Name: Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Guide-Screw-Methode zur intrakraniellen Xenotransplantation von Gliomzellen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht die sichere und effiziente Evaluation neuartiger therapeutischer Ansätze für Hirntumoren.

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Die Autoren bedanken sich bei Verlene Henry und Lindsay Holmes um Hilfe danke in der Entwicklung dieses Modells. Diese Arbeit wurde teilweise durch die James S. McDonnell Foundation (# 220020173) finanziert.

1. Zell-Linien <ol><li> U87MG Gliom-Zellen sind in großen Zellkulturflaschen mit DMEM-F12 mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert. </li><li> Die Zellen werden durch Waschflaschen zweimal mit warmem Phosphate geerntet Buffered Saline (PBS) und Inkubation bei 37 ° C für 5 Minuten mit 10 ml PBS mit 0,25% Trypsin und 0,05% EDTA. Sobald Zellen sind aufgehoben, sie in eine 50 ml Tube mit 10 ml von Kulturmedien und zentrifugiert (300 X g für 4 min) platziert werden. </li><li> Nach dem Waschen werden die Zellen bei einer Konzentration von 10 resuspendiert x 10 6 / ml in Kulturmedien, die für eine Impfung von 50.000 Zellen / 5 ul erlaubt. </li><li> Die Zellen werden auf Eis, bis intrakranieller Injektion gehalten. </li></ol> 2. Führungsschraube intrakraniellen Verschraubung Dieses Verfahren kann durchgeführt werden einige Tage vor der Injektion von Zellen. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. <ol><li> Mäuse (BALB / c nu / nu weiblich, 5-6 Wochen, ca. 18g) sind zum Zwecke der Identifizierung nummeriert, gewogen und anästhesiert mit einer intraperitonealen (ip) Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg). </li><li> Die Haut ist nach unten mit einer Jodlösung abgewischt und einen kleinen Schnitt (2-3 mm) ist auf der rechten Seite der Mittellinie und vor dem interauralen Linie gemacht. Dies macht die koronaren und sagittalen Naht des Schädels. Die Bregma liegt an der Kreuzung der beiden Nähte positioniert. </li><li> Die Führungsschraube Einstiegspunkt wird dann an einem Punkt, 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma markiert. Dieser Punkt befindet sich direkt oberhalb des Nucleus caudatus 1 befindet. </li><li> Ein 1 x 1 mm tiefes Loch wird mit einer sterilen Hand Spiralbohrer durch den Schädel an die Dura gebohrt. </li><li> Ein sterilisiert Führungsschraube, dass 1,6 mm unter der Oberfläche Schädel in die dura verlängern wird dann in das Loch mit einem Schraubendreher verschraubt, bis sie bündig mit dem Schädel (Abbildung 1A). </li><li> Eine sterile Stilett oder Schraube Dummy wird dann in die zentrale Bohrung der Führungsschraube platziert, um die Öffnung (Abbildung 1B) zu schließen. </li><li> Die Wunde wird mit Vetbond Gewebekleber (n-Butyl-Cyanoacrylat) und die Mäuse sind geschlossen eine intraperitoneale Injektion von Reversin (kleine Tiere) (0,1 ml / kg) und Carprofen (5 mg/kg/100 ul) zur Analgesie gegeben. Mäuse sind dann erlaubt, auf eine Erwärmung Matte (36 ° C), welche bis zu 20 Minuten zu erholen. Mäuse sind häufig kontrolliert und beobachtet während dieser Erholungszeit, bis sie bei vollem Bewusstsein sind. </li></ol> 3. Intrakranielle zellulären Transplantation <ol><li> Eine sterile gefesselt Hamilton-Spritze wird durch Anlegen eines kleinen Kunststoffring an der Nadelspitze so dass nur 2 mm von der Nadel unter die Führungsschraube Steckdose (Abbildung 1B) erweitern vorbereitet. Die letzte Impfung Punkt ist also 3,5 mm unterhalb der Kopfoberfläche. </li><li> Vier Tage nach der Führungsschraube Chirurgie, werden die Mäuse wieder betäubt wie oben (2,1) und einen kleinen Schnitt wird über die Führungsschraube gemacht, um das Stilett zu entfernen. </li><li> Die Handschellen Hamilton Spritze wird dann mit 5 ul gut gemischt Zellen unter vorsichtshalber nicht zu erstellen oder erstellen Luftblasen gefüllt. </li><li> Die Spritze wird die Perfusionspumpe gesichert und die Nadel in die Führungsschraube (Abbildung 1C) eingesetzt. Die Zellen werden dann mit einer Rate von 30 ul pro Stunde infundiert. </li><li> Die automatisierte Vorrichtung (Abbildung 1D) erlaubt es uns, spritzen bis zu 10 Tieren in einer Zeit auf einem konstanten Durchfluss. Zellen können auch manuell mit dem gefesselten Hamilton-Spritze injiziert werden oder alternativ die Spritze