Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mehr über lentivirale Verpackungen zu erfahren. Ein Fünf-Tage-Protokoll. Am ersten Tag, 2 9 3, werden TN-Produzentenzellen mit einer berechneten Dichte plattiert.

Am zweiten Tag werden die Zellen mit dem Lenti-Vektorkonstrukt der Wahl transfiziert, das das Gen of Interest und den Plasmidmix der Virusverpackung enthält. Am vierten Tag wird das Virusat geerntet und durch Zugabe von PEG-Virusfällungslösung konzentriert. Die letzten Schritte des Verfahrens bestehen darin, das konzentrierte PEG-Virus zu ernten, das Virus zu aliquotieren und die Zellen mit dem konzentrierten Virus für das Virustittern zu infizieren.

Letztendlich wird die quantitative PCR von stabil integrierten Genen verwendet, um die Anzahl der stabilen integrierten Konstrukte zu berechnen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Plasmatransfektion oder der retroviralen Transduktion besteht darin, dass das optimierte Lentivirus-Verpackungsprotokoll des FBI funktionell aktive Viren mit hohem Titer produziert, die eine effiziente Verabreichung in fast jede Säugetierzelle ermöglichen, einschließlich schwer zu transfizierender Zellen wie Stammzellen und sich nicht teilender Primärzellen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie mit den kleinen Protokolldetails nicht vertraut sind, die für eine erfolgreiche Produktion von Viren mit hohem Titer unerlässlich sind.

visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da die Zelldichte, die während der Transfektion durch ein Mikroskop sichtbar gemacht wird, die Effizienz der Virusverpackung bestimmt, die den endgültigen Virustiter bestimmt. In den Fällen, in denen dies möglich ist, bestimmt die Expression des fluoreszierenden Reporters die Effizienz der Transfektion, was einen signifikanten Einfluss auf den endgültigen Virustiter hat. Darüber hinaus ist die visuelle Demonstration dieser Methode hilfreich für Forscher, um sich mit subtilen, aber wichtigen Teilen des Protokolls vertraut zu machen, wie z. B. Best Practices zur Aufrechterhaltung der Sterilität während des gesamten Prozesses und wie man vermeiden kann, dass Zelltrümmer in das geerntete Virus aufgenommen werden.

Eine effiziente lentivirale Verpackung beruht auf drei Komponenten. Zunächst muss der lentivirale Expressionsvektor einige der Elemente enthalten, die für die Virusverpackung und stabile Integration erforderlich sind, sowie Elemente für die Expression des interessierenden Gens. Kurze Haarnadel, RNA, microRNA oder eine Reporterkassette.

Zweitens müssen die lentiviralen Verpackungsplasmide die Proteine liefern, die für das Verpacken einer RNA-Kopie des Expressionskonstrukts in rekombinante pseudovirale Partikel und die anschließende reverse Transkription und Virusintegration nach der Infektion unerlässlich sind. Drittens müssen 2 9 3 TN-Produzentenzellen transient mit den Expressions- und Verpackungsvektoren durchtrennt werden. Diese Zellen produzieren pseudovirale Partikel mit hohen Titern, die aus den Nährmedien gewonnen werden.

Letztendlich hängt die erfolgreiche Transduktion der Zielzellen hauptsächlich von der Anzahl der Viruspartikel pro Zelle für einen bestimmten Zelltyp ab. Mit anderen Worten, die Vielzahl der Infektionen beginnt mit dem Wachstum von 2 9 3 TN-Zellen. In 15 Zentimeter großen Zellkulturplatten für 18 bis 24 Stunden aufbewahren, um eine Co-Flüssigkeit von 60 bis 80 % zu erreichen.

Zum Zeitpunkt der Transfektion ergibt jede Platte etwa 14 Millionen Zellen, um die Virusausbeute zu erhöhen. Am nächsten Tag, wenn die 2 9 3 TN-Zellen zu 60 bis 80 % konfluent sind, können mehr als eine Platte verwendet werden, sie sind bereit für die Transfektion. Geben Sie für jede Zellplatte 1,6 Milliliter serumfreies DMEM in ein 15-Milliliter-Falkenröhrchen.

Geben Sie dann 22,5 Mikrogramm ppac H one oder Ppac F1 und 4,5 Mikrogramm Ihres lenti vector Construct in das DMEM und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren. Geben Sie dann 55 Mikroliter reine Zuneigung in dasselbe Röhrchen und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Geben Sie nach 15 Minuten ein Röhrchen in jede Kulturplatte.

Tropfenweise schwenken Sie dann die Platte vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen nach 48 Stunden 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Wenn das Lenti-Vektorkonstrukt ein fluoreszierendes Gen wie GFP exprimiert, überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, eine erfolgreiche Transfektion ergibt 50 bis mehr als 90% grün fluoreszierende Zellen sammeln nun den Zellkulturüberstand in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Der Überstand enthält die infektiösen pseudoviralen Partikel

Zellen, die von der Platte abgezogen werden, wirken sich nicht negativ auf die Virusproduktion aus. Zur Entfernung von Ablagerungen zentrifugiert die Zentrifuge den Virusüberstand bei 1500 G für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln Sie dann, ohne das Pellet zu stören, den Virusüberstand, wobei Sie darauf achten sollten, einen Puffer von etwa 500 Mikrolitern Überstand zu lassen, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, der darin besteht, die Viruspartikel 72 Stunden nach der Transfektion zu konzentrieren.

