A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Erzeugung dreidimensionaler Kulturen, die es pankreasähnlichen Vorläuferzellen ermöglichen, sich in Insulin exprimierende Kolonien zu differenzieren. Zunächst werden differenzierte Zellen, die aus einer neurogenen in drei EGFP-Knock-in-Maus-embryonalen Stammzelllinie stammen, dissoziiert und nach EGFP-Expression sortiert, um endokrinähnliche Vorläuferzellen anzureichern. Die EGFP-positiven sortierten Einzelzellen werden in ein halbfestes Medium, das Matrigel und Wachstumsfaktoren enthält, ausplattiert.

Dies begrenzt die Bewegung einzelner Vorläuferzellen, ermöglicht jedoch ihr Überleben, ihre Proliferation und Differenzierung in vitro. Anschließend wurden die Anzahl der entstandenen Kolonien mit charakteristischer Morphologie unter dem Mikroskop erfasst und ausgewertet, um die Frequenz koloniebildender Vorläuferzellen in einer gegebenen sortierten Population zu berechnen. Die Analyse einzelner Kolonien mittels Echtzeit-PCR und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt Insulinexpression in Kolonien, die von ngn3-positiven Zellen abstammen, jedoch nicht in solchen von NGN3-negativen Zellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Pankreas-Sphäroiden in Suspensionkultur besteht darin, dass mit ihr eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig auf ihre intrinsische Fähigkeit zur Koloniebildung durch Vorläuferzellen untersucht werden kann. Diese Methode kann helfen, Fragen zur Biologie von pankreatischen Stamm- und Vorläuferzellen zu beantworten, beispielsweise welche Marker Vorläuferzellen exprimieren und welche intrinsischen oder extrinsischen Faktoren für die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung und Differenzierung dieser Zellen wichtig sind. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik könnten sich auf die Therapie von Typ-1-Diabetes erstrecken, da, falls pankreatische Vorläuferzellen identifiziert und in betaähnliche Zellen differenziert werden können, diese Zellen dazu verwendet werden könnten, geschädigte Beta-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittenem Typ-1-Diabetes zu ersetzen.

Sie kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise zur Untersuchung der koloniebildenden Vorläuferzellen der postnatalen und adulten Bauchspeicheldrüse, des Knochenmarks, der Leber und der Milz. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik neu beginnen, Schwierigkeiten, da die Dissoziation der Zellen in eine Einzelzell-Suspension sowie das Handhaben von Matrigel und Methylcellulose bei der Vorbereitung der Applikation herausfordernd sein können. Ich hatte die Idee zu dieser Methode erstmals, als mir auffiel, dass es kein klonogenes Assay gab, um die Linienbeziehung zwischen Vorläuferzellen und ihren differenzierten Nachkommen aus der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen.

Eine solche Kolonieassay war in der Vergangenheit entscheidend für die Untersuchung hämatopoetischer Stammzellen und Vorläuferzellen. Ich erkenne die Notwendigkeit eines solchen Assays für die Erforschung der Biologie der pankreatischen Stammzellen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die halbfeste Mediumkomponente von Natur aus viskos ist und die Schritte zur Herstellung und Dosierung schwer zu erlernen sind.

Die Verfahren werden von Herrn Michael Winkler, einem Masterstudenten, Fräulein Nancy, einer Technikerin, und Dr. Lang Jing, einer Postdoktorandin aus einem Labor, demonstriert, um konditioniertes Medium für den später durchzuführenden Kolonieassay herzustellen. Neuronale ES-Zellen werden in vitro in pankreasähnliche Zellen differenziert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sechstagealte Embryoidkörper unter einem Lichtmikroskop untersuchen.

Mindestens 30 bis 40 % davon sollten einen Durchmesser von mindestens 150 Mikrometern aufweisen. Der größere Embryokörper sollte dunkle Flecken enthalten, die auf eine verstärkte Differenzierung hindeuten. Überführen Sie 80 bis 100 Embryokörper in jede Vertiefung einer sechswelligen Anbindungsplatte und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Embryokörper in die Zentren der Vertiefungen zu sammeln, wodurch die Zell-Zell-Kontakte erhöht werden.

Diese Kontakte führen zu einer besseren Entwicklung pankreasähnlicher Zellen aus Embryoidkörpern. Stellen Sie die Platten vorsichtig zurück in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in Kultur. Ein 13.

Ersetzen Sie das Medium durch frisches Anheftungskulturmedium, das Nicotinamid in vierfacher Konzentration und humanes rekombinantes aktives Inulin-Beta enthält, um die Differenzierung zu endokrinen Zellen zu induzieren. Danach kehren Sie die Kulturen in den Inkubator zurück. Tag 16 sammeln Sie das Medium ein und filtrieren es durch eine 0,2-Mikron-Polyethersulfat-Membran, um Zelltrümmer zu entfernen.

