Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auffüllung und Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikelpools in den zentralen Nervenendigungen mit Hilfe von Live-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren zu quantifizieren. Dies wird durch die Überwachung von zwei Runden des synaptischen Vesikelrecyclings erreicht, wobei FM-Farbstoffe in denselben Nervenendigungen verwendet werden, um gültige interne Kontrollen zu gewährleisten. In einem zweiten Schritt werden der leicht lösbare Pool und der Reservepool sequentiell mit Hilfe spezifischer Entladeprotokolle erschöpft, die die Quantifizierung der relativen Poolgrößen ermöglichen.

Ändern Sie als Nächstes entweder die Lade- oder Entladebedingungen, um die Wirkung der gewählten Variation auf das synaptische Vesikel, die Poolauffüllung oder die Mobilisierung zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die FM d-Beladung verschiedener synaptischer physikalischer Pools auf der Grundlage der Quantifizierung und Analyse der evozierten Farbstoffentladung reproduzierbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Familie der flüssigen genetischen Reporter, besteht darin, dass diese Technik die Wiederauffüllung von Pools spezifisch durch synaptische Vesikel verfolgt, die einer Endozytose unterzogen wurden.

Es ermöglicht auch eine genaue Quantifizierung. Da dieses Protokoll zweimal in denselben Nervenenden durchgeführt wird, bietet es eine interne Kontrolle. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Synaptik, CLE, Endozytose und Exozytose zu beantworten, z. B. wie sich die Manipulation in bestimmten Endozytosemodi auf die Wiederauffüllung sowohl des gesamten Recyclingpools als auch der synaptischen CLE-Pools darin auswirken kann, wie z. B. des leicht wiederverwendbaren Pools und des Reservepools.

grundlegende Versuchsaufbau sollte aus einem inversen Epi-Fluoreszenzmikroskop, einer gekühlten CCD-Kamera, einer Fluoreszenzlichtquelle, einer Schwerkraftperfusionsapparatur, einer Bildgebungskammer mit parallelen Platinelektroden und elektrischem Stimulator sowie einem Computer bestehen. Führen Sie die Experimente im Dunkeln oder unter roten Lichtbedingungen mit minimaler Fluoreszenzbeleuchtung der Probe durch, um ein Ausbleichen des FM-Farbstoffs zu vermeiden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sieben Tage alte Spra Dolly-Rattenbabys verwenden, um die Primärkulturen von Kleinhirn-Körnerneuronen vorzubereiten.

Nachdem die Kulturen vorbereitet wurden, plattieren Sie die Neuronen in der Mitte eines mit Poly-D-Lysin beschichteten 25-Millimeter-Deckglases in einem Tröpfchen mit einem Durchmesser von nicht mehr als sieben Millimetern nach einer Stunde und geben Sie nach sieben Tagen zwei Milliliter Nährmedium zu den Neuronen. Legen Sie einen einzelnen Deckglas 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in die Kochsalzlösung, um eine Stabilisierung im neuen Medium zu ermöglichen. Entfernen Sie danach den Deckglas, trocknen Sie die Unterseite und den Bereich um die befestigten Zellen mit einem kleinen Stück Papiertuch oder saugfähigem Papier.

kleben Sie mit dem Silikonfett den Deckglas auf den Boden der Bildgebungskammer. Die Zellen sollten sich zwischen den beiden parallelen Drähten befinden. Verwenden Sie ausreichend Silikonfett, um die Kammer vollständig abzudichten, ohne in die Mitte der Badkammer vorzudringen.

Füllen Sie anschließend die Badekammer vorsichtig mit etwa 260 Mikrolitern Kochsalzlösung. Füllen Sie dann den Ein- und Ausgangsschlauch mit der gleichen Lösung. Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie einen sauberen Deckglas mit Silikonfett auf die Oberseite kleben.

Entfernen Sie danach alle in der Kammer eingeschlossenen Luftblasen mit dem Ein- und Ausgangsschlauch. Immobilisieren Sie dann die Bildgebungskammer in einer Edelstahlplattform. Überprüfen Sie, ob es undicht ist, indem Sie die Kochsalzlösung vorsichtig durch den Eingangsschlauch gießen.

Der nächste Schritt besteht darin, die zusammengebaute Kammer auf dem Tisch eines inversen Mikroskops zu montieren. Grundieren Sie den Einlass des Schwerkraftperfusionssystems mit Kochsalzlösung und verbinden Sie die Kammer mit dem Einlass. Befestigen Sie dann die Verbindungsdrähte der Kammer an den elektrischen Stimulator.

