Name: CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Lernen Sie die Erfassung von CD4+ T-Helferzellen mit einem PDMS-Mikrofluidik-Chip für HIV-Diagnostik in ressourcenarmen Gebieten. Diese präzise Methode ermöglicht eine effiziente Quantifizierung spezifischer Lymphozyten.

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<ol><li> Bereiten mikrofluidischen Kanal mit anti-CD4 + biotinlayted Oberfläche. </li><li> Injektion von 10 ml Probe Blut bei 5 ml / min in den mikrofluidischen Kanal mit Spritzenpumpe. </li><li> Spülen Sie das Blut bei 20 ml / min für 20 min mit PBS. </li><li> Inject verdünnt FACS Lyse-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5ul/min für 15 min. </li><li> Inkubation: 15 min. </li><li> Inject primären CD3 +-Antikörper-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5 ml / min für 20 min. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden. </li><li> Spülen Sie Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min. </li><li> Inject 20% AF488 CD4 +-Antikörper, 0,2% DAPI-Stammlösung und 10% sekundäre CD3 + Antikörper bei 5 ml / min für 20 min zur gleichen Zeit. </li><li> Inkubieren für 20 min. </li><li> Spülen Sie den Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min. </li><li> Zählen von Zellen unter Fluoreszenzmikroskop: <ol><li> White (optisch) - Schwarz und Weiß: Zell-und Staub </li><li> UV (DAPI) - Blue: Zelle nur </li><li> Blue (CD4 +) - Grün: T-Lymphozyten und Monozyten </li><li> Green (CD3 +) - Rot: T-Lymphozyten nur </li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>PDMS-Mikrokanal</td><td></td><td></td><td></td><td>Herstellung mittels SU-8-Form</td></tr><tr><td>Blut</td><td></td><td></td><td></td><td>Gespendetes Blut von gesunden menschlichen Probanden. Mass General Hospital, 10× hohe Leukozytenkonzentration oder Brigham and Women&amp;rsquo;s Hospital.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1× Dulbecco&amp;rsquo;s phosphatgepufferter Salzlösung.</td></tr><tr><td>FACS-Lyselösung</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt.</td></tr><tr><td>Anti-CD4+-Antikörper, biotinyliert</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>Oberfläche beschichtet mit biotinyliertem Anti-CD4+-Antikörper, nach Zugabe von 0,2 mg Stammlösung und 1 ml deionisiertem Wasser mit PBS/BSA auf 10 % verdünnt.</td></tr><tr><td>goat anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>Mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt</td></tr><tr><td>Kaninchen-anti-Ziege-IgG-PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>Sekundärantikörper für anti-CD3-Antikörper, mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt</td></tr><tr><td>anti-menschlicher CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Mit Alexa Fluor 488 markiert, mit PBS auf 20 % der Stammlösung verdünnt.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloridlösung, mit PBS auf 0,2 % der Stammlösung verdünnt.</td></tr></tbody></table>