kann Handschellen durch einen 200 ul Pipettenspitze, die von 3 mm wurde beschnitten, damit die Nadelspitze, über die Führungsschraube von 2 mm zu erweitern. Die Injektion muss dann mit einer konstanten gleichmäßigen Tempo durchgeführt werden. </li><li> Wenn Infusion abgeschlossen ist, wird die Spritze vorsichtig entfernt und das Stilett in die Führungsschraube ersetzt. Die Wunde wird verklebt geschlossen und die Mäuse sind Erholung Medikamente wie zuvor (2,7) gegeben und man ließ sie auf einer Erwärmung Matte zu erholen. </li></ol> 4. Therapeutische Herausforderung <ol><li> Vier Tage nach dem U87MG Zellinokulation sind Mäuse gewogen und nach dem Zufallsprinzip in Kontroll-und Behandlungsgruppen aufgeteilt. </li><li> Die Kontrollgruppe ist eine intraperitoneale (ip) Injektion von PBS (100 ul) gegeben, während der Behandlungsgruppe eine IP-Injektion von AMG102 (100 ug in 100 ul PBS) gegeben ist. </li><li> Die Injektionen werden wiederholt jeden zweiten Tag für 14 Tage, insgesamt 6 Injektionen (Abbildung 2). </li><li> Nach der letzten Injektion werden die Mäuse täglich überwacht und wog jeden zweiten Tag. </li><li> Wenn Mäuse zu erheblichen neurologischen Störungen (Saldo Störungen, Lähmungen), Dehydrierung, oder mehr als 10% Gewichtsverlust oder sterbender Display begann, waren sie human eingeschläfert. Diese humane Endpunkt Tage waren dann auf der Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve aufgezeichnet. </li></ol> 5. Evaluation der therapeutischen Effizienz <li> Die Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve wurde unter Verwendung GraphPad Prism 4.03 für Windows; GraphPad Software, San Diego Kalifornien USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Todesfälle oder euthanizations wurden als Endpunkt Ereignissen geprägt und erzielte als 1. Tiere, die lebend am Ende des Experiments blieben als Nicht-Ereignisse aufgezeichnet und erzielte als 0 ist. </li> 6. Repräsentative Ergebnisse: Kontrolltiere begann Anzeichen von neurologischen Störungen und Gewichtsverlust 23 Tage nach der ersten Impfung von Zellen zeigen. Dies wurde deutlich in der AMG102 behandelten Gruppe um 35 Tage verzögert. In der Tat für Tag 35, 77% (n = 9.7) in der Kontrollgruppe waren eingeschläfert. Die Kaplan-Meier-Überlebensrate Kurve zeigt deutlich den signifikanten Anstieg im Überleben in Reaktion auf AMG102 Behandlung (Abbildung 3). Am Tag 70, hatten 88% der Kontroll-Mäusen eingeschläfert (n = 9.8) im Vergleich zu 37% (n = 8.3) von AMG102 behandelten Gruppe. Histologische Analyse der Gehirne bestätigt, dass alle 9 Tiere in der Kontrollgruppe entwickelten Tumoren nur 3 der 8 AMG102 behandelten Mäusen (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Bild (A) zeigt intrakraniellen Führungsschraube in einem Bereich unmittelbar oberhalb des Nucleus caudatus liegt positioniert. Die Handschellen Hamilton-Spritze (mit Zellen vorinstalliert) wird dann in der Führungsschraube platziert, so dass 2 mm der Nadel erstreckt sich über die Führung und die Zellen sind 3,5 mm innerhalb des Nucleus caudatus injiziert. Die Spritze wird später entfernt und durch ein Stilett (B) ersetzt. Die automatische Infusionsvorrichtung (C) injizieren können bis zu 10 Tiere auf einmal. Dargestellt sind fünf gleichzeitige Injektionen (D). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Studienprotokolls. Die Zellen wurden am Tag 0 mit der Behandlung beginnen am Tag 4 injiziert. Kontrolltiere erhielten eine Injektion von PBS (100 ul) IP während der Behandlung erhielten eine Injektion von AMG102 (100 g/100 ul) IP. Diese Injektionen wurden jeden zweiten Tag für 10 Tage. Es wurden insgesamt 6 Injektionen gegeben wurden. Die Tiere wurden dann für 70 Tage auf Anzeichen von neurologischen und körperlichen Störungen überwacht. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Kaplan-Meier Überlebenskurven verglichen Steuerung und AMG102 behandelten Mäuse. Signifikanten Überlebensvorteil war nach der Behandlung mit AMG102 (p = 0,005) erzielt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Mikrophotographien von koronalen Hirnschnitten demonstrieren Tumorentwicklung in den Kontroll-Tieren (A) und kein Gehirntumor Entwicklung in den AMG102 behandelten Tieren (B). Maßstabsbalken ist 1 mm.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von Amgen Inc. unterstützt

