Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung ausgewählter Einzelzellen in Zebrafischembryonen durchzuführen. Dies wird durch die chemische Konjugation von Fluorescein im Käfig mit Dextran mit hohem Molekulargewicht erreicht. Als nächstes wird das vorbereitete Käfig-Fluorescein-Dextran in Zebrafischembryonen mikroinjiziert, das dann in ausgewählten Zellen mittels Zwei-Photonen-Absorption photoaktiviert wird.

Nach der Photoaktivierung der Embryonen wird eine immunhistochemische Analyse durchgeführt, um das nicht eingesperrte Fluorescein-Dextran zu detektieren und die aktivierten Zellen zu kartieren. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um den Abstammungsbeitrag und die Gewebelokalisation der photoaktivierten Einzelzellen zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Standard-Fluoreszenzmikroskopie, besteht darin, dass sie zur differentiellen Markierung einzelner Zellen für die Glaubenskartierung verwendet werden kann.

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie undifferenzierte Vorläuferzellen zu verschiedenen Gewebetypen beitragen können. Die visuelle Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Embryonalbestückung und Photoaktivierung allein anhand der Textbeschreibung schwer zu erlernen sind. Bevor Sie beginnen, synthetisieren Sie Fluorescein-Dextran in Käfigen und lagern Sie es in mit Metallfolie überzogenen Röhrchen. Dann injizieren Sie Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium mit dem synthetisierten Käfigfluorescein Dextran.

Nachdem die Embryonen das entsprechende Entwicklungsstadium erreicht haben, beschichten Sie sie. Montieren Sie dann die beschichteten Embryonen zur Fotoaktivierung in niedrigschmelzende Aeros. Wenn sich die entstandene Last verfestigt hat, lädt die LSM five 10 Software.

Platzieren Sie einen transparenten Gelbfilter im weißen Lichtstrahlengang, wählen Sie dann Neues Bild scannen und klicken Sie auf Expertenmodus starten. Wählen Sie die Registerkarte Laser, schalten Sie das Argon-Eisen und die Mi Tai-Laserquellen ein. Stellen Sie die Mi Tai-Wellenlänge auf sieben 40 Nanometer ein.

Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte "Konfiguration" aus. Legen Sie die Konfigurationen des optischen Pfads für das Argonnen-Ion und den Mi-Tai-Laser fest. Wählen Sie dann die Registerkarte "Scannen" aus.

Ändere das Ziel auf 20 mal 0,8. Stellen Sie die maximale Scangeschwindigkeit ein, indem Sie auf max set mode method und number to line mean (Modusmethode und Anzahl auf Zeilenmittelwert festlegen) klicken bzw. auf der Registerkarte Kanäle alle Laserquellen außer dem Mi Tai abwählen. Platzieren Sie als Nächstes einen Leistungsmesser im optischen Strahlengang und wählen Sie dann die con-Taste, um die kontinuierliche Abtastung zu aktivieren.

Passen Sie den Übertragungsprozentsatz an, bis der Leistungsmesser eine durchschnittliche Laserleistung von 47 Milliwatt anzeigt. Stoppen Sie dann den Scan, indem Sie auf der Registerkarte Kanäle auf die Schaltfläche Stopp klicken. Deaktivieren Sie die Mi-Tai-Laserquelle und wählen Sie das Argonneneisen

Wählen Sie dann unter dem Reiter Kanäle erneut die schnelle XY-Taste und stellen Sie die Lochblende ein. Erkennen Sie die Verstärkung, verstärken Sie einen Offset und verstärken Sie erneut, damit der Argonnen-Eisenlaser die beste Bildqualität erzielt. Suchen Sie mit dem Bühnenregler die zu aktivierende Zelle und fokussieren Sie darauf, und klicken Sie dann auf die Stopp-Schaltfläche. Schneiden Sie mit dem Zuschneidewerkzeug die aktivierte Zelle so zu, dass der Zuschnittsfaktor auf der Registerkarte "Modus" 50 bis 70 anzeigt.

