Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auffüllung und Mobilisierung spezifischer synaptischer Vesikel-Pools in zentralen Nervenendigungen mittels Live-Fluoreszenz-Bildgebung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zwei Zyklen des synaptischen Vesikel-Recyclings unter Verwendung von FM-Farbstoffen in denselben Nervenendigungen überwacht werden, um valide interne Kontrollen zu erhalten. In einem zweiten Schritt werden der leicht freisetzbare Pool und der Reservetank nacheinander durch spezifische Entladeprotokolle erschöpft, wodurch die Quantifizierung der relativen Poolgrößen ermöglicht wird.

Als Nächstes ändern Sie entweder die Lade- oder Entladebedingungen, um den Effekt der gewählten Variation auf die Nachbildung oder Mobilisierung von synaptischen Vesikelpools zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Beladen verschiedener physikalischer synaptischer Pools mit FM-Farbstoff auf der Grundlage der Quantifizierung und Analyse der ausgelösten Farbstoffentladung reproduzierbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der flüchtigen Familie genetischer Reporter, besteht darin, dass mit dieser Technik gezielt die Nachbildung von Pools durch synaptische Vesikel verfolgt wird, die eine Endozytose durchlaufen haben.

Es ermöglicht außerdem eine genaue Quantifizierung. Da dieses Protokoll zweimal in denselben Nervenendigungen durchgeführt wird, bietet es eine interne Kontrolle. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der synaptischen CLE, Endozytose und Exozytose zu beantworten, beispielsweise wie die gezielte Beeinflussung bestimmter Endozytosewege die Wiederauffüllung sowohl des gesamten Recycling-Pools als auch der darin enthaltenen synaptischen CLE-Pools, wie des rasch wiederverwendbaren Pools und des Reservetanks, beeinflussen kann.

Der grundlegende experimentelle Aufbau sollte aus einem invertierten Epi-Fluoreszenzmikroskop, einer gekühlten CCD-Kamera, einer fluoreszierenden Lichtquelle, einer Gravitations-Perfusionsapparatur, einer Messkammer mit parallelen Platin-Elektroden und elektrischem Stimulator sowie einem Computer bestehen. Führen Sie die Experimente im Dunkeln oder unter Rotlichtbedingungen mit minimaler fluoreszenter Beleuchtung der Probe durch, um eine Bleiche der FM-Farbstoffe zu vermeiden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sieben Tage alte Sprague-Dawley-Rattenwelpen verwenden, um primäre Kulturen von Kleinhirn-Granulaneuronen herzustellen.

Nachdem die Kulturen vorbereitet wurden, plattieren Sie die Neuronen in der Mitte eines mit Poly-D-Lysin beschichteten 25-Millimeter-Deckgläschens in einem Tropfen. Fügen Sie nach einer Stunde, wenn der Tropfen einen Durchmesser von nicht mehr als sieben Millimetern aufweist, zwei Milliliter Kulturmedium zu den Neuronen hinzu. Legen Sie ein einzelnes Deckgläschen für 10 Minuten bei Raumtemperatur in die Salzlösung, um eine Stabilisierung im neuen Medium zu ermöglichen. Danach nehmen Sie das Deckgläschen heraus, trocknen die Unterseite sowie den Bereich um die angehefteten Zellen mit einem kleinen Stück Papiertuch oder saugfähigem Papier ab.

Verwenden Sie anschließend Silikonfett, um die Deckglasplatte an der Unterseite der Abbildungskammer zu befestigen. Die Zellen sollten sich zwischen den beiden parallelen Drähten befinden. Verwenden Sie ausreichend Silikonfett, um die Kammer vollständig abzudichten, ohne in die Mitte der Badkammer hineinzuragen.

Füllen Sie als Nächstes die Badkammer vorsichtig mit etwa 260 Mikrolitern Kochsalzlösung. Danach füllen Sie die Ein- und Ausgangsschläuche mit derselben Lösung. Verschließen Sie die Kammer, indem Sie einen sauberen Deckel mit Silikonfett an der Oberseite festkleben.

Danach entfernen Sie eventuelle Luftblasen, die in der Kammer mit dem Ein- und Ausgangsschlauch eingeschlossen sind. Anschließend fixieren Sie die Abbildungskammer auf einer Plattform aus rostfreiem Stahl. Überprüfen Sie auf Leckagen, indem Sie vorsichtig Kochsalzlösung durch den Zulaufschlauch strömen lassen.

Der nächste Schritt besteht darin, die montierte Kammer auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops zu befestigen. Die Einlassöffnung des Gravitations-Perfusionssystems mit Salzlösung vorfüllen und die Kammer mit dem Einlass verbinden. Anschließend die Verbindungsdrähte der Kammer mit dem elektrischen Stimulator anschließen.