Die intrakranielle Führungsschraube hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Etablierung von intrakraniellen Xenotransplantate und in die Hände eines ausgebildeten Tier-Techniker, dieses Verfahren ist sehr einfach und ohne die Notwendigkeit eines stereotaktischen Gerät durchgeführt. Unsere Methode kombiniert die Verwendung einer Führungsschraube, um genau zu lokalisieren die Region des Gehirns am besten geeignet für in vivo Tumor-Entwicklung und eine automatisierte Infusionspumpe, die für die gleichzeitige Impfung von bis zu 10 Tiere auf einmal erlaubt. Die Führungsschraube Augmentation dauert weniger als 5 Minuten in Anspruch. Die automatisierte Infusion von Zellen bei 30 ul / h dauert nur 10 Minuten für eine 5 ul Volumen. Dies gewährleistet eine genaue Dosierung mit einer konstanten Rate und reduziert das Risiko der Zell-Ausstoß in die extrakraniellen Bereich aufgrund der erhöhten Hirndruck. Wir haben auch dieses Verfahren mit 10 ul durchgeführt und haben keine extra-kraniale Tumorwachstum durch zelluläre Rückfluss beobachtet. Da die automatisierten Infusionspumpe ermöglicht auch mehrere Tiere gleichzeitig geimpft werden wir spritzen bis zu 60 Tiere pro Stunde im Vergleich zu einem stereotaktischen Verfahren, das zu etwa 15 Tieren pro Stunde begrenzt ist. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die Lage des Führungsschraube in den Schädel als seine Position bestimmt der ultimative Ort der Tumormasse. Wenn die Führungsschraube ist zu zentral, die Zellen in einem Bereich zwischen den beiden Hirnhälften während, wenn die Führung zu weit nach vorne gebracht wird injiziert werden, werden die Zellen nicht in das Gehirn überhaupt injiziert werden. Es ist daher wichtig, so genau wie möglich bei der Suche nach der Führung 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma 1. In dieser Studie verwendeten wir einen Stahl Führungsschraube, obwohl aus Kunststoff Führungsschrauben auch für diejenigen Studien, die Bildgebung des Gehirns, wie MRT oder PET 6 erfordern. Auch wenn die automatisierte Infusionspumpe ist unerschwinglich für einige Gruppen, können die Zellen noch manuell schneller als stereotaktische Ansätze injiziert werden. Insgesamt kann diese schnelle, genaue und reproduzierbare Methode zur Gliom, Medulloblastom und Hirnstamm Tumoren 7 zu studieren. Dieses Verfahren hat bereits über 500 Mäusen zwischen unseren beiden Labors mit Todesfällen aufgrund von unerwarteten Narkose Reaktionen (&lt;1%) durchgeführt. Mäuse, die mit der Führung Schraube verschraubt wurden und anschließend infundiert mit Zellen nicht starben oder leiden alle neurologischen Komplikationen als Folge des Verfahrens. Tiere haben seit 100 Tagen ohne Komplikationen überstanden. Obwohl wir zu einer haarlosen Maus, einem immungeschwächten Maus mit Haaren wie die SCID verwenden bevorzugt wäre ebenso angemessen, sofern die Schädel Haar vor war es, die operativ entfernt, damit die Stelle sauber und die Haare stören Führungsschraube verhindern. Es gibt mehrere neuartige Therapeutika derzeit für die Behandlung von Gliomen 8-10 entwickelt. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die subkutane U87MG Gliom Xenotransplantate durch Behandlung mit AMG102 3 kann verhindert werden, ein humanisierter Antikörper, der zur HGF derzeit in der klinischen Evaluierung in Gliom 5. Wir verwendeten die Methode hier beschreiben, intrakranielle U87MG Tumoren im Gehirn von Nacktmäusen zu etablieren. Unsere Studie zeigt deutlich den Nutzen der Methode und zeigt, dass AMG102 deutlich hemmt das Wachstum von orthotopen U87MG Xenotransplantate. Wir werden auch weiterhin dieses Modell verwenden, um festzustellen, was andere Therapeutika in Kombination mit AMG102 verwendet werden, um effektivere Hemmung des Tumorwachstums zu erhalten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFBS </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c nu / nu-Mäusen </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schraubenhalter </td><td> Plastics One </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Bohrerhalter </td><td> Plastics One </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Bohrer </td><td> Plastics One </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Screw Guide (Metall) </td><td> Plastics One </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Screw Dummy (Stift) </td><td> Plastics One </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze (10 ul 26g fester Nadel) </td><td> Grace Division Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 Infusionspumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> Fakultativ </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo-Pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache anleitung screw verfahren zur intrakranielle xenograft studien an mäusen

