneut in PBS äquilibriert durch die Reverse-Serie vor der Verarbeitung für die Immunhistochemie. </li><li> Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des primären Antikörpers. </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS über Nacht bei 4 ° C, ohne Schaukeln. </li></ol> 3. Tag 3: Sekundäre Antikörper-Inkubation, Montage-und Imaging- Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: <ul><li> Zwei chirurgische Zange </li><li> Montage Medien (Glycerin, Vectashield [Vector Labs] oder Slowfade Gold [Invitrogen]) </li><li> Depression und Objektträger (0,8 mm) </li><li> Deckgläser (24 x 40 mm) </li></ul> Sekundäre Antikörper-Inkubation und Montage: <ol><li> Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS </li><li> Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des sekundären Antikörpers. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln, ohne Schaukeln für 3 (drei) Stunden. </li><li> Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS </li><li> Gegebenenfalls Gegenfärbung Puppen (Beispiel haben wir Flecken Kerne mit DAPI [4 ',6-Diamino-2-phenylindole] in PBS für 10 Minuten verdünnt). </li><li> Äquilibrieren Proben (mindestens 30 Minuten) in geeigneten Medien vor der Montage. </li><li> Bereiten Sie eine Probe gleiten. Die Morphologie der Puppen verhindert flache Montage. Die Proben werden in die Vertiefung einer Depression slide (tropfen) für die Bildgebung montiert. Legen Sie 75-100 ul der Montage Medien in die Depression gut. Mehrere Proben können auf einer einzelnen Folie angebracht werden. </li><li> Die Puppe Fall muss aus den Proben vor der Montage entfernt werden. Fassen Sie eine individuelle Puppe Fall anterior Dabei bitte nicht auf den internen Puppenstadium Membran zu erfassen. </li><li> Mit einer zweiten Pinzette vorsichtig greifen die internen Puppenstadium Membran durch den Kopf und entfernen Sie sie aus der Puppenhülle. </li><li> Unmittelbar Übertragung der Probe auf die Depression gut und die Verarbeitung fortzusetzen zusätzliche Proben. </li><li> Mit einer Sonde oder Pinzette Position der Proben gleichmäßig in die Depression auch mit den seitlichen Oberfläche nach oben zeigt. Gelegentliche Luftblasen können mit einer Sonde entfernt werden. </li><li> Senken Sie das Deckglas auf den Proben dabei nicht um Luftblasen zu präsentieren </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Proben unter Verwendung dieses Protokoll erhalten die grobe Morphologie der erwachsenen Bauch. Bild Stapel können projiziert, um eine zweidimensionale Bild-oder 3-D Rendering angewendet werden, um Bauch-Topologie untersuchen zu generieren. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Segmentation Genprodukte in Drosophila Puppen Wingless Protein und Engrailed Ausdruck (En-Gal4: UAS-GFP). Wurden 26 Stunden nach Puparium Bildung (APF) visualisiert mit Maus anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) und anti-GFP. 10-facher Vergrößerung ist vorderen linken und dorsal wird. Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Stacks von ca. 50 Bilder (DELTA Z zwischen den Schichten ist 2.5μm) projiziert wurden.

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Techniken in diesem Video präsentiert werden verwendet, um Drosophila Puppen aus einer Vielzahl von Entwicklungs-Zeitpunkten vorzubereiten. Puppen in der Zeit von 24 Stunden APF zu 32 Stunden bearbeitet APF sind besonders anfällig für Zell-Verlust aus dem Epithel. Die Verwendung von Waschmitteln (wie z. B. Triton X-100 und Tween-20) während der erweiterten Inkubationsschritte erhöht die Wahrscheinlichkeit von Zell-Verlust und wird daher nicht empfohlen. Vielmehr ist Desoxycholsäure als Reinigungsmittel in der ersten Fixierung Schritt verwendet. Alle weiteren Schritte sind in 1X PBS ohne Waschmittel durchgeführt. Außerdem rocken Proben während längerer Inkubationsschritte erhöht Zellverlust und sollte vermieden werden. Die Proben können abgebildet mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie-Techniken sein. Allerdings verarbeitet Drosophila Puppen wie beschrieben kann auch abgebildet mit einem Structured Illumination Microscopy System Nachgeben Bildqualität vergleichbar mit der konfokalen Techniken.

