Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dynamische Veränderungen im Aktin-Zytoskelett lebender endothelialer Zellen zu beobachten. Transfizieren Sie zunächst humane Nabelvenenendothelzellen mit einem GFP-Beta-Aktin-Plasmid und kultivieren Sie diese bis zur Konfluenz auf Deckgläsern. Anschließend bringen Sie die Deckgläser in eine Live-Cell-Imaging-Kammer mit beheiztem Objektträger und infundieren eine physiologische Albuminlösung.

Der letzte Schritt besteht in der Datenerfassung eines ausgewählten Zellbereichs mittels zeitraffender Bildaufnahme vor und nach der Behandlung mit einem pharmakologischen Wirkstoff. Eine Chime-Graph-Analyse mit Bildverarbeitungssoftware wie Image J kann Einblicke in lokale Lamellipodien-Ausstülpungen geben, beispielsweise hinsichtlich Distanz, Zeit und Geschwindigkeit der Ausstülpungen sowie der Bewegung aktinreicher Fasern über die Zeit. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunfluoreszenz-Bildgebung liegt darin, dass die Live-Cell-Bildgebung die dynamische Natur des Aktin-Zytoskeletts in Untersuchungen der Mechanismen, die die endotheliale Permeabilität bestimmen, berücksichtigt.

Während fixierte gefärbte Zellen Momentaufnahmen darstellen und nur geringe Informationen über die Dynamik des Aktins und des Cytoskeletts vor und nach der Behandlung mit einem entzündungsfördernden Mediator in einer biologischen Sicherheitswerkbank liefern, sterilisieren Sie Deckgläser mit 70 %igem Ethanol für zwei Minuten und lassen Sie sie anschließend lufttrocknen. Geben Sie jedes Deckglas in eine 10 cm große Kulturplatte und fügen Sie 300 Mikroliter warme Gelatine-Lösung in die Mitte hinzu, ohne die Ränder des Deckglases zu berühren. Nach fünf Minuten saugen Sie die Flüssigkeit ab.

Entnehme nun eine konfluente Kultur humaner Nabelvenenendothelzellen oder VE mit 0,25 % Trypsin-EDTA. Zähle die Zellen und pelletiere sie durch Zentrifugation. Aspiriere so viel wie möglich vom SUP natum-Medium, um eine Transfektionsreaktion mit dem VE-Nuklear-Effektor-Kit durchzuführen.

Suspendieren Sie die Zellpellets in der grundlegenden nukleären Effektorlösung und geben Sie 0,2 bis zwei Mikrogramm GFP-Beta-Aktin-Vektorplasmid hinzu. Überführen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in eine nukleäre Effektor-Qve. Klopfen Sie mehrmals leicht auf die abgedeckte Vete, um sicherzustellen, dass keine Blasen zwischen dem Boden der Q-Vet und der Transfektionsprobe vorhanden sind.

Platzieren Sie den Q VET in das Nukleareffektor-Zwei-Gerät und führen Sie Programm A 0 3 4 aus, wobei Sie eine Transferpipette aus dem Nukleareffektor-Kit verwenden, um eine erwärmte Viertelliterportion von 500 µL EGM zwei MV-Medien auf den QVE zu übertragen. Danach überführen Sie das Gemisch zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren es 15 Minuten lang. Mischen Sie die transfizierte VE-Suspension vorsichtig einmal und geben Sie 300 µL der Suspension auf einen mit Gelatine beschichteten Deckgläser, ohne die Ränder zu berühren.

Dann für ein bis vier Stunden inkubieren. Die transfizierten Zellen untersuchen, um die Anheftung an die Deckglasabdeckung zu bestätigen. Anschließend 10 Milliliter E GM zwei MV-Medium in die Platte geben und weiter für die GFP-Expression inkubieren.

Fügen Sie zunächst ein physiologisches Salzlösungsmedium mit Albumin oder ein PSS in das Schwerkraftdurchflusssystem ein und verbinden Sie es mit dem Inline-Heizer. Stellen Sie nun den Durchflussregler so ein, dass ein Durchfluss von etwa 40 Milliliter pro Stunde erreicht wird. Stoppen Sie anschließend den Durchfluss, indem Sie den Hahn mit einem mit Watte abgeschlossenen Applikator schließen.

Tragen Sie Vakuumfett auf die Außenkante der Unterseite des Diamantbades auf. Entnehmen Sie nun eine transfizierte Kultur aus dem Inkubator. Heben Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig mit einer Pinzette an.

Dann mit einem Kim-Tuch überschüssiges EGM zwei MV-Medium auf der Unterseite des Objektträgers aufnehmen, wobei die Zelle nach oben zeigt. Legen Sie das Diamantbad über die Deckglasabdeckung, um eine Kammer zu bilden. Stellen Sie die Kammer schnell in den Objekttischheizer.