Stoppen Sie dann den Scan, indem Sie die Stopp-Taste auf der Registerkarte Kanäle auswählen. Deaktivieren Sie den Argonnen-Ionenlaser und wählen Sie auf der Registerkarte Modus den My Tai-Laser aus. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 31,46 Sekunden ein.

Wählen Sie dann die einzelne Taste, um den Scan für die Zwei-Photonen-Aktivierung des eingesperrten Fluorescein-Dextrans der ausgewählten Zelle zu starten. Gehen Sie nach der Aktivierung auf die Registerkarte Kanäle und deaktivieren Sie nun den Mi-Tai-Laser und wählen Sie den Argon-Ionen-Laser erneut aus. Stellen Sie dann unter Modus den Zoomfaktor auf eins ein. Nächster.

Klicken Sie unter der Überschrift Geschwindigkeit auf die Schaltfläche Max, um die schnellste Scangeschwindigkeit festzulegen. Um den für das Foto aktivierten Bereich zu überprüfen, wählen Sie "Schnelles XY". Wählen Sie dann die Registerkarte Kanäle und passen Sie die Lochblende an und erkennen Sie erneut, überprüfen Sie, ob der fotoaktivierte Bereich nicht laserabliert ist.

Nach der Vorbereitung der photoaktivierten Embryonen für den Nachweis des Fluorescein-Dextran-Immunnachweises ohne Käfig gemäß dem im begleitenden Manuskript beschriebenen Protokoll. Waschen Sie die Embryonen sechsmal in PBT und zweimal in AP-Puffer. Übertragen Sie dann die Embryonen auf neun Well-Platten in AP-Puffer.

Aspirieren Sie als Nächstes den AP-Puffer und fügen Sie N-B-T-B-C-I-P hinzu. Stoppen Sie die Entwicklung des N-B-T-B-C-I-P-Flecks, indem Sie die N-B-T-B-C-I-P-Lösung aspirieren. Waschen Sie dann die Embryonen in PBT.

Entnehmen Sie nun die Embryonen und schütteln Sie sie auf einer rotierenden Plattform für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann das Waschen PBT noch zwei weitere Male. Montieren Sie schließlich die Embryonen in 0,6 % niedrig schmelzende Aros und nehmen Sie Bilder der lichtaktivierten Zellen mit einem aufrechten Verbundmikroskop auf.

In dieser Abbildung ist ein Hellfeldbild auf der linken Seite und ein Fluoreszenzbild auf der rechten Seite eines im Käfig gezeigten Fluoreszein-Dex-Strangs zu sehen, der vor der Photoaktivierung mikroinjiziert wurde. Wie hier gezeigt, wurde der Embryo in einem der Somiten, die durch den Pfeil in der linken Hellfeldfigur angezeigt werden, mit einer Wellenlänge von sieben 40 Nanometern, einer Scanzeit von 31 Sekunden und einer durchschnittlichen Laserleistung von 47 Milliwatt photoaktiviert. In der Abbildung rechts ist die Fluoreszenz nach der Photoaktivierung aus dem nicht eingesperrten Fluorescein-Dextran zu sehen.

Die Immunfärbung von Fluorescein-Dextran ohne Käfig ist in einer kleinen Region in der lateralen Platte, Mesoderm von a 10, dargestellt. Der Embryo im Milbenstadium wurde also mit den gleichen Laserparametern wie in der vorherigen Abbildung mit dem Immunnachweisverfahren photoaktiviert. Der aktivierte Bereich, wie er hier durch den Pfeil angedeutet ist, kann mit minimaler Hintergrundfärbung identifiziert werden. Nach diesem Verfahren kann er identifiziert werden.

Zusätzliche Analysen, wie z.B. Immunfärbungen für verschiedene gewebespezifische Marker, können durchgeführt werden, um den Standort und das Schicksal der markierten Zellen besser zu charakterisieren. Mit dieser Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Gefäßbiologie der Weg geebnet, um den Ursprung von arteriellen Vorläuferzellen in venösen Vorläuferzellen bei der Entwicklung von Zebrafischembryonen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit chemischen Reagenzien wie NBT und BCIP diese äußerst gefährlich sein können und immer Handschuhe getragen werden sollten.