<ul><li> Dissection Stereomikroskop </li><li> Chirurgische Pinzette </li><li> Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen </li><li> Neun-Loch-Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85) </li><li> Feuchten Kammer zur Kultivierung von Puppen </li><li> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </li><li> Nr. 11 chirurgische Skalpell </li><li> doppelseitigem Klebeband </li><li> Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung) </li><li> p100 oder p200 Pipette </li><li> Depression und Objektträger (0,8 mm) </li></ul>

drosophila puppenstadium abdomen immunhistochemie

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Die Drosophila Puppenstadium Bauch ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung von epithelialen Morphogenese und die Entwicklung von sexuell dimorphen Morphologien 1-3. Während der Verpuppung, die etwa 96 Stunden umfasst (bei 25 ° C), ersetzen proliferierenden Populationen von imaginalen Zellen der larvalen Epidermis der Erwachsenen Abdominalsegmente zu generieren. Diese imaginäre Zellen, geboren während der Embryogenese, als seitliche Paar histoblast Nester in jedem Abdominalsegment der Larven vorhanden sind. Vier Paare von histoblast Nestern führen zu den Erwachsenen dorsalen Kutikula (vordere und hintere dorsale Nester), das ventrale Kutikula (ventral Nester) und die Luftlöcher, wobei jedes Segment (Luftloch Nester) 4 verbunden. Nach puparation, beginnen diese diploiden Zellen (unterscheidbar nach Größe von den größeren polyploiden larvalen Epidermiszellen-LECs) eine stereotype Prozess der Proliferation, Migration und Austausch der LECs. Verschiedene molekulare und genetische Werkzeuge können eingesetzt werden, um die Beiträge der genetischen Ursachen der Morphogenese der erwachsenen Bauch beteiligt zu untersuchen. Ultimative Erwachsenen Phänotypen sind in der Regel folgende Zerlegung der erwachsenen abdominale Nagelhaut analysiert. Allerdings erfordert Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Prozesse immunhistochemischen Analysen der Puppenstadium Epithel, das einzigartige Herausforderungen. Zeitlich dynamische Morphogenese und die Interaktionen von zwei verschiedenen epithelialen Populationen (Larven-und imaginären) erzeugen eine fragile Gewebe anfällig für übermäßige Zellverlust während der Präparation und die anschließende Verarbeitung. Wir haben Methoden zur Präparation, Fixierung, Montage-und Imaging-der Drosophila-Puppen abdominem Epithel für immunhistochemische Studien, die eine gleichbleibend hohe Qualität Proben geeignet für die konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie oder Standard generieren entwickelt.

