CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Hallo, mein Name ist Richard Lin und ich bin Forscher hier in der Gruppe von Professor TI Mercy in der Harvard MIT Division of Health Sciences and Technology. Das Projekt, an dem ich arbeite, ist die Quantifizierung und Erfassung von Zöliakie-4-positiven und C3-positiven T-Lymphozyten. Im Patienten ist Blut in ressourcenbegrenzten Umgebungen zu verwenden.

Direkt vor mir haben wir also ein Mikrofüllgerät, das aus PDMS besteht, nämlich Polymethylsloane. Das Gerät, der Kanal selbst, das High ist 50 Mikrometer hoch und das Gesamtvolumen im Gerät beträgt 10 Mikroliter. Dies ist also ein extrem präzises Gerät, mit dem wir T-Helfer-Lymphozyten einfangen werden.

Im Grunde genommen der diagnostische Maßstab für HIV-Patienten. Die Oberfläche des mikrofluidischen Geräts wurde also bereits mit Protein und CD 4-positiven Antikörpern in der Spritze präpariert. Im Moment haben wir nur biologischen PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 und werden diesen nun in den Kanal einfließen lassen, um den zusätzlichen CD-4-positiven Antikörper auszuspülen.

Zu diesem Zeitpunkt muss die Rate nicht kontrolliert werden, da wir nur versuchen, das zusätzliche Zeug auszuspülen, und es spielt keine Rolle, wie hoch unsere Rate ist. Das, das ist der Ort, an dem die Einlässe des Geräts sein werden, und das werden die Ausgänge zu unserer, zu meiner Linken und zu Ihrer Rechten hier sein. Jetzt werde ich die zusätzliche Antikörperlösung ausspülen, und wenn Sie aus dem Auslass bemerken können, dass die Flüssigkeit austritt, wissen Sie, dass dies eine sehr geringe Menge ist, aber wenn Sie genau hinsehen, können Sie sehen, dass die Luftflüssigkeit durch den Schlauch aus dem Kanal austritt.

Jetzt, da wir die zusätzliche Antikörperlösung ausgespült haben, können wir uns darauf vorbereiten, das Blut zu injizieren. Also werde ich jetzt den, den Schlauch aus dem Einlass ziehen. Jetzt öffnen wir eine neue Spritze für das Blut, menschliches Blut, Vollblut.

Es handelt sich also nicht um eine Patientenprobe, sondern um eine gesunde Probe, eine gesunde Probandenprobe, während wir uns darauf vorbereiten, das Blut in das mikrofluidische Gerät zu injizieren. Also befestigen wir die Spritze an der Spritzenpumpe. Jetzt schalten wir die Spritze ein und Sie können die Flussraten der Spritze sehen, und wir haben sie auf fünf Mikroliter pro Minute eingestellt.

Und wir werden uns jetzt im Grunde darauf vorbereiten, ins Blut zu spritzen. Wir werden die Spritzenpumpe vertikal platzieren, denn wie wir wissen, bilden die Blutzellen Sedimente, und wir wollen, dass die Zellen in den Kanal fließen. Also lass das Zellsediment lieber auf den Boden, der sich direkt in der Nähe unseres Schlauches befindet.

Jetzt ist also alles aufgebaut und es kann losgehen. Das Volumen meines Gerätes beträgt 10 Mikroliter pro 10 Mikroliter. Und das Volumen, das wir in die Kanalwand fließen lassen wollen, beträgt ebenfalls 10 Mikroliter.

Ich kann also sagen, ob ich genug Blut einströme, indem ich mir nur die Farbe des Kanals anschaue, wenn er ganz rot ist, dann weiß ich, dass ich 10 Mikroliter einströme, und ich sollte den Spritzenstoß stoppen. Jetzt drücke ich also einen Startknopf und es startet manchmal, manchmal dauert es eine Weile, bis das Blut tatsächlich in einen Kanal gelangt. Und das liegt zu einem großen Teil am Druck.