cd4 + t-lymphozyten erfassen mit einem einweg-mikrofluidik-chip für hiv

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Hallo, mein Name ist Richard Lin und ich bin Forscher in der Gruppe von Professor TI Mercy in der Harvard-MIT-Abteilung für Gesundheitswissenschaften und Technologie. Das Projekt, an dem ich arbeite, zielt darauf ab, CD4-positive und C3-positive T-Lymphozyten in Patientenblut zu quantifizieren und nachzuweisen, um sie in ressourcenarmen Umgebungen einzusetzen.Gleich vor mir haben wir ein Microfill-Gerät, das aus PDMS besteht, also aus Polymethylsiloxan. Das Gerät, der Kanal selbst, ist 50 Mikrometer hoch, und das Gesamtvolumen des Geräts beträgt 10 Mikroliter. Dies ist also ein äußerst präzises Gerät, das wir verwenden werden, um T-Helfer-Lymphozyten zu erfassen.Im Grunde genommen das diagnostische Referenzverfahren für HIV-Patienten. Die Oberfläche des mikrofluidischen Geräts wurde bereits mit Protein und CD4-positiven Antikörpern in der Spritze präpariert. Derzeit befindet sich lediglich Puffer (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 in der Spritze, der nun durch den Kanal geleitet wird, um überschüssige CD4-positive Antikörper auszuspülen.In diesem Stadium muss die Fließgeschwindigkeit nicht kontrolliert werden, da wir lediglich versuchen, die überschüssigen Bestandteile auszuspülen, und es letztlich keine Rolle spielt, wie hoch unsere Geschwindigkeit ist. Hier befinden sich die Zulauföffnungen des Geräts, und hier werden die Ablauföffnungen sein, auf meiner linken und Ihrer rechten Seite. Nun werde ich die überschüssige Antikörperlösung ausspülen, und wenn Sie am Ablauf beobachten können, wie Flüssigkeit austritt, wissen Sie, dass es sich um eine sehr geringe Menge handelt, aber wenn Sie genau hinsehen, können Sie erkennen, dass Luft und Flüssigkeit aus dem Kanal durch die Schläuche austritt.Nun, da wir die überschüssige Antikörperlösung ausgespült haben, können wir uns darauf vorbereiten, das Blut einzuströmen. Ich werde nun den Schlauch vom Einlass abkoppeln. Jetzt öffnen wir eine neue Spritze für das Blut, menschliches Blut, Vollblut.Es handelt sich also nicht um eine Patientenprobe, sondern um eine Probe von einem gesunden Probanden, während wir uns darauf vorbereiten, das Blut in das mikrofluidische Gerät einzuspritzen. Wir werden die Spritze nun an die Spritzenpumpe anschließen. Jetzt schalten wir die Pumpe ein, und Sie können die Flussrate der Spritze sehen – wir haben sie auf fünf Mikroliter pro Minute eingestellt.Und nun bereiten wir uns im Grunde darauf vor, in das Blut zu injizieren. Wir stellen die Spritzenpumpe vertikal auf, da, wie wir wissen, die Blutzellen absedimentieren, und wir möchten, dass die Zellen in den Kanal fließen. So wird das Zellabsediment am Boden anreichern, direkt in der Nähe unserer Schlauchleitung.Jetzt ist alles bereit zum Start. Das Volumen meines Geräts beträgt 10 Mikroliter pro 10 Mikroliter. Und das Volumen, das wir in die Kanalwand fließen lassen möchten, beträgt ebenfalls 10 Mikroliter.So kann ich erkennen, ob ich genügend Blut eingeführt habe, indem ich einfach die Farbe des Kanals betrachte; wenn dieser vollständig rot und ausgefüllt ist, weiß ich, dass ich 10 Mikroliter eingeflößt habe und die Spritzenpumpe stoppen sollte. Nun drücke ich einen Startknopf, und das Gerät beginnt manchmal sofort, manchmal dauert es jedoch eine Weile, bis das Blut tatsächlich in den Kanal gelangt. Dies hängt größtenteils mit dem Druck zusammen.Beispielsweise, wenn wir die Spritze anbringen, entnehmen oder injizieren wir manchmal die Flüssigkeit entsprechend, um das Blut in der Leitung anzupassen. Es kann daher etwas dauern, aber sobald das Pumpen in einen Kanal beginnt, ist die Flussrate auf ly pro Minute eingestellt, was genau dem entspricht, was wir wollen. Daher müssen wir hier möglicherweise etwas Geduld aufbringen und warten; manchmal muss man etwa zwei oder drei Minuten warten, bis das Blut in den Kanal fließt.Eigentlich können Sie jetzt sehen, wie das Blut gerade dabei ist, in den Kanal einzutreten. Sie erkennen also, dass das Gerät fast vollständig gefüllt ist. Gut, jetzt wechseln wir das Schlauchsystem zurück auf PBS, um das Blut aus dem Kanal auszuspülen.Um dies zu erreichen, wiederholen wir das, was wir bereits zum Entfernen der Schläuche durchgeführt haben. Da wir weiterhin die Strömungsgeschwindigkeit des PBS kontrollieren müssen, benötigen wir weiterhin die Spritzenpumpe. Allerdings, da kein Blut mehr fließt, müssen wir die Spritzenpumpe nicht mehr in senkrechter Position belassen, da keine Zellen im PBS vorhanden sind.Jetzt sind wir bereit und spülen nun das Blut aus dem Gerät heraus, wozu ich hier erneut die Nadelspitze betätigen werde. Wie Sie sehen, beginnt das Gerät allmählich frei zu werden. An den Rändern befindet sich noch etwas Blut, das jedoch langsam verschwindet.Wenn das gesamte Blut entfernt ist, erhöhen wir die Rate von fünf Mikroliter pro Minute auf 20 Mikroliter pro Minute. Der Grund für diese Änderung liegt darin, dass im Blut tatsächlich zwei Zelltypen vorhanden sind, die C-vier-positive Antigene aufweisen. Einer davon ist das, wonach wir gesucht haben, nämlich die T-Helfer-Lymphozyten.Die andere Zellpopulation sind die Monozyten. Wir möchten sicherstellen, dass