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Die Transplantation von menschlichen Tumorzellen in das Gehirn von immunsupprimierten Mäusen ist eine etablierte Methode für die Untersuchung von Hirntumoren einschließlich Glioblastom (Gliom) und Medulloblastom. Die weit verbreitete stereotaktische Ansatz erlaubt nur für die Injektion von einem einzigen Tier zu einem Zeitpunkt, ist arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Geräte. Die Führungsschraube Methode, die ursprünglich von Lal et al., 1 entwickelt wurde entwickelt, um lästige stereotaktische Verfahren zu beseitigen. Wir beschreiben nun eine modifizierte Führungsschraube Ansatz, der eine schnelle und besonders sicher ist, welche beide kritische ethische Überlegungen. Bemerkenswert ist, unser Verfahren beinhaltet nun eine Infusionspumpe mit bis zu 10 Tiere gleichzeitig mit Tumorzellen injiziert werden. Zur Demonstration der Nützlichkeit dieses Verfahrens haben wir Menschen U87MG Gliomzellen als intrakranielle Xenotransplantate in Mäusen, die dann mit AMG102 behandelt wurden, ein vollständig humaner Antikörper, der zur HGF / Scatter-Faktor derzeit in der klinischen Evaluation 2-5. Systemische Injektion von AMG102 signifikant das Überleben von allen Mäusen mit intrakraniellen U87MG Xenotransplantate verlängert und führte zu einer Reihe von kompletten Heilung. Diese Studie zeigt, dass die Führungsschraube Methode ein kostengünstiges, hoch reproduzierbare Konzept für die Erarbeitung intrakraniellen Xenotransplantate ist. Darüber hinaus bietet es eine relevante physiologische Modell zur Validierung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Hirntumoren.

