Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, etwas über die Lentivirenverpackung zu lernen. Ein fünftägiges Protokoll. Am ersten Tag werden 293TN-Producerzellen mit einer berechneten Dichte ausplattiert.

Am zweiten Tag werden die Zellen mit dem gewünschten lenti-Vektor-Konstrukt, das das Gen von Interesse enthält, sowie mit einem viralen Verpackungsplasmid-Mix transfiziert. Am vierten Tag wird das Virus geerntet und durch Zugabe einer PEG-Virusfällungslösung konzentriert. Die letzten Schritte des Verfahrens umfassen das Sammeln des PEG-konzentrierten Virus, das Aliquotieren des Virus und die Infektion von Zellen mit dem konzentrierten Virus zur Bestimmung der viralen Titer.

Schließlich wird die quantitative PCR stabiler integrierter Gene verwendet, um die Anzahl stabiler integrierter Konstrukte zu berechnen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Plasmatransfektion oder der retroviralen Transduktion besteht darin, dass das optimierte Lentivirus-Verpackungsprotokoll von FBI Viren mit hoher infektiöser Titrierung erzeugt, die eine effiziente Übertragung in nahezu jede Säugetierzellart ermöglichen, einschließlich schwer zu transfectierender Zellen wie Stammzellen und nicht teilender primärer Zellen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ihnen die vertrautheit mit kleinen protokollspezifischen Details fehlt, die für die erfolgreiche Herstellung von Viren mit hoher Titrierung unerlässlich sind.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da die Zelldichte, die während der Transfektion unter dem Mikroskop sichtbar ist, die Effizienz der viralen Verpackung bestimmt, welche wiederum den endgültigen Virustiter beeinflusst. In Fällen, in denen die Expression eines geeigneten fluoreszierenden Reporters die Transfektionseffizienz bestimmt, hat dies eine erhebliche Auswirkung auf den endgültigen Virustiter. Zudem hilft die visuelle Demonstration der Methode Forschern, sich mit subtilen, aber wichtigen Aspekten des Protokolls vertraut zu machen, wie beispielsweise bewährte Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sterilität während des gesamten Prozesses und wie man vermeidet, Zelltrümmer in das gewonnene Virus einzubringen.

Die effiziente lentivirale Verpackung beruht auf drei Komponenten. Erstens muss der lentivirale Expressionsvektor einige der Elemente enthalten, die für die Virusverpackung und stabile Integration erforderlich sind, sowie Elemente zur Expression des Gens von Interesse, wie beispielsweise einen kurzen Haarnadel-RNA-, Mikro-RNA- oder Reporterkassette.

Zweitens müssen die lentiviralen Packaging-Plasmide die für das Verpacken einer RNA-Kopie des Expressionskonstrukts in rekombinante pseudovirale Partikel sowie für die anschließende Reverse Transkription und Virusintegration nach der Infektion essentiellen Proteine bereitstellen. Drittens müssen 293TN-Produktionszellen vorübergehend gemeinsam mit den Expressions- und Packaging-Vektoren transfiziert werden. Diese Zellen produzieren hochtitrige pseudovirale Partikel, die aus dem Kulturmedium gewonnen werden können.

Schließlich hängt der erfolgreiche Transduktionsgrad der Zielzellen in erster Linie von der Anzahl der Viruspartikel pro Zelle für einen gegebenen Zelltyp ab. Mit anderen Worten, die Multiplizität der Infektion beginnt damit, dass 293TN-Zellen in 15 cm Zellkulturschalen für 18 bis 24 Stunden kultiviert werden, um eine Konfluenz von 60 bis 80 % zu erreichen.

Zum Zeitpunkt der Transfektion liefert jede Platte etwa 14 Millionen Zellen, um die Virusausbeute zu erhöhen. Am nächsten Tag können mehrere Platten verwendet werden, wenn die 2 9 3 TN-Zellen 60 bis 80 % konfluent sind, sind sie bereit für die Transfektion. Geben Sie für jede Zellplatte 1,6 Milliliter serumfreies DMEM in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Fügen Sie dann 22,5 µg ppac H1 oder Ppac F1 und 4,5 µg Ihres Lentivektor-Konstrukts dem DMEM hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie anschließend 55 µL Pure Affection in dieselbe Röhre, wirbeln Sie 10 Sekunden lang und inkubieren Sie danach 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 15 Minuten geben Sie je eine Röhre in jede Kulturplatte.

Tröpfchenweise vorsichtig die Platte schwenken, anschließend die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach 48 Stunden die Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, falls der Lentivector ein fluoreszierendes Gen wie GFP exprimiert; eine erfolgreiche Transfektion führt zu 50 bis über 90 % grün fluoreszierenden Zellen. Nun das Zellkulturüberstand in einem 50-Milliliter-Kegelrohr sammeln. Der Überstand enthält die infektiösen pseudoviralen Partikel.

Zellen, die von der Platte gelöst werden, beeinträchtigen die Virusproduktion nicht negativ. Um Verunreinigungen zu entfernen, zentrifugieren Sie das virale Überstandmedium bei 1500 G für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln Sie anschließend das virale Überstandmedium, ohne das Pellet zu stören, und achten Sie darauf, einen Puffer von etwa 500 Mikrolitern Überstand zurückzulassen. Fahren Sie danach mit dem nächsten Schritt fort, der Konzentration der Viruspartikel 72 Stunden nach der Transfektion.