Ziehen Sie die Klammern über der Kammer fest und pipettieren Sie etwa ein Milliliter EGM-2-MV-Medium von der Platte in die Kammer. Befestigen Sie nun den Vakuumschlauch an der Halterung auf der linken Seite der Kammer und die PSS-Zuleitung vom Inline-Heizer im Kanal auf der rechten Seite der Kammer. Schalten Sie danach das Vakuum ein und öffnen Sie die PSS-Zuleitung, um die Badperfusion über die transfizierten Zellen zu ermöglichen.

Schalten Sie außerdem den Inline-Heizer auf 37 Grad Celsius ein. Danach platzieren Sie die Thermistorsonde für den beheizten Objektträger an der Kante in das Bad und schalten den Objektträger-Heizer auf 37 Grad Celsius ein. Um restliche EGM zwei MV-Medien und Ablagerungen zu entfernen, wischen Sie die Unterseite des Deckgläschens vorsichtig mit einem in 70 %igem Ethanol getränkten Kim-Tuch ab, gefolgt von einem trockenen Kim-Tuch. Äquilibrieren Sie die transfizierten HU-Zellen für 30 Minuten.

Verriegeln Sie den Grobtrieb. Fokussieren Sie den ausgewählten Bereich der Kulturzellen zur Untersuchung. Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera je nach Intensität des GFP-Signals in den Zellen zwischen 0,5 und zwei Sekunden ein.

Stellen Sie außerdem das Intervall und die Dauerzeiten für das Experiment ein. Nehmen Sie nun bei ausgeschaltetem Raumlicht ein Einzelbild auf, um die Einstellungen zu überprüfen. Nehmen Sie die Zeitrafferserie auf und überwachen Sie die Bilder, während sie benötigt werden.

Erhalten Sie in einem typischen Protokoll 20 bis 30 Minuten Basislinienbilder, bevor Sie ein Testmittel hinzufügen, gefolgt von 0,5 bis vier Stunden zusätzlicher Bildaufnahme. Schließlich bewerten Sie, wie im begleitenden Text beschrieben, die Ausstülpungsdistanz, Persistenz und Geschwindigkeit von Lamellipodien mittels CH-Graph-Analyse. In einem typischen Experiment wird GFP-Aktin in über 50 % der transfizierten VE zufällig exprimiert.

Diese einmal pro Minute aufgenommenen Bilder erfassen GFP-Aktin im gesamten Zytoplasma sowie in filamentösen Strukturen und in lokalen Lamellipodien, die entlang der Zellkante hervortreten. Die Wegstreckenbeständigkeit und Geschwindigkeit von Zellfortsätzen werden aus den Zeitrafferaufnahmen quantifiziert. Bei der CHM-Graph-Analyse wird zunächst eine einpixelige Linie annähernd senkrecht zur Zellkante gezogen.

Dieser Bereich wird aus jedem Bild des Zeitraffersatzes extrahiert, um eine Montage des Bereichs im Zeitverlauf oder hier einen Klanggraphen zu erzeugen; im Klanggraphen von links nach rechts betrachtet, werden Ausstülpungen als Aufwärtsbewegungen an der Zellkante dargestellt. Wenn eine Linie über die Kante einer dieser Ausstülpungen gelegt wird, können die mit dieser Linie assoziierten Pixeldaten erfasst werden, um die Dynamik der Ausstülpungen zu quantifizieren. Die Gesamtanzahl der Ausstülpungen in einem Klanggraphen kann verwendet werden, um die Frequenz der Ausstülpungen abzuschätzen.

Diese Analyse zeigt die Bewegungen von Stressfasern, die in der Nähe des Zellrandes entstehen und sich in Richtung Zellzentrum bewegen, wo sie schließlich abgebaut werden. Auf dem Chio-Diagramm erscheinen die Stressfasern als durchgehende Linien im zytoplasmatischen Bereich, die sich häufig nach unten und rechts in Richtung Zellzentrum bewegen. Wenn die Fasern im ursprünglichen Chio-Diagramm schwer zu erkennen sind, schärft der Unschärfemaske-Filter das Bild. Eingezeichnete Linien entlang der Stressfasern erleichtern die Erfassung der Pixeldaten mithilfe der Messfunktion. Alternativ werden Linien vom Anfang bis zum Ende der identifizierten Stressfaser gezogen, um einen massengewichteten Durchschnitt der Pixeldaten über die Dauer der Beobachtung der Faser zu erhalten.

Diese Präsentation zeigte, wie man Daten aus dem Zeitrafferbildsatz mithilfe der Graphanalyse mit Software wie Image J analysiert. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts als Reaktion auf entzündliche Mediatoren mittels Live-Cell-Imaging transfizierter endothelialer Zellen untersucht.