Ab diesem Zeitpunkt wird das gesammelte Medium als konditioniertes Medium bezeichnet. Aliquotieren Sie das konditionierte Medium in 15-Milliliter-Kegelröhrchen aus Polypropylen und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es kurz vor der Verwendung benötigt wird. Neurog3 ist ein Transkriptionsfaktor, der während der Entwicklung von pankreatischen endokrinen Vorläuferzellen exprimiert wird. Endokrine Vorläuferzellen, die Neurog3 exprimieren, differenzieren letztendlich zu pankreatischen Alpha-, Beta-, Delta-, Epsilon- und pankreatischen Polypeptid-exprimierenden Zellen. Um die Identifizierung von Zellen, die NGN3 exprimieren, zu erleichtern, wurde in einer Knock-in-Maus-ES-Zelllinie ein Allel des NGN3-Lokus durch das EGFP-Reportergen ersetzt. Die resultierende Zelllinie wurde als NGN3-EGFP bezeichnet. So wurden differenzierte NGN3-EGFP-positive und NGN3-EGFP-negative Zellen gewonnen.

Die Zellen werden am Tag 16 mittels Trypsin aus den Kulturschalen gelöst, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Die Zellklumpen werden mit Kollagenase B und DNase I inkubiert und durch ein Netz mit einer Porenweite von 40 oder 70 Mikrometern filtriert. Anschließend wird DPI zugegeben, und die Zellen werden in einem Zellsortierer nach vorwärts gerichteter Streuung (Vorwärtssstreulicht) und seitlicher Streuung (Seitenstreulicht) sortiert, die jeweils auf die Zellgröße und Granularität hinweisen, und dargestellt.

Ein Tor wird anschließend gezogen, um nicht-zellulären Trümmermaterialien auszuschließen. DPI wird verwendet, um tote Zellen zu unterscheiden, die positiv angefärbt werden. Bei Anregung bei 405 bis 413 Nanometern und Detektion der Emission mit einem 454/40-Filter wird die Pulsbreite des elektronischen Vorwärtsstreuimpulses zur Identifizierung von Doppelzellen herangezogen, die vor dem Durchlaufen des fluoreszenzaktivierten Zellsortier-Tors des EGFP-Kanals FL1 im Vergleich zur Autofluoreszenz ausgeschlossen werden sollten.

Unter Verwendung von Tag-16-Zellen einer kontrollierten Stammzelllinie, wie TL, die im linken Panel gezeigt wird, wird die echte Fluoreszenz sichtbar gemacht, sodass die NGN-drei-EEG-FP-positive Zellpopulation wie im rechten Panel zu sehen visualisiert werden kann. Das Sortiergatter für NGN-drei-EGFP-positive Zellen wird absichtlich nach rechts verschoben, wie hier durch den Pfeil angezeigt, um eine Kontamination mit NGN-drei-EEG-FP-negativen Zellen während der Sortierung zu begrenzen. Sobald die Gatter festgelegt sind, werden die NGN-drei-EEG-FP-positiven und die NGN-drei-EGFP-negativen Zellen sortiert und bis zur Verwendung zur Plattierung auf Eis gelagert.

Stellen Sie das Matri-Gel am Abend vor dem Experiment auf Eis bei vier Grad Celsius. Am Tag des Experiments stellen Sie jedoch die folgenden Reagenzien oder Lösungen auf Eis: D-M-E-M-F 12, 3,3 % Methylcellulose, konditioniertes Medium, FCS, Nicotinamid, XTEND in vier, VEGF A und rekombinantes humanes aktives In-Beta-B. Stellen Sie eine sterile Box mit 200-Mikroliter-Pipettenspitzen mindestens eine halbe Stunde vor Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius. Zur Vorbereitung des Ausplattierens der sortierten Zellen müssen zunächst die Komponenten des halbfesten Mediums in ein fünf Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen gegeben werden. Ziehen Sie zunächst mit einer 16,5-Gauge-Nadel eine kleine Menge der 3,3 %igen Methylcellulose-Lösung in eine Spritze.

Danach die Lösung sofort herausdrücken, um die Luft zu verdrängen. Dadurch wird der Totraum in der Spritze mit Lösung gefüllt, was eine korrekte Volumenmessung der halbfesten Lösung ermöglicht. Anschließend unter Vermeidung von Luftblasen das gewünschte Volumen der Methylcellulose-Lösung in ein 5-Milliliter-Gefäß aufziehen und abgeben.

Geben Sie das konditionierte Medium FCS Nicotinamid hinzu, das vier aktiv in Beta B, VEGF A und D-M-E-M-F 12 enthält. Verwenden Sie anschließend kalte Pipettenspitzen, um das Matrigel hinzuzufügen. Zuletzt geben Sie die gewünschte Menge sortierter Zellen in die fünf Milliliter-Röhre.