Eine optionale zweite Entnahme des viralen Supernats kann unter Verwendung der gleichen Technik erfolgen, nachdem das virale Sat entnommen wurde. Konzentriert durch Zugabe eines Volumens eiskalter Peg-Virusfällungslösung zu jeweils vier Volumina Überstand in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Drehen Sie die Lösung um, um sie zu mischen.

Verwenden Sie niemals einen Wirbel und lagern Sie die Lösung dann ohne Rühren bei vier Grad Celsius für bis zu 96 Stunden. Nach mindestens 12 Stunden Kühlzeit zentrifugieren Sie das Gemisch bei 1500 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation erscheinen die peggo-ausgefällten lentiviralen Partikel als beige oder weißes Pellet am Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie nun durch vorsichtiges Absaugen alle Flüssigkeitsspuren, ohne die ausgefällten lentiviralen Partikel im Pellet zu stören. Alternativ können Sie den größten Teil des Supra-Natins entfernen und das Pellet in das verbleibende Supinat resuspendieren. Dann geben Sie die Suspension in ein steriles Einor-Röhrchen mit zwei Millilitern und zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang in einem kalten Mikrofuge.

Bei 14.000 U/min pipettieren Sie den restlichen Überstand weg und resuspendieren das lentivirale Partikelpellet in eiskaltem, sterilem Puffer bei einem 10stel bis einem 100stel. Das ursprüngliche Volumen pipettiert das Pellet vorsichtig in die Lösung, ohne Blasen zu bilden, und hält es immer kalt. Stellen Sie sicher, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist.

Zum Schluss stellen Sie 15 bis 25 Mikroliter Aliquottinte her, sterile kryogene Fläschchen auf Eis und lagern Sie die Fläschchen bei minus 70 Grad Celsius. Ein erfolgreicher Verpackungslauf liefert 10 Millionen bis 1000 Millionen Gebrauchsanweisungen pro Milliliter für die Virustransduktion in einer 24-Well-Kulturplatte, 50.000 Zellen pro Well, und züchtet sie über Nacht unter ihren spezifizierten Kulturbedingungen. Die Zellen sollten zwischen 50 und 70 % konfluent sein, um die Transduktion zu Titterzwecken zu ermöglichen.

HT 10 80 Zellen können als einfach zu transduzierende Kontrollzelllinie verwendet werden, die am nächsten Tag das Medium aus den Zellen aspiriert. Kombinieren Sie dann das Nährmedium mit konzentrierter Entenlösung. Die Endkonzentration von Trans-Enten beträgt also eins x, fügen Sie einen halben Milliliter des transduzierten Virus in jede Vertiefung mit Zielzellen mit der richtigen Dichte von 50 bis 70 % Co-Flüssigkeit hinzu, fügen Sie das Virus in jeder Vertiefung in den folgenden Verdünnungen hinzu, eins bis 100, eins bis 10 und direkt eins zu eins Verdünnung.

Das Virus kann bis zu 72 Stunden lang in Kontakt mit den Zielzellen bleiben, ohne das Medium zu wechseln. Nach 72 Stunden hat sich das Provirus stabil in das Wirtsgenom integriert und exprimiert das Gen von Interesse. Wenn die vorhandene Fluoreszenzmarkerexpression zur Abschätzung der Transduktionseffizienz bei verschiedenen Virusverdünnungen verwendet werden kann, kann die Anzahl der infektiösen Einheiten mittels QPCR quantifiziert werden.

Sobald der Virustiter bekannt ist, berechnen Sie das geeignete Virusvolumen, um die gewünschte Infektionsvielfalt für andere Zielzellen zu erreichen. Die Messung des Titers und die Kontrolle des MOI gewährleisten die Konsistenz zwischen den Experimenten und den verschiedenen viralen Präparaten. Das Virus ist nun bereit für den Einsatz in weiteren Experimenten.

Die Ausgangsdichte der 2 9 3 TN-Zellen war entscheidend für eine erfolgreiche Virusverpackung am Tag der Transfektion. Diese 2 9 3 TN-Zellen waren zwischen 60 und 80 % konfluent. 24 Stunden nach einer erfolgreichen Transfektion mit einem Lenti-Vektor, der GFP exprimiert, zeigte sich, dass mindestens 90% der 2 9 3 TN-Zellen eine grüne Fluoreszenz zeigten.

72 Stunden nach der Transduktion setzte sich die GFP-Expression in den HT 10 80 Wirtszellen fort. Dies deutet darauf hin, dass das lentivirale Konstrukt, das stabil in das Wirtsgenom integriert ist und dieselben Wirtszellen bei zehnfacher Verdünnung transduziert, die Expression von GFP proportional verringert. Denn die Beziehung zwischen viralem Titer und lentiviral vermittelter Genexpression ist direkt proportional.

Einmal gemeistert, kann diese Technik über einen Zeitraum von fünf Tagen mit etwa ein bis zwei Stunden pro Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie funktionell infektiöse Viruspartikel effizient und sicher verpacken und erfolgreich Zellen mit dem Virus transduzieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in der BSL-Zweigewebekulturhaube.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Laborkittel und Handschuhe getragen werden.