Antikörper-Färbung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppen verbessern können genetische Analysen von Erwachsenen abdominale Entwicklungsgenetik. Wir präsentieren unsere Protokoll für die Präparation, Fixierung und Antikörper-Färbung der inszenierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppenstadium Bauch.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Das Puppenabdomen von Drosophila ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der epithelialen Morphogenese und der Entwicklung sexuell dimorpher ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Bauepithel von Drosophila-Puppen für die Immunhistochemie vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst bilateral Puppen im entsprechenden Entwicklungsstadium seziert und die inneren Organe entfernt werden, sodass nur noch das Bauepithel, das aus proliferierenden Imaginalanlagen, Osteoblasten und larvalen Epidermiszellen besteht, an der Pupillenmembran befestigt bleibt.Das Gewebe wird dann fixiert, mit Antikörpern inkubiert, die von der äußeren Pupillenkapsel entfernt wurden, und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, um die grobe Morphologie des Bauchepithels sowie die Expression von Proteinen von Interesse darzustellen. Hallo, ich bin John Yoder. Mein Labor befindet sich an der University of Alabama in der Abteilung für Biologische Wissenschaften.Hallo, ich bin we won, ein studentischer Mitarbeiter im Yoda-Labor. Heute werden wir Ihnen unsere Methode zur Dissektion der Drosophila-Kuppe sowie zur Immunhistochemie des Drosophila-Puppenabdomens vorstellen.Diese Methode kann verwendet werden, um Prozesse der epithelialen Morphogenese und Gewebeumorganisation zu untersuchen. Wir verwenden diese Technik insbesondere, um die Entwicklung der geschlechtsdimorphen Morphologie des adulten Drosophila-Abdomens zu analysieren. Aus einem Populationengefäß bei 25 Grad Celsius ohne erwachsene Tiere identifizieren. Kürzlich immobilisierte Puppen, deren Cuticula noch nicht mit der Bräunung begonnen hat, gelten als null Stunden nach der Puparienbildung (PF). Mit einem angefeuchteten Pinsel diese Puppen vorsichtig entfernen und auf den Deckel einer befeuchteten Kammer legen. Falls erforderlich, mit dem Pinsel und PBS vorsichtig Ablagerungen von den Puppenhüllen abwaschen.Sortieren Sie die Puy nach Geschlecht zum Zeitpunkt null Stunden. Die primordiale männliche Goad ist leicht durch die Pupillenhaut sichtbar. Ungefähr zwei Drittel des Körpers entlang sind die primordialen weiblichen Goad kleiner und nicht so leicht zu identifizieren.Legen Sie nun die Puppe auf das angefeuchtete Filterpapier in die befeuchtete Kammer. Setzen Sie den Deckel wieder auf und stellen Sie sie in eine Umgebung mit konstanter Temperatur zurück. Wenn die Tiere den gewünschten Entwicklungszeitpunkt erreicht haben, führen Sie die Dissektion durch. Beachten Sie, dass Puby, die 24 bis 32 Stunden nach PF bearbeitet wurden, am anfälligsten für den Verlust von Epithelzellen während der anschließenden Verarbeitung sind. Bereiten Sie die Dissektion vor, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an einer Seite eines transparenten Objektträgers befestigen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um vorsichtig jeden Pupillenbereich zwischen den vorderen sphärischen Strukturen zu fassen, und legen Sie sie mit der dorsalen Seite nach oben auf das Klebeband.Ordnen Sie maximal 10 PSA auf diese Weise an, um nicht zu langsam zu arbeiten. Innerhalb von fünf bis zehn Minuten sind die PSA vollständig miteinander verbunden, doch bevor dies geschieht, verwenden Sie einen Pinsel, um sie gleichmäßig im Parallelabstand zu positionieren. Eine verlängerte Trocknung in diesem Stadium verringert ihre Qualität.Bewegen Sie sich also schnell. Verwenden Sie nun ein chirurgisches Skalpell, um jedes Puppenindividuum A bilateral zu dissezieren. Führen Sie einen einzigen schnellen Schnitt von der vorderen bis zur hinteren Endseite der Puppe aus.Wenn der Schnitt korrekt ausgeführt wird, teilt er sowohl die vorderen als auch die hinteren sphärischen Paare, wodurch symmetrische linke und rechte Hälften entstehen, um die Puppe vom Klebeband zu lösen. Verwenden Sie einen Pinsel, um mithilfe chirurgischer Pinzette eine kleine Menge PBS auf jede präparierte Puppe aufzutragen. Greifen Sie eine Puppenhälfte am vorderen Ende und tauchen Sie sie in eine mit PBS gefüllte Spülschale auf dem Objekttisch des Präparationsmikroskops; während Sie die Puppe weiterhin festhalten, spülen Sie vorsichtig das innere Gewebe aus, indem Sie mit einer Pipette PBS in die Bauchhöhle pumpen.Vermeiden Sie es, zu viel Druck auszuüben, da sonst Zellen aus dem Epithel verloren gehen können. Tauchen Sie das saubere Gewebe sofort in 400 µL Fixierpuffer bei Raumtemperatur ein und reinigen Sie alle Puppenhälften. Ebenso sollte das Dissektionieren und Waschen von 20 PU-Hälften mit etwas Übung weniger als fünf Minuten in Anspruch nehmen.Lassen Sie das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur in dem Fixierpuffer inkubieren und waschen Sie es anschließend dreimal mit jeweils 400 µL PBS, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Zum Aufbewahren der Proben waschen Sie sie zunächst zweimal mit 100 % Methanol, danach überführen Sie sie zur Lagerung in 100 % Ethanol. Diese Proben können bis zu drei Monate lang in 100 % Ethanol bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden, ohne dass Zellen oder Epitopreaktivität verloren gehen.Zur Verarbeitung der gelagerten Proben müssen diese zunächst durch eine Ethanolreihe in PBS reratiert werden. Fahren Sie mit der Immunhistochemie fort, indem Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur und ohne Schütteln in PBS mit 2 % BSA blockieren. Das Schütteln der Proben erhöht den Zellverlust aus dem Bauchepithel erheblich.Ersetzen Sie dann die Blockierungslösung durch den Primärantikörper, der in PBS auf die geeignete Konzentration verdünnt wurde. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius, ohne zu schütteln und in einer geschlossenen, feuchten Kammer, um eine Verdunstung am nächsten Tag zu verhindern. Waschen Sie die Proben dreimal in PBS, ohne zu schütteln, jeweils 10 Minuten pro Waschgang.Dann die Proben eine Stunde lang in PBS mit 2 % BSA blockieren, ohne zu schwenken. Die Blockierungslösung durch sekundären Antikörper in PBS bei Raumtemperatur ersetzen. Anschließend die Proben drei Stunden im Dunkeln und ohne Schwenken inkubieren.Im Anschluss an den Sekundärantikörper drei Waschungen in PBS für jeweils 10 Minuten durchführen, falls angebracht. Gegenfärben Sie das Präparat; beispielsweise können Kerne durch eine 10-minütige Inkubation in mit PBS verdünntem DAPI angefärbt werden. Danach die Proben mindestens 30 Minuten in Eindeckmedium inkubieren.Um die Proben zu montieren, greifen Sie jeden Pupillarkörper anterior an und vermeiden Sie dabei die innere Pupillarmembran mit einem zweiten Paar Pinzetten. Fassen Sie die innere Pupillarmembran vorsichtig am Kopf an und ziehen Sie dann die Probe vorsichtig aus dem Pupillarkörper heraus.Überführen Sie die UCA-Probe mit 75 bis 100 Mikrolitern Montagemedium auf eine Vertiefungsobjektträger. Mehrere Proben können auf einem einzigen Objektträger angeordnet werden. Verwenden Sie nun eine Sonde und eine Pinzette, um die Proben gleichmäßig in der Vertiefung zu positionieren.Drehen Sie die Objekte so, dass ihre Seitenflächen nach oben zeigen, und entfernen Sie eventuelle Luftblasen mit einer Sonde. Abschließend senken Sie die Deckgläser vorsichtig auf die Proben, ohne Luftblasen einzuschließen, für diese Präparation. Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung wird mit konfokalen Techniken vergleichbar sein.Dies ist eine Projektion von 50 konfokalen Bildern mit 2,5 Mikrometern zwischen den Schichten. Das Gewebe befindet sich 26 Stunden nach der Befruchtung, und die Färbung zeigt das Expressionsmuster des Wingless-Proteins und des durch grail gesteuerten GFP sowie der Kerne. Die Anteriorseite liegt links, dorsale Strukturen befinden sich oben auf dem Bildschirm.Dieses Video zeigt, wie die grobe Morphologie von Proben durch das Verfahren erhalten bleibt, wodurch die dreidimensionale Rekonstruktion von Bildstapeln ermöglicht wird. So können mehrere Dutzend Proben innerhalb von weniger als 30 Minuten bearbeitet und in Puffer zur Fixierung gegeben werden.Außerdem eignen sich die mit diesem Protokoll hergestellten Proben für die In-situ-Hybridisierung, was dieses Protokoll zu einer wertvollen Methode für Genexpressionsstudien macht.