Geben Sie die Zellen immer zuletzt hinzu, um eine vorzeitige Stimulation der Zellen zu vermeiden. Verschließen Sie das Röhrchen anschließend fest und schütteln Sie die Röhrchen kräftig und gründlich von Hand. Da das Schütteln Luftblasen erzeugt, stellen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis oder bis die kleinen Luftblasen an die Oberfläche aufsteigen.

Unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze mit einer 18,5-Gauge-Nadel wird eine kleine Menge der halbfesten Nährboden-Zellmischung aufgezogen und anschließend sofort die Luft in der Spritze entlassen. Danach werden langsam 500 Mikroliter der halbfesten Zellmischung direkt in die Mitte jedes Wells einer 24-Well-Low-Attachment-Platte abgegeben. Jede Probe sollte in vierfacher Ausführung gepflanzt werden; lediglich die vier inneren Spalten der horizontal ausgerichteten 24-Well-Platte werden für die Kultur verwendet.

Füllen Sie die restlichen Vertiefungen mit sterilem Wasser, um die Befeuchtung der Zellkultur zu unterstützen. Unmittelbar nach dem Ansäen betrachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop.

Einzelne Zellen sind zufällig und gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Luft für acht bis 12 Tage. Nach der Inkubation für acht bis 12 Tage beobachten Sie die Zellen erneut unter dem Mikroskop.

Dies ist ein gutes Beispiel für gleichmäßig verteiltes Matrigel in der Kultur. Hier sehen Sie ein Beispiel für ungleichmäßig verteiltes Matri-Gel, das zu einem Apache-Framework führt. Kolonien wachsen nicht dort, wo kein Matri-Gel vorhanden ist.

Dies ist ein Beispiel für den Hintergrund der Vertiefung, bei dem kein Matrigel der halbfesten Medienmischung zugesetzt wurde. Um die resultierenden Kolonien zu zählen, befestigen Sie ein Gitter unter der Platte. Anschließend beobachten und zählen Sie die Kolonien mithilfe eines 10-fachen Objektivs. Aufgrund der dreidimensionalen Beschaffenheit des Mediums erscheinen die Kolonien in verschiedenen Fokusebenen.

Daher kann während der Beobachtung mittels Lichtmikroskopie eine Anpassung des Fokus für jede Kolonie erforderlich sein. Repräsentative Fotomikrografien von insulinexprimierenden Kolonien in halbfester Kultur nach acht bis zwölf Tagen sind hier dargestellt; die durch Pfeile markierten Kolonien sind zufällig verteilt und erscheinen als kleine, dunkle, nicht lichtreflektierende Aggregate mit einem Durchmesser von etwa 60 bis 100 Mikrometern. Anschließende mikrofluidische R-T-P-C-R-Analysen einzelner, manuell isolierter Kolonien zeigten die Expression von Insulin zwei und Glucagon, was mit unserer früheren Publikation übereinstimmt. Diese Ergebnisse belegen die Fähigkeit einzelner NGN drei EGFP-positiver Zellen, sich in Kolonien zu differenzieren, die gleichzeitig zwei Inselhormone enthalten und primitiven, erster Welle ähnlichen endokrinen Zellen ähneln. Die Proteinausprägung von C-Peptid, einem Marker für neu gebildetes Insulin, wurde mittels Ganzpräparat-Fluoreszenzfarbung bestätigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei Durchführung des Assays zur Bestimmung insulinexprimierender koloniebildender Einheiten, wie in diesem Bericht veranschaulicht, die Anzahl einzelner Vorläuferzellen, die in der Lage sind, Kolonien zu bilden, leicht bestimmt werden kann, wie hier und in unserer vorherigen Publikation gezeigt. Insulinexprimierende koloniebildende Einheiten können durch Sortierung von NGN3-EGFP-positiven, jedoch nicht von ngn3-EGFP-negativen Zellen, die aus Rine-ES-Zellen in vitro stammen, angereichert werden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von ein bis drei Stunden durchgeführt werden. Nach der Sortierung ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen vollständig in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren, alle Kulturbedingungen auf Eis zu halten, um die Verfestigung von Matrigel zu vermeiden, und die Zellen zuletzt zu den Röhrchen hinzuzufügen, um eine vorzeitige Stimulation der Zellen zu verhindern. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Einzelzell-Manipulation angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob eine einzelne Zelle ausreicht, um die Koloniebildung einzuleiten, nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik wird den Forschern auf dem Gebiet der Biologie der pankreatischen Stamm- und Vorläuferzellen den Weg ebnen. Sie ermöglicht es ihnen, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung in betaähnliche Zellen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den quantitativen Kolonieassay für insulinexprimierende koloniebildende Vorläuferzellen durchführt.