Um neue therapeutische Paradigmen für die Behandlung von Gliomen zu bewerten, sind physiologisch relevanten Modelle unerlässlich. Wir nutzen einen implantierbaren Führungsschraube Verfahren für die Einrichtung von intrakraniellen Xenograft-Modelle, schneller und sicherer als stereotaktische Ansätze ist.

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

Die Transplantation menschlicher Tumorzellen in das Gehirn immunsupprimierter Mäuse ist eine etablierte Methode zur Untersuchung von Hirntumoren, einschließlich des Glioblastoms ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein intrakranielles Transplantat eines Gehirntumors zu erzeugen, um die Wirksamkeit eines neuartigen therapeutischen Wirkstoffs zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Führungsschraube am Schädel befestigt und anschließend Zellen über diese Führungsschraube in das Gehirn infundiert werden. Im nächsten Schritt erfolgt eine therapeutische Behandlung, die auf die Tumorzellen abzielt, die sich im Gehirn etabliert haben.Die Tiere werden anschließend hinsichtlich therapeutischer Wirkungen durch die Auswertung von Überlebensraten überwacht. Letztendlich können therapeutische Wirkstoffe das Tumorwachstum und Überleben in den Behandlungsgruppen im Vergleich zu Kontrollen beeinflussen. Dieses Verfahren kann mehrere Tage vor der Zellinjektion durchgeführt werden.Beginnen Sie damit, die Mäuse zu wiegen und sie durch eine intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin zu anästhesieren. Sobald die Mäuse nicht mehr auf einen Zehenquetschreiz reagieren, bereiten Sie die Kopfhaut mit Jod vor und führen dann einen zwei bis drei Millimeter langen Schnitt entlang der rechten Seite der Mittellinie und vor der interoralen Linie durch. Dieser Schnitt legt die koronale und sagittale Naht des Schädels frei.Das bgma liegt an der Kreuzung dieser beiden Nähte. Markieren Sie den Einstiegspunkt für die Führungsschraube 0,2–0,5 Millimeter lateral und einen Millimeter anterior zum bgma. Dieser Punkt befindet sich direkt über dem CAU acht Kern.Nun an der Markierung mit einem handgeführten Bohrgerät ein Loch mit einer Tiefe von einem Millimeter in die Dura-Schraube bohren. Einen sterilisierten Führungsschraube in das Loch einsetzen, bis er bündig mit der Schädeloberfläche abschließt. Sicherstellen, dass der Vorschub der Schraube sofort gestoppt wird, sobald sie die Oberfläche des Schädels berührt.Wenn die Schraube in den Schädel eindringt, kann dieser brechen. Die Führungsschraube hält eine 1,6 Millimeter lange Nadel mit einem Durchmesser von 26 Gauge. Um die Öffnung der Führungsschraube zu verschließen, setzen Sie einen Stopfen oder eine Platzhalter-Schraube in die Führung ein.Schrauben Sie nun. Schließen Sie die Wunde, indem Sie die geschnittene Haut mit einer Pinzette zusammenhalten und mit einem Tropfen Vet-Bond verkleben, wobei der Kleber entlang der Schnittkante verteilt wird. Halten Sie die Haut einige Sekunden lang fest, bis sie haftet. Verabreichen Sie abschließend ein Analgetikum mit Wirkungsverlust und Carprofen durch intraperitoneale Injektion und lassen Sie die Mäuse auf einer Wärmematte auskurieren.Die Erholung kann bis zu 20 Minuten dauern. Für das Beispiel-Experiment wurden U-87-MG-Gliomzellen in großen Zellkultur-Flaschen mit D-MEM-F12, ergänzt mit 5 % fetalem Kälberserum, kultiviert. Dieser Abschnitt beschreibt, wie diese Zellen am Tag der Injektion auf die Injektion vorbereitet werden.Die Zellen gewinnen, indem man die Flasche zuerst zweimal mit warmer PBS spült. Anschließend 10 Milliliter PBS mit 0,25 % Trypsin und 0,05 % EDTA hinzufügen und die Zellen bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren oder bis sie sich gelöst haben. Danach die Zellen in 10 Milliliter Medium sammeln.Bringen Sie die Zellen auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop entsprechend der Zellzählung. Die 50-Milliliter-Konischflasche, die 10 Milliliter Kulturmedium mit Zellen enthält, wird bei 300 × g für vier Minuten zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren resuspendieren Sie die Zellen in Kulturmedium mit einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter. Bei dieser Konzentration enthält jedes Fünf-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension 50.000 Zellen, was für jede intrakranielle Injektion verwendet wird.Bewahren Sie die Zellsuspension für die Injektion auf Eis auf. Hier ist ein einzelnes Volumen an Zellsuspension erforderlich, da sich Fünf-Mikroliter-Volumina leicht verflüchtigen und dadurch die Zellen zerstört würden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Hamilton-Spritze mit Manschette.Befestigen Sie einen kleinen Kunststoffring an der Nadelspitze, sodass nur zwei Millimeter der Nadel unterhalb der Auslassöffnung der Führungsschraube herausragen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Inokulationspunkt 3,5 Millimeter tief liegt. Betäuben Sie zuvor augmentierte Mäuse und führen Sie einen kleinen Schnitt über der Führungsschraube durch. Schrauben Sie die Schraube fest und entfernen Sie den Stylet.Füllen Sie die Spritze anschließend mit fünf Mikrolitern der gut gemischten, auf Eis gelagerten Zellen. Achten Sie darauf, Luftblasen in der Spritze zu vermeiden, da diese eine Embolie oder ein Zurückfließen der Zellen aus der Injektionsstelle verursachen können. Befestigen Sie die Spritze am Perfusionspumpen und setzen Sie die Nadel in die Führungshülse ein.Schrauben Sie die Zellinfusion mit einer Geschwindigkeit von 30 Mikrolitern pro Stunde ein. Mithilfe der automatisierten Vorrichtung können bis zu 10 Tiere gleichzeitig mit einer konstanten Flussrate injiziert werden. Eine manuelle Injektion ist ebenfalls möglich, sofern sie mit einem konstanten, gleichmäßigen Tempo durchgeführt wird.Wenn die Infusion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Spritze vorsichtig und setzen Sie wie zuvor den Stylet in die Führungsschraube ein. Verschließen Sie die Wunde mit Vet Bond, verabreichen Sie Analgetika und lassen Sie die Mäuse ausreichend Zeit zur Erholung. Die Erholungsphase kann bis zu 20 Minuten dauern.Vier Tage nach der Injektion der U 87 mg-Zellen wurden die Mäuse gewogen und zufällig in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt eine intraperitoneale Injektion von 100 µL PBS, die Behandlungsgruppe eine Injektion von 100 µg pro 100 µL eines MG 1 0 2 ip. Die Injektion wurde im Abstand von zwei Tagen über 14 Tage wiederholt, insgesamt erfolgten sechs Injektionen.Nach der letzten Injektion wurden die Mäuse täglich überwacht und im Abstand von zwei Tagen gewogen. Der Endpunkt des Tieres wurde definiert als das Auftreten signifikanter neurologischer Funktionsstörungen wie Gleichgewichtsstörungen, Lähmungen, Dehydration, ein Gewichtsverlust von mehr als 10 % oder der Tod. Die Endpunkttage wurden als Kaplan-Meier-Überlebenskurven erfasst.Todesfälle oder Anrufe wurden als Endpunkte, Ereignisse, markiert und mit eins bewertet. Tiere, die am Ende des Experiments lebendig blieben, wurden als Nicht-Ereignisse erfasst und mit null als Kontrolle bewertet. Die Tiere zeigten 23 Tage nach der initialen Zellinokulation erste Anzeichen neurologischer Störungen und Gewichtsverlust.Dies war in der mit A MG 1 0 2 behandelten Gruppe signifikant verzögert. Bis zum Tag 35 waren 7 von neun Kontrolltieren euthanasiert worden. Bis zum Tag 78 waren 7 von neun Kontrolltieren euthanasiert worden, im Vergleich zu nur drei von acht Uhr morgens AM g 1 0 2 behandelten Tieren.Die histologische Analyse der Gehirne bestätigte, dass alle neun Tiere der Kontrollgruppe Tumore entwickelten, im Vergleich zu nur drei der um 8:00 Uhr morgens behandelten g 1 0 2-Mäuse.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur intrakraniellen Kanülenimplantation in einem Hirntumor-Mausmodell, um die Verabreichung eines Immuntherapeutikums zu erleichtern. Die Verabreichung von Glypican-2-spezifischen chimären Antigenrezeptor-T-Zellen in der Tumormikroumgebung löst die T-Zell-Aktivierung aus, was zu einer Tumorlyse und Tumorregression führt.

