Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das abdominale Epithel von Drosophila puy für die Immunhistochemie vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst bilateral das Stadium Drosophila puy dispariert und die inneren Organe so entfernt werden, dass nur das Bauchepithel aus proliferierendem Imaginal besteht. Seine Osteoblasten- und Larven-Epidermiszellen bleiben an der Pupillenmembran haften.

Das Gewebe wird dann fixiert, mit Antikörpern inkubiert, aus dem äußeren Pupillengehäuse entfernt und durch Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, um die grobe Morphologie des Bauchepithels und die Expression von Proteinen von Interesse zu zeigen. Hallo, ich bin John Yoder. Mein Labor befindet sich an der University of Alabama im Department of Biological Sciences.

Hallo, ich bin, wir haben gewonnen. Ich bin ein Peer-Student im Yoda Lab. Heute zeigen wir Ihnen unsere Methode zur Dissektion der Drosophila, der Becher und der Immunhistochemie des Abdomens der Drosophila pupa.

Mit dieser Methode können Prozesse der epithelialen Morphogenese und der Gewebereorganisation untersucht werden. Wir verwenden diese Technik spezifisch, um die Entwicklung der sexualdimorphen Morphologie des adulten Drosophila-Abdomens zu untersuchen: Aus einem 25 Grad Celsius Populationsfläschchen ohne adulte Tiere identifizieren. Kürzlich immobilisierte Puy Puy mit Nagelhaut, die noch nicht zu bräunen begonnen hat, gelten als null Stunden pro PF. Entfernen Sie diese Puys vorsichtig mit einem benetzten Pinsel und legen Sie sie auf den Deckel einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie bei Bedarf vorsichtig Schmutz von den Puer-Hüllen ab.

Sortieren Sie den Puy nach Geschlecht bei null Stunden. Ein PF-Männchen ist primordial durch die Pupillenkutikula leicht zu erkennen. Etwa zwei Drittel des Weges durch den Körper sind die weiblichen Blüten kleiner und nicht so leicht zu identifizieren.

Lege nun das Schamhaar auf das benetzte Filterpapier in die befeuchtete Kammer. Setzen Sie den Deckel wieder auf und bringen Sie ihn wieder in eine Umgebung mit konstanter Temperatur. Wenn die Tiere den interessierenden Entwicklungszeitpunkt erreicht haben, fahren Sie mit der Sektion fort.

Beachten Sie, dass Puppen, die 24 bis 32 Stunden A PF verarbeitet werden, am anfälligsten für den Verlust von Epithelzellen während der anschließenden Verarbeitung sind. Bereite dich auf das Sezieren vor, indem du ein Stück doppelseitiges Klebeband an einer Seite eines transparenten Objektträgers entlanglegst. Fassen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig jede Pupille zwischen den vorderen Kugeln und legen Sie sie mit der Rückenseite nach oben auf das Band.

Richten Sie auf diese Weise maximal 10 PSA aus oder riskieren Sie, zu langsam zu arbeiten. In fünf bis 10 Minuten ist die PSA völlig lieb, aber bevor dies geschieht, verwenden Sie einen Pinsel, um sie gleichmäßig zu verteilen und parallel zu positionieren. Eine längere Trocknung in diesem Stadium verringert ihre Qualität.

Handeln Sie also schnell. Verwenden Sie nun ein chirurgisches Skalpell, um jede Pupille A beidseitig zu präparieren. Machen Sie einen einzigen schnellen Schnitt vom vorderen zum hinteren Ende der Puppe.

Wenn der Schnitt richtig gemacht wird, werden sowohl die vordere als auch die hintere Kugelpaare halbiert, wodurch symmetrische linke und rechte Hälften entstehen, um die Schamhaut vom Band zu lösen. Trage mit einem Pinsel eine kleine Menge PBS mit einer chirurgischen Pinzette auf jede sezierte Puppe auf. Fassen Sie eine Puppenhälfte an ihrem vorderen Ende und tauchen Sie sie in eine mit PBS gefüllte Spülschale auf dem Präpariermikroskoptisch, während Sie die Puppe noch halten, und waschen Sie mit einer Pipette das innere Gewebe vorsichtig ab, indem Sie PBS in die Bauchhöhle pumpen.

