Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Dieser Videoartikel demonstriert eine Methode zur Visualisierung der autoimmunen Reaktion in der Haut von glutenempfindlichen Reeses Maccas mit Dermatitis herpetiformis. Dazu werden zunächst Tiere mit Dermatitis identifiziert, deren Erkrankung nicht auf andere, häufiger diagnostizierte Ursachen der Dermatitis zurückgeführt werden kann, sowie altersgematchte gesunde Kontrolltiere aus idiopathischen Fällen. Hautproben werden aus dem betroffenen Bereich entnommen, um die Gewebsarchitektur, Entzündungserscheinungen sowie das Vorhandensein von epidermaler Transglutaminase zu untersuchen.

Die gesammelten Proben von Autoantikörpern werden in Zinkformalin und 2 % Paraldehyd-Hämatin in EOSIN oder HNE fixiert. Anschließend erfolgt eine Färbung zur Beurteilung des Ausmaßes der Entzündung und der Histopathologie, und eine immunfluoreszierende Färbung wird durchgeführt, um die Ablagerung von Autoantikörpern gegen epidermale Transglutaminase in die tiefe Epidermis zu bewerten. Dermatitis herpetiformis ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die durch eine Autoimmunreaktion zwischen IgA und epidermaler Transglutaminase gekennzeichnet ist. DH entwickelt sich bei einem sehr geringen Anteil glutenempfindlicher Zöliakie-Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass sich DH ebenfalls bei einem kleinen Teil glutenempfindlicher Resus-Affen entwickeln kann.

Unsere Ergebnisse bestätigen die Gültigkeit des kürzlich entwickelten Resus Meac-Modells der Glutenempfindlichkeit, wie dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die klinischen Manifestationen dieses Zustands nicht nur auf den Dünndarm beschränkt sind. Ein typisches Protokoll umfasst ein Tier mit idiopathischer Dermatitis und eine altersentsprechende gesunde Kontrolle.

Nach geeigneter Anästhesie und Vorbereitung der Einstichstelle unter sterilen Bedingungen wird ein 4,0-Millimeter-Miltex-Stanzbiopsieinstrument mit leichtem Druck auf die Haut des Tieres aufgesetzt. Das Instrument wird um 180 Grad im und gegen den Uhrzeigersinn gedreht, bis die Stanzbiopsie die Hautschichten bis in das subkutane Gewebe durchtrennt. Wiederholen Sie den Vorgang für eine zweite Biopsie unter Verwendung einer Pinzette.

Fassen Sie den durchtrennten Hautabschnitt und lösen Sie ihn vom Unterhautgewebe. Legen Sie die erste Probe, die für die H-und-E-Färbung verarbeitet wird, in Zinkformalin. Anschließend geben Sie die zweite Probe, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht wird, in 2 % Paraformaldehyd, wobei eine Dreiviertel-Kreis-Schneidnadel mit drei Strich null Nylonnaht verwendet wird.

Schließen Sie den Hautdefekt im kreuzförmigen Muster. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um zwei bis drei Biopsieproben von jedem Tier zu gewinnen. Verabreichen Sie postoperative Analgesie, wie im schriftlichen Protokoll ausführlich beschrieben, um das Vorhandensein und die Lokalisation von IGA und TTG2 zu untersuchen.

Beginnen Sie mit der Inkubation der Proben, die zur Fixierung vier Stunden bei Raumtemperatur in 2% Formaldehyd gegeben wurden. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie mit PBS für 30 bis 60 Minuten auf einer Schüttelplattform. Wiederholen Sie dies zweimal, insgesamt drei Waschungen, dann entfernen Sie das PBS und ersetzen es durch 30% Saccharose für mindestens vier Stunden und bis zu zwei Wochen.

Als Nächstes wird die Probe in OCT-Einbettungsmedium gegeben und in ein Bad aus Methylethan und Trockeneis getaucht, bis das klare OCT vollständig gefroren ist und eine opak weiße Farbe annimmt. Anschließend werden die Probenblöcke mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Dadurch wird sichergestellt, dass das Gewebe vollständig durchgefroren ist, sodass es mit dem Messer geschnitten werden kann, ohne zerquetscht zu werden.

Das Gewebe kann langfristig in OCT bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Nach dem Schneiden und Aufbringen der Schnitte auf Objektträger entfernen Sie das OCT und permeabilisieren das Gewebe. Tauchen Sie die Objektträger in ein Copeland-Gefäß, das PBS mit 0,2 % Fischhautgelatine und 0,1 % Triton X-100 enthält.

Danach das Gefäß 20 Minuten lang auf einen Schüttler stellen; nach 20 Minuten die Objektträger 10 Minuten lang in PBS mit 0,2 % Fischhautgelatine waschen und anschließend 40 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer mit 10 % normalem Ziehenserum, das in PBS mit 0,2 % Fischhautgelatine verdünnt wurde, inkubieren. Die Objektträger jeweils separat eine Stunde lang mit den primären Antikörpern gegen Resus IGA und TTG zwei inkubieren. Danach den Objektträger an den Rändern haltend vorsichtig mit PBS-FSG Triton X-100 mittels einer Transferpipette besprühen.

Danach in ein Copeland-Gefäß mit demselben Puffer geben. Anschließend das Gefäß für 10 Minuten auf einen Wipper stellen. Den Waschschritt einmal wiederholen.

Anschließend eine Waschung mit P-B-S-F-S-G für 10 Minuten durchführen. Mit isotypspezifischen, mit Alexa floor markierten sekundären Antikörpern 40 Minuten inkubieren, nach der Inkubation. Die Objektträger wie zuvor waschen.