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt, wie Immunhistochemie auf seziert Drosophila Larve führen.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Das Ziel dieser Technik ist es, Forschern die Möglichkeit zu geben, Puppenaugenscheiben jeden Alters zu dissektionieren, Immunfärbung  und Montage von Puppenaugenscheiben durchzuführen.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Präparation und Visualisierung von festsitzendem Gewebe des Drosophila pupal notum. Es kann entweder für intaktes oder verwundetes Gewebe verwendet werden, und die ursprüngliche Architektur des Gewebes bleibt erhalten. Die Verfahren zum Sezieren, Fixieren und Färben werden alle in diesem Artikel beschrieben.

Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell, um die grundlegenden Mechanismen der Myogenese zu verstehen. Dieses Protokoll für die Dissektion und Präparation von Thorax-Hemisektionen ermöglicht die mikroskopische Analyse des indirekten Flugmuskels sowohl im Puppen- als auch im Erwachsenenstadium. Dieses Protokoll ermöglicht die konfokale Bildgebung der zellulären Morphologie, der Proteinlokalisierung, der Muskelstruktur und mehrerer anderer Aspekte der Myogenese.

Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

Lernen Sie die Immunhistochemie des Drosophila-Puppenabdomens für Entwicklungsbiologie und genetische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinen im abdominalen Epithel.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

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