Vermeiden Sie es, zu viel Druck auszuüben, da sonst Zellen aus dem Epithel verloren gehen. Tauchen Sie das saubere Tuch sofort in 400 Mikroliter Fixierungspuffer bei Raumtemperatur und reinigen Sie alle Puppenhälften. Ähnlich verhält es sich mit der Praxis: Das Präparieren und Waschen von 20 PU-Hälften sollte weniger als fünf Minuten dauern.

Lassen Sie den Puy eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Fixierungspuffer inkubieren und spülen Sie ihn dann dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang in 400 Mikrolitern PBS aus. Um die Proben zuerst zu lagern, spülen Sie sie zweimal in 100 % Methanol und überführen Sie sie dann zur Lagerung in 100 % Ethanol. Diese Proben können bis zu drei Monate lang in 100%igem Ethanol bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, ohne dass es zu Zellverlusten oder Epitopreaktivität kommt.

Um gelagerte Proben zu verarbeiten, müssen sie zunächst in PBS durch eine Ethanol-Serie neu bewertet werden. Fahren Sie mit der Immunhistochemie fort, indem Sie die Proben in PBS mit 2 %BSA eine Stunde lang bei Raumtemperatur und ohne Schaukeln blockieren. Das Schaukeln von Proben erhöht den Zellverlust aus dem Bauchepithel erheblich.

Ersetzen Sie dann die Blockierungslösung durch den Primärantikörper, der auf die entsprechende Konzentration in PBS verdünnt ist. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius ohne Schaukeln und in einer geschlossenen befeuchteten Kammer, um eine Verdunstung am nächsten Tag zu verhindern. Waschen Sie die Proben dreimal in PBS ohne Schaukeln und 10 Minuten pro Waschgang.

Blockieren Sie dann die Proben für eine Stunde ohne Schaukeln in PBS mit 2%BSA. Ersetzen Sie die Blocklösung durch einen Sekundärantikörper bei Raumtemperatur in PBS. Dann inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang im Dunkeln und ohne Schaukeln.

Nach dem Sekundärantikörper werden gegebenenfalls drei Wass in PBS für jeweils 10 Minuten verabreicht. Gegenfärbung des Puys, z. B. können Zellkerne mit einer 10-minütigen Inkubation in DPI, verdünnt durch PBS, gefärbt werden. Gleichen Sie anschließend die Proben mindestens 30 Minuten lang in Einbettmedien aus.

Um die Proben zu montieren, fassen Sie jedes Pupillengehäuse nach vorne, wobei Sie die innere Pupillenmembran mit einer zweiten Pinzette vermeiden. Fassen Sie die innere Pupillenmembran vorsichtig am Kopf an. Ziehen Sie dann die Probe vorsichtig aus dem Pupillengehäuse.

Übertragen Sie die Unca-Probe auf einen Depressionsobjektträger mit 75 bis 100 Mikrolitern Mundmedium. Es können mehrere Proben auf einem einzigen Objektträger montiert werden. Verwenden Sie nun eine Sonde und eine Pinzette, um die Proben gleichmäßig in der Vertiefung zu positionieren.

Drehen Sie sie gut so, dass ihre Seitenflächen nach oben zeigen, und entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Sonde. Senken Sie abschließend den Deckglas vorsichtig auf die Proben ab, ohne dass Luftblasen für diese Vorbereitung entstehen. Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung wird mit konfokalen Techniken vergleichbar sein.

Dabei handelt es sich um eine Projektion von 50 konfokalen Bildern mit einem Abstand von 2,5 Mikrometern zwischen den Schichten. Das Gewebe ist bei 26 Stunden ein PF, und die Färbung zeigt das Expressionsmuster von flügellosem Protein und Gral getriebenem GFP und den Zellkernen. Der vordere Bereich befindet sich auf der linken Seite und die dorsalen Merkmale befinden sich am oberen Rand des Bildschirms.

Dieser Film zeigt, wie die grobe Morphologie der Proben durch das Verfahren erhalten bleibt. Dies ermöglicht die dreidimensionale Rekonstruktion von Bildstapeln. West beherrschte mehrere Dutzend Schüler können in weniger als 30 Minuten persistiert und in den Fixationspuffer gelegt werden.

Darüber hinaus sind Proben, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, für die Einleitung einer Hybridisierung geeignet, was dies zu einem wertvollen Protokoll für Genexpressionsstudien macht.