Perfudieren Sie die Neuronen mit 1,5 Milliliter verdünnter FM-Farbstofflösung. Stimulieren Sie anschließend die Neuronen mithilfe des angeschlossenen Stimulators, um die Aufnahme des Farbstoffs zu bewirken. Nach der Stimulation perfundieren Sie die Neuronen zwei Minuten lang mit frischer Salzlösung, um überschüssigen FM-Farbstoff zu entfernen. Danach lassen Sie die Neuronen acht Minuten lang in der Salzlösung.

Suchen Sie derweil nach den axonalen Netzwerken, in denen die einzelnen mit FM D beladenen Nervenendigungen sichtbar sind. Verwenden Sie hierfür Fluorescein-Wellenlängen. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellhaufen.

Danach unmittelbar vor der Bildaufnahme das Bild erneut fokussieren, da während der Ruhephase eine leichte Drift aufgetreten sein könnte. Beginnen Sie mit der zeitraffenden Bildaufnahme mit einer Rate von einem Bild alle vier Sekunden. Nach Aufnahme von fünf bis zehn Basislinienbildern die Exozytose des leicht freisetzbaren Pools durch eine 30-Hertz-Reizung für zwei Sekunden auslösen.

Nachdem weitere 10 Bilder aufgenommen wurden, reizen Sie die synaptischen Vesikel durch drei Stimulationen von 40 Hertz für jeweils 10 Sekunden mit einem Intervall von 40 Sekunden zwischen den Stimulationen, um die exozytotische Freisetzung aus dem Reservetank auszulösen, und nehmen Sie anschließend weitere fünf bis 10 Bilder auf. Danach unterbrechen Sie die Bildaufnahme. Lassen Sie die Neuronen mindestens 20 Minuten lang regenerieren und wiederholen Sie diesen S-einen-Phasen-Protokollabschnitt erneut im S-zwei-Phasen-Abschnitt für das Kontrollexperiment.

Wandeln Sie die Bilder für die Datenanalyse in einen Stapel um. Verwenden Sie dazu eine integrierte Funktion von ImageJ, und passen Sie anschließend Helligkeit und Kontrast des Stapels an, um den Dynamikbereich zu maximieren, falls ein signifikanter horizontaler Drift aufgetreten ist. Führen Sie während des Experiments die Stack-Reg- und Turbo-Reg-Plugins in ImageJ aus, um den Bildstapel auszurichten.

Danach das Laufzeit-Serien-Analyse-Plugin. Anschließend definieren Sie die Regionen von Interesse über mindestens 90 Nervenendigungen. Es ist hilfreich, zwischen den Bildern vor und nach der Entlastung umzuschalten, um aktive Nervenendigungen sichtbar zu machen.

Eine ideale Größe des interessierenden Bereichs ist etwas größer als ein typisches Nervenendigungsgebiet. Anschließend ermitteln Sie die gesamte Fluoreszenzintensität jedes interessierenden Bereichs über die Zeit. Danach exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel.

Hier ist ein Flussdiagramm eines Kontrollexperiments dargestellt, bei dem zerebelläre Granulaneurone mit 10 Mikromolar FM 1 43 durch eine 80 Hertz, 10 Sekunden dauernde Stimulation beladen wurden. Hier sehen Sie ein Bild, das Nervenendigungen zeigt, die mit FM 1 43 beladen sind. Dieselbe Abbildung zeigt 90 nummerierte Regionen von Interesse, die nach Identifizierung aktiver Nervenendigungen für die Analyse ausgewählt wurden, sowie die Aufnahmen der Nervenendigungen zu den ausgewählten Zeitpunkten.

Diese Bilder sind in Pseudofarben dargestellt, um die Änderungen der Fluoreszenz zu veranschaulichen, während die verschiedenen Synaptischen Vesikel-Pools erschöpft wurden. Schließlich werden hier die normalisierten Fluoreszenzeinheiten dieser 90 Nervenendigungen gezeigt. In den Phasen S eins und S zwei kann der Fluoreszenzabfall jeder aufeinanderfolgenden Stimulation gemessen und zwischen den Phasen S eins und S zwei verglichen werden.

Bei diesem Kontrollexperiment führten sowohl S eins als auch S zwei zu gleichen Größen der leicht freisetzbaren und der Reservenpool. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Nachbildung und Mobilisierung spezifischer synaptischer Vesikel-Pools in zentralen Nervenendigungen mittels lebend-Fluoreszenz-Aufnahmetechniken quantifiziert werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellviabilität und -reaktivität zu bestätigen, indem die S-eins-Kontrollexperimente durchgeführt werden, bevor die S-zwei-Experimentbedingungen variiert werden.