Intrakranielle Kanülenimplantation bei einer Maus zur Verabreichung von Therapeutika an Hirntumore

Quelle: Liou, C. et al. Intrazerebroventrikuläre Verabreichung von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm bei frei beweglichen Mäusen. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die intrakranielle Injektion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) in eine frei bewegliche Maus, um deren Auswirkungen auf das hirnvermittelte Verhalten zu untersuchen. Eine Injektorkanüle wird in eine Führungskanüle eingeführt, die in das Gehirn der Maus implantiert wird. Nach der Genesung akklimatisiert sich die Maus in...

Intrakranielle Injektion von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in einem Mausmodell

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Stammzellen sind vielversprechende therapeutische Träger, um Hirntumoren aufgrund ihrer intrinsischen Tumor-Tropismus zu behandeln. Nicht-invasive intranasale Stammzell-Abgabe umgeht die Blut-Hirn-Schranke und zeigt ein starkes Potenzial für die klinische Übersetzung. Dieser Artikel fasst die Grundprinzipien der intranasalen Stammzellabgabe in einem Mausmodell des Glioms zusammen.

Intranasale Abgabe von therapeutischen Stammzellen an Glioblastom in einem Mausmodell

Aus dem Darm stammende mikrobielle Metaboliten haben vielfältige Wirkungen, die zu komplexem Verhalten bei Tieren führen. Unser Ziel ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm im Gehirn über die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung über eine Führungskanüle zu beschreiben.

Intracerebroventrikuläre Abgabe von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in frei beweglichen Mäusen

Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) sind die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Kindern, und lokoregionäre immunbasierte Therapien werden zunehmend in klinischen Studien an Patienten getestet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur lokoregionären Kanülenimplantation bei Mäusen zur präklinischen Evaluierung von immuntherapeutischen Infusionen, die auf ZNS-Tumoren abzielen.

Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

Die Entwicklung von orthotopen pädiatrischen Hirntumormodellen erfordert akribische Präzision, bei der Krebszellen mit einem stereotaktischen Gerät präzise implantiert werden. Die hier vorgestellte Methodik beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Hirntumorzellen, der Durchführung intrakranieller Injektionen und der Implementierung eines postoperativen Überwachungssystems zur Beurteilung der Hirntumortransplantation.

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern eine hochgradig reproduzierbare Technik für intrakranielle Implantationen bereitzustellen.

Stereotaktische intrakranielle Implantation von Glioblastom-Patienten-abgeleiteten Xenograftzelllinien bei Mäusen

Erfahren Sie die Guide-Screw-Methode zur intrakraniellen Xenotransplantation von Gliomzellen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht die sichere und effiziente Evaluation neuartiger therapeutischer Ansätze für Hirntumoren.

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

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