Wenn wir zum Beispiel die Spritze dort aufsetzten, zogen wir manchmal die Flüssigkeit zurück oder injizierten sie, um das Blut in der Schläuche anzupassen. Es kann also etwas dauern, es kann eine Weile dauern, aber sobald es anfängt, in einen Kanal zu pumpen, wird die Durchflussrate auf ly pro Minute eingestellt, was wir wollen. Wir sind hier vielleicht ein wenig geduldig und warten, manchmal muss man zwei Minuten, drei Minuten warten, bis das Blut anfängt, zu kanalisieren.

Eigentlich könnt ihr gerade sehen, dass das Blut anfängt, in den Kanal zu fließen. Man merkt dem Gerät also gerade an, dass es fast komplett vollgetankt ist. Okay, jetzt werden wir den Schlauch wieder auf PBS umstellen, um das Blut, das sich im Kanal befindet, auszuspülen.

Und um dies zu tun, wiederholen wir, was wir bereits getan haben, um die Schläuche zu entfernen. Da wir immer noch die Geschwindigkeit des Durchflusses des PBS steuern müssen, benötigen wir noch die Spritzenpumpe. Da wir jedoch kein Blut mehr fließen lassen, müssen wir die Spritzenpumpe nicht in vertikaler Position lassen, da sich keine Zellen im PBS befinden.

Jetzt sind wir also fertig und wir werden das Blut aus dem Gerät spülen und ich werde genau hier wieder den scharfen Knopf drücken. Wie Sie sehen können, fängt das Gerät an, sich zu entleeren. An den Rändern ist noch ein bisschen Blut, aber es verschwindet langsam.

Sobald also das gesamte Blut verschwunden ist, werden wir die Rate von fünf Mikrolitern pro Minute auf 20 Mikroliter pro Minute erhöhen. Und der Grund für diese Veränderung ist, dass es im Blut tatsächlich zwei Zelltypen gibt, die C-4-positive Antigene haben. Eines davon ist das, wonach wir gesucht haben, die T-Helfer-Lymphozyten.

Die andere sind die Monozyten, die wir nennen. Wir wollen sicherstellen, dass unser Gerät spezifisch nur die T-Helfer-Lymphozyten erfasst und nicht sowohl die T-Helfer-Lymphozyten als auch die Monozyten. Und die Methode, die wir anwenden, besteht darin, die Flussrate zu erhöhen, weil wir wissen, dass Monozyten größer sind als T-Helferzellen.

Durch die Erhöhung der Flussraten erfahren die größeren Monozyten also mehr Druck, die Oberfläche zu verlassen, als die vier positiven T-Helferzellen der CD. Jetzt sind es also ungefähr 20 Minuten. In meiner Hand liegt moment, es ist eine Lösung.

Es wird als Faxlizenzierungslösung bezeichnet. Der Zweck dabei ist es, rote Blutkörperchen zu reinigen. Überall dort, wo rote Blutkörperchen im Kanal verbleiben, wird diese Lösung sie verschließen.

Diese wird 10-, 10-fach aus der Stammlösung verdünnt. Was wir jetzt also tun werden, ist, den Spritzenpumper zu stoppen, den Schlauch zu entfernen und im Grunde die Lösung durch die aus dieser Spritze zu ersetzen. Also stoppe ich jetzt die Maschine, entferne den Schlauch, nehme diesen ab, nimm ihn mit dieser Spritze und ersetze ihn durch einen neuen.

Okay, jetzt, da ich alles eingerichtet habe, werden wir die Rate wieder auf fünf Mikroliter pro Minute senken. Wir klicken also auf die Rate von 20, verringern sie auf fünf und geben jetzt die Faxlizenzlösung für 20 Minuten ein. Und jetzt drücken wir auf Start.

Vor uns liegt also gerade ein optisches Bild des Geräts, das mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurde. Sie können also all diese weißen Punkte hier selbst erkennen. Wie können wir also sicherstellen, dass diese Zellen diejenigen sind, nach denen wir suchen?