Perfusionieren Sie die Neuronen mit 1,5 Millilitern verdünntem fm-Farbstoff. Stimulieren Sie anschließend die Neuronen mit dem beigefügten Stimulator, um die Farbstoffaufnahme hervorzurufen. Nach der Stimulation perfundieren Sie die Neuronen zwei Minuten lang mit frischer Kochsalzlösung, um überschüssigen FM-Farbstoff wegzuspülen. Halten Sie dann die Neuronen acht Minuten lang in der Kochsalzlösung.

Lokalisieren Sie in der Zwischenzeit die axonalen Netzwerke, an denen die einzelnen FMD-belasteten Nervenendigungen sichtbar sind. Verwendung von Fluoreszein-Wellenlängen. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellclustern.

Fokussieren Sie das Bild dann unmittelbar vor der Bildaufnahme neu, da während der Ruhephase möglicherweise eine leichte Drift aufgetreten ist. Starten Sie die Zeitraffer-Bildaufnahme mit einer Geschwindigkeit von einem Bild alle vier Sekunden. Nach der Aufnahme von fünf bis 10 Basisbildern wird eine Exozytose des leicht lösbaren Pools hervorgerufen, indem zwei Sekunden lang eine 30-Hertz-Stimulation abgegeben wird.

Nach der Aufnahme von weiteren 10 Bildern, evozieren Sie das synaptische Vesikel, die Exozytose des Reservepools mit drei Stimulationen von 40 Hertz für 10 Sekunden mit einem Intervall von 40 Sekunden zwischen den Stimulationen, und nehmen Sie weitere fünf bis 10 Bilder auf. Pausieren Sie dann die Bildaufnahme. Lassen Sie die Neuronen sich mindestens 20 Minuten lang erholen und wiederholen Sie dieses einphasige S-Protokoll erneut in S zweiphasig für das Kontrollexperiment.

Konvertieren Sie die Bilder für die Datenanalyse in einen Stapel. Passen Sie dann mit einer integrierten Bild-J-Funktion die Helligkeit und den Kontrast des Stapels an, um den Dynamikbereich zu maximieren, wenn eine erhebliche horizontale Abweichung aufgetreten ist. Führen Sie während des Experiments die Plug-ins stack reg und turbo reg auf Image J aus, um den Image-Stack auszurichten.

Dann Runtime Series Analyzer Plugin. Definieren Sie als Nächstes die interessierenden Regionen über mindestens 90 Nervenendigungen. Es ist hilfreich, zwischen den Bildern vor und nach der Entladung der Matrize zu wechseln, um aktive Nervenenden sichtbar zu machen.

Eine ideale Größe der interessierenden Region ist eine, die etwas größer ist als eine typische Nervenendigung. Ermitteln Sie dann die Gesamtfluoreszenzintensität jeder interessierenden Region im Zeitverlauf. Exportieren Sie danach nach Microsoft Excel.

Hier ist ein Flussdiagramm eines Kontrollexperiments zu sehen, bei dem Kleinhirn-Körnerneuronen mit 10 mikromolaren FM 1 43 unter Verwendung einer 10-Sekunden-Stimulation von 80 Hertz beladen wurden. Hier ist ein Bild, das Nervenenden zeigt, die mit FM 1 43 belastet sind. Hier ist das gleiche Bild, das 90 nummerierte Regionen von Interesse zeigt, die für die Analyse ausgewählt wurden, nachdem aktive Nervenendigungen identifiziert wurden, und dies sind die Bilder der Nervenendigungen zu ausgewählten Zeitpunkten.

Diese Bilder werden in Pseudofarbe dargestellt, um die Veränderungen der Fluoreszenz zu veranschaulichen, als die verschiedenen synaptischen Vesikelpools erschöpft waren. Zum Schluss sind hier die normierten Fluoreszenzeinheiten dieser 90 Nervenendigungen dargestellt. In S eins und S zwei Phasen kann der Fluoreszenzabfall jeder sequentiellen Stimulation gemessen und zwischen S eins und S zwei Phasen verglichen werden.

In diesem Kontrollexperiment ergaben sowohl S eins als auch S zwei die gleichen Größen des leicht freisetzbaren Pools und der Reservebecken. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wiederauffüllung und Mobilisierung spezifischer synaptischer Vesikelpools in den zentralen Nervenendigungen mit Hilfe von Lebensfluoreszenzbildgebungsverfahren quantifizieren können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Lebensfähigkeit und Reaktionsfähigkeit der Zellen zu bestätigen, indem die S eins-Kontrollexperimente durchgeführt werden, bevor die S zwei Versuchsbedingungen variiert werden.