unser Gerät gezielt nur die T-Helfer-Lymphozyten erfasst und nicht sowohl die T-Helfer-Lymphozyten als auch die Monozyten. Die Methode, mit der wir dies erreichen, besteht darin, die Flussgeschwindigkeit zu erhöhen, da wir wissen, dass Monozyten größer sind als T-Helfer-Zellen.Wenn man die Flussraten erhöht, erfahren die größeren Monozyten einen stärkeren Druck, die Oberfläche zu verlassen, als die CD4-positiven T-Helferzellen. Jetzt befinden wir uns ungefähr in der 20. Minute. Was ich hier in der Hand halte, ist eine Lösung.Es handelt sich um eine Fax-Lizenzlösung. Der Zweck dieser Lösung besteht darin, rote Blutkörperchen zu lysieren. Wo immer also rote Blutkörperchen im Kanal verbleiben, wird diese Lösung sie lysieren.Dies wird 10-mal um jeweils den Faktor 10 von der Stammlösung verdünnt. Als Nächstes werden wir also die Spritzenpumpe anhalten, die Schläuche entfernen und im Grunde die Lösung durch die aus dieser Spritze ersetzen. Ich halte nun das Gerät an, entferne die Schläuche, nehme dies ab, nehme die Spritze hierzu, und ersetze sie durch eine neue.Okay, jetzt, da ich alles eingerichtet habe, werden wir die Flussrate wieder auf fünf Mikroliter pro Minute verringern. Wir klicken also die Rate von 20 und reduzieren sie auf fünf. Nun lassen wir 20 Minuten lang die Fax-Lizenz-Lösung fließen. Und jetzt drücken wir auf Start.Vor uns sehen wir gerade ein optisches Bild des Geräts, das mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurde. Man erkennt hier also all diese weißen Punkte. Wie können wir sicherstellen, dass es sich bei diesen Zellen um die gesuchten handelt?Daher verwenden wir mehrere verschiedene Färbungen, um sicherzustellen, dass die erste Färbung, die wir benutzen, die sogenannte dpi-Färbung ist, die den Zellkern anfärbt. Grundsätzlich werden also alle Zellen mit einem Kern, wie beispielsweise weiße Blutkörperchen, angefärbt, während rote Blutkörperchen, die keinen Kern besitzen, nicht angefärbt werden. Man erkennt dies daran, dass über das gesamte Bild verteilt zahlreiche blaue Punkte zu sehen sind, wobei jeder einzelne Punkt blau ist.ist eine Zelle. Der nächste Schritt besteht nun darin, zu überprüfen, ob die Zellen das sogenannte C4-positive Antigen aufweisen. Dies ist äußerst wichtig, da der gesamte Zweck unseres Geräts darin besteht, C4-positive Zellen zu erfassen.Der nächste fluoreszierende Antikörper, den wir verwenden, ist natürlich C4-spezifisch. Wechseln Sie zur nächsten Folie. In diesem Bild erscheinen die Zellen viel schwächer, da der verwendete fluoreszierende Antikörper gewöhnlich für FACS geeignet ist.Daher ist die Verdünnung viel höher. Doch wenn man genau hinsieht, erkennt man immer noch, dass sich zahlreiche Punkte in diesem Sichtfeld verteilen. Sie sind ziemlich schwach ausgeprägt.Doch bei genauerer Betrachtung erkennen wir, dass sich diese Zellen im DC für positiv befinden, was gut ist, da dies genau dem entspricht, was wir wollen. Und der nächste Test ist, wie ich bereits erwähnt habe, dass es zwei verschiedene Arten von C-vier-positiven Zellen gibt. Eine Art sind die gewünschten T-Helferzellen, die andere sind die sogenannten Monozyten.Daher benötigen wir erneut einen weiteren fluoreszierenden Antikörper, um zwischen den beiden Zelltypen zu unterscheiden. Wir wissen, dass T-Helfer-Lymphozyten sogenannte CD3-positive Antigene aufweisen, während Monocyten diese nicht besitzen.Der nächste Antikörper, den wir verwenden, ist CD3-spezifisch, was wir auf diesem Bild sehen werden. Auch hier erkennen Sie, dass die Punkte über das Gerät verteilt sind; die Punkte wirken größer, da manche Zellen einfach heller leuchten, andere weniger stark. Damit meine ich, dass in diesem Fall vieles dem Zufall unterliegt, aber in den meisten Fällen handelt es sich bei diesen hellroten Punkten um Zellen.Wir möchten also erneut sicherstellen, dass unsere Zellen CD4-positiv und CD3-positiv sind. In diesem Fall erkennen Sie, dass viele unserer Zellen CD3-positiv sind, was gut ist. Dies verleiht unserer Anreicherung eine gewisse Spezifität.Die große Menge, es könnte Abfall sein, aber häufig passiert es, dass eine Zelle zufällig mehr CD3-Ausprägungen, also CD3 auf ihrer Oberfläche, anreichert. In diesem Bild sehen wir eines der Datensätze, die wir für diese mikrofluidische Vorrichtung gesammelt haben, und es handelt sich im Wesentlichen um ein Zellfang-Protokoll. Im Gegensatz zu den vorherigen Folien und ähnlichen Darstellungen erkennen Sie hier deutlich viele Bilder mit Zellen darauf.Doch worauf sammeln sie sich letztendlich an? Nun, sie sammeln sich zu einem Zellaufnahmeprofil an, bei dem wir auf der X-Achse den Abstand vom Einlass und auf der Y-Achse die Zellaufnahmscheibe auftragen können. Und Sie erkennen, dass die Dichte innerhalb des Geräts zunächst sehr hoch ist und dann langsam abnimmt, was genau dem entspricht, was wir erwarten würden, da wir die C4-positiven und C3-positiven Zellen aus dem Blutstrom einfangen und die Konzentration dieser Zellen in der Blutprobe abnimmt.Und so werden unsere Daten gewöhnlich präsentiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

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Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

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