Also verwenden wir ein paar verschiedene Färbungen, um sicherzustellen, dass die erste Färbung, die wir verwenden, das ist, was wir dpi nennen, alles, es färbt in DPI-Färbungen im Zellkern. Im Grunde genommen werden also alle Zellen mit einem Zellkern, wie z. B. weiße Blutkörperchen, die alle färben, während beispielsweise die roten Blutkörperchen, die keinen Kern haben, nicht gefärbt werden, und Sie können sagen, dass es überall auf dem Bild zu sehen ist. Sie sind all diese blauen Punkte und jeder einzelne mit blau.

ist eine Zelle. Der nächste Schritt besteht nun darin, zu überprüfen, ob die Zellen das sogenannte C-4-positive Antigen haben. Dies ist äußerst wichtig, da der gesamte Zweck unseres Geräts darin besteht, vier positive Zellen von C zu erfassen.

Der Fluoreszenz-Antikörper, den wir verwenden, ist natürlich C-4-spezifisch. Und gehen Sie zur nächsten Folie. In diesem Bild sind die Zellen viel dunkler, weil der, der fluoreszierende Antikörper, den wir normalerweise verwenden, für Fakten ist.

Die Verdünnung ist also viel höher. Aber wenn man ziemlich genau hinschaut, kann man immer noch erkennen, dass es immer noch Punkte gibt, die um diese Feldansicht herum verstreut sind. Sie sind ziemlich dunkel.

Aber bei näherer Betrachtung können wir sagen, dass diese Zellen in DC für positiv sind, was gut ist, denn das ist genau das, was wir wollen. Und der nächste Test ist, wie ich bereits erwähnt habe, dass es zwei verschiedene Arten von C-Vier-Positivzellen gibt. Die einen sind diejenigen, die wir als T-Helferzellen haben wollen, und die anderen sind die Monozyten, die wir nennen.

Wir brauchen also wieder einen weiteren fluoreszierenden Antikörper, um zwischen den beiden Zellen unterscheiden zu können. Wir wissen also, dass sie in T-Helfer-Lymphozyten sogenannte CD-3-positive Antigene haben. Bei Monozyten ist dies nicht der Fall.

Der nächste Antikörper, den wir verwenden, ist also CD-3-spezifisch, den wir in diesem Bild sehen werden. Auch hier kann man also erkennen, dass ihre Punkte um das Gerät herum verstreut sind, sie, die Punkte sehen größer aus, weil manchmal einige Zellen einfach heller leuchten, andere nicht so gut. Ich meine das, viele Dinge sind in diesem Fall dem Zufall überlassen, aber in den meisten Fällen sind diese Punkte in hellroten Punkten alle Zellen.

Also machen wir einfach wieder das, was wir wollen, denn erstens stellen wir sicher, dass unsere Zellen CD-4-positiv und CD-3-positiv sind. Also in diesem Fall kann man sagen, dass viele unserer Zellen in d CD drei positiv sind, was gut ist. Es gibt uns Spezifität in unserer Erfassung.

Die großen Dos, es könnte Müll sein, aber oft passiert manchmal, dass eine Zelle zufällig mehr CD 3 Flushes sammelt, CD drei auf sich selbst. In diesem Bild ist dies eine der Daten, die wir für dieses Mikrofluid-Gerät gesammelt haben, und es ist im Grunde ein Zelleinfang-Profi. In der vorherigen, wissen Sie, Folien, so weiter, können Sie sagen, dass es eine Menge Bilder mit Zellen darauf gab.

Aber worauf häufen sie sich wirklich an? Nun, sie akkumulieren sich zu einem Zellerfassungsprofil, in diesem Fall können wir auf der X-Achse den Abstand vom Einlass und auf der Y-Achse die Erfassungszellscheibe darstellen. Und Sie können sagen, dass Ihre Dichte im gesamten Gerät zunächst extrem hoch ist und dann langsam abnimmt, was wir erwarten würden, weil wir die C-vier-positiven und drei po-, C3-positiven Zellen aus dem Blutkreislauf einfangen und die Konzentration dieser Zellen in der Blutprobe verringern.

Und so werden unsere Daten im Grunde üblicherweise präsentiert.