Anschießend fügen Sie den nukleären DNA-Farbstoff in ein Antifade-Montagemedium im Verdünnungsverhältnis 1:2000 hinzu. Geben Sie einen Tropfen des Mediums direkt auf jeden Objektträger. Anschließend legen Sie einen Deckglaser über das Gewebe und versiegeln ihn mit Nagellack.

Legen Sie den Objektträger im Dunkeln ab und lassen Sie ihn trocknen. Um die IGA- und TTG-Zweifachfärbung sichtbar zu machen, führen Sie die Bildgebung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durch, das mit den geeigneten Lasern für die verwendeten sekundären Antikörper ausgestattet ist, um die Auswertung des nicht markierten Gewebes aufzuzeichnen. Differenzialinterferenzkontrast, DIC-Bilder.

DIC ist ein Kanal im Mikroskop, der das Gewebe in Graustufen auflöst. Dadurch lässt sich die zelluläre Architektur besser bestimmen, um eine H&E-Färbung durchzuführen. Die Probe, die zuvor in Zinkformalin aufbewahrt wurde, wird zunächst in Paraffin eingebettet und anschließend in Schnitte auf Objektträger geschnitten.

Die Objektträger werden anschließend über Nacht bei 60 Grad Celsius erhitzt und in einen automatischen Färber eingelegt, der die Objektträger mit HNE färbt, sobald die Färbung abgeschlossen ist. Untersuchen Sie die gefärbten Biopsieproben unter einem Lichtmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, bei Vergrößerungen von Forex und 40x. Notieren Sie drei bis vier Bilder für jede Vergrößerung. Biopsieproben aus Hautläsionen von Reuss Maca wurden gewonnen und wie in diesem Video beschrieben gefärbt, um den Effekt des Entzugs von Gluten aus der Ernährung auf die Dermatitis hier zu untersuchen.

Die Leistenregion eines Makaken ist vor dem Entzug von Nahrungsweizenkleber dargestellt. Als dieses Tier auf eine weizenkleberfreie Diät umgestellt wurde, verschwand die Dermatitis und war nicht mehr nachweisbar, wie hier zu sehen ist. Die Dermatitis trat erneut auf, nachdem Nahrungsweizenkleber zur Beurteilung der Gewebearchitektur wieder eingeführt wurde.

Die H- und E-Färbung wurde vor dem Entzug von Gluten durchgeführt. Das Epithel war verdickt mit sieben bis 15 Schichten von Epithelzellen und einer dicken oberflächlichen Kruste aus hyperkeratotischen Zellen, die von degenerierenden Neutrophilen infiltriert war. Neutrophile traten auch innerhalb des Epithels auf und vermischten sich mit mäßigen Mengen an Lymphozyten, Plasmazellen und Histiocyten um die Anhängsel in der oberen Dermis nach dem Entzug von Nahrungs-Gluten für neun Wochen.

Einige Hyperkeratosen und verdicktes Epithel waren jedoch weiterhin vorhanden, allerdings nur mit minimaler lymphoplasmazellulärer Infiltration in der oberen Dermis im Vergleich. Hier wird normale Bauchhaut ohne Epithelverdickung und ohne lymphoplasmazelluläre Infiltration der oberen Dermis gezeigt. Konfokale Mikroskopiebilder derselben Maca-Hautbiopsien, die vor dem Entzug von Gluten aus der Nahrung entnommen wurden, zeigen die Kolokalisation von IgA, dargestellt in Grün, und tTG2, dargestellt in Rot, die sich im gelben Bereich um die Papillen der Dermis herum befindet und auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen epidermale Transglutaminase hinweist.

Der To pro drei nukleäre DNA-Marker ist nach neun Wochen glutenfreier Ernährung in blau dargestellt. IGA wurde innerhalb des Epithels nicht mehr beobachtet, was auf das Fehlen von Autoantikörpern gegen epidermale Transglutaminase hinweist, die gelb dargestellt wären. Einige subepitheliale IGA, A in grün dargestellt, waren weiterhin vorhanden; der To pro drei nukleäre DNA-Marker ist in blau in anderen Maccas dargestellt, einschließlich eines Tieres mit einer unabhängigen idiopathischen Dermatitis.

Autoantikörper wurden nicht nachgewiesen. Die IgA-Färbung ist grün, tTG-2 rot und der nukleare DNA-Marker TO-PRO-3 blau. Die tTG-2-positiven Zellen befinden sich innerhalb des Epithels.

Einige IGA-positive Zellen unterhalb des Epithels. Da keine umfangreiche spektrale Überlappung zwischen den roten und grünen Markern zu sehen ist, deutet dies auf das Fehlen von Autoantikörpern gegen die epidermale Transglutaminase hin. In dieser Studie verwenden wir die konfokale Mikroskopie, um das Vorhandensein von IGA-Autoantikörpern gegen die epidermale Transglutaminase sichtbar zu machen.

Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die meisten Fälle von Dermatitis nicht auf eine Glutenempfindlichkeit zurückzuführen sind. Daher müssen andere Methoden wie die Untersuchung von Serum, die Detektion von Anti-Gluten-, Anti-Gewebetransglutaminase-Antikörpern sowie eine sorgfältige klinische Beurteilung zuvor durchgeführt werden. Trotz der Häufigkeit von Dermatitis ist die Prävalenz der herpetiformen Dermatitis geringer als die der glutenempfindlichen Enteropathie.

Die Ergebnisse liefern eine Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten, unter der Annahme, dass zusätzliche Tiere mit diesem Zustand identifiziert werden.