Eine optionale zweite Sammlung des viralen Überstandes kann mit derselben Technik durchgeführt werden, nachdem der virale Zustand gesammelt wurde. Konzentrieren Sie, indem Sie ein Volumen kalte PEG-Virusfällungslösung je vier Volumina Überstand in einem 50-Milliliter-Polypropylen-Zentrifagenröhrchen hinzufügen. Invertieren Sie das Röhrchen, um die Lösung zu mischen.

Verwenden Sie niemals einen Vortex und lagern Sie die Lösung anschließend bis zu 96 Stunden lang ohne Agitation bei vier Grad Celsius. Nach einer Mindestkühlzeit von 12 Stunden zentrifugieren Sie die Mischung 30 Minuten bei 1500 ×g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation erscheinen die mit Peggo präzipitierten lentiviralen Partikel als beige oder weiße Pellet am Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie nun vorsichtig sämtliche Flüssigkeitsreste durch sorgfältiges Absaugen, ohne die im Pellet abgefallenen Lentivirenpartikel zu stören. Alternativ entfernen Sie den größten Teil des Überstandes und resuspendieren das Pellet in dem verbleibenden Überstand. Überführen Sie die Suspension danach in eine sterile 2-Milliliter-Einwegzentrifugenrobe und zentrifugieren Sie das Gefäß zwei Minuten lang in einer kalten Mikrozentrifuge.

Bei 14.000 U/min den verbleibenden Überstand abpipettieren und das Lentivirus-Partikel-Pellet in eiskaltem, sterilem Puffer auf ein Zehntel bis ein Hundertstel des ursprünglichen Volumens resuspendieren. Das Pellet vorsichtig in die Lösung pipettieren, wobei keine Blasen entstehen dürfen, und es stets kalt halten. Sicherstellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist.

Schließlich Aliquote von 15 bis 25 Mikroliter der Ink in sterilen kryogenen Gefäßen auf Eis herstellen und die Gefäße bei minus 70 Grad Celsius lagern. Ein erfolgreicher Verpackungsansatz liefert 10 Millionen bis 1000 Millionen IFU pro Milliliter für die Virus-Transduktion in einer 24-Loch-Kulturplatte, 50.000 Zellen pro Loch, und über Nacht unter den spezifizierten Kulturbedingungen inkubieren. Für Titrierungszwecke sollten die Zellen eine Konfluenz zwischen 50 und 70 % aufweisen.

HT 10 80-Zellen können als leicht zu transduzierende Kontrollzelllinie verwendet werden. Am nächsten Tag aspirations das Medium von den Zellen ab. Anschließend kombinieren Sie das Kulturmedium mit der konzentrierten Duck-Lösung, sodass die Endkonzentration der Trans-Ducks 1 x beträgt. Geben Sie 0,5 Milliliter der transduzierten Lösung zu jeder Vertiefung mit Zielzellen in der korrekten Dichte von 50 bis 70 % Konfluenz hinzu. Fügen Sie jedem Brunnen die Viren in den folgenden Verdünnungen hinzu: 1:100, 1:10 und unverdünnt im Verhältnis 1:1.

Das Virus kann bis zu 72 Stunden in Kontakt mit den Zielzellen bleiben, ohne dass das Medium gewechselt wird. Nach 72 Stunden wird das Provirus stabil in das Wirtsgenom integriert sein und das Gen von Interesse exprimieren. Falls vorhanden, kann die Expression eines fluoreszierenden Markers verwendet werden, um die Transduktionseffizienz bei verschiedenen Virusverdünnungen abzuschätzen; anschließend lässt sich die Zahl infektiöser Einheiten mittels QPCR quantifizieren.

Wenn die Virus-Titrierung bekannt ist, berechnen Sie das geeignete Volumen des Virus, um die gewünschte Infektionsmultiplizität für andere Zielzellen zu erreichen. Die Bestimmung des Titers und die Kontrolle der MOI gewährleisten Konsistenz zwischen Experimenten und verschiedenen Viruspräparationen. Das Virus ist nun bereit für den Einsatz in weiteren Experimenten.

Die Startdichte der 293TN-Zellen war entscheidend für eine erfolgreiche virale Verpackung am Tag der Transfektion. Diese 293TN-Zellen befanden sich zwischen 60 und 80 % Konfluenz. 24 Stunden nach einer erfolgreichen Transfektion mit einem Lentivektor, der GFP exprimierte, zeigten mindestens 90 % der 293TN-Zellen grüne Fluoreszenz.

72 Stunden nach der Transduktion wurde GFP weiterhin in den Wirtszellen HT 10 80 exprimiert. Dies zeigt an, dass der Lentiviren-Konstrukt stabil in das Genom der Wirtszellen integriert wurde. Die Transduktion derselben Wirtszellen bei zehnfacher Verdünnung führte entsprechend zu einer verminderten Expression von GFP. Da das Verhältnis zwischen Virustiter und lentiviral vermittelter Genexpression direkt proportional ist.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von fünf Tagen bei etwa ein bis zwei Stunden pro Tag durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man funktional infektiöse Viruspartikel effizient und sicher verpackt sowie Zellen erfolgreich mit dem Virus transduziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem BSL-2-Zellkulturwerk notwendig sind.

Es sollte immer ein Laborkittel und Handschuhe getragen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.