Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, infektiöses CRC e in Shisom umzuwandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst infektiöses CRC aus dem Schneckenwirt geerntet wird. Der infektiöse Darmkrebs wird konzentriert und dann mit einer zweischneidigen Nadel in nicht-infektiöses Shisom umgewandelt.

Schließlich werden die Shisoms konzentriert und in einer Kulturplatte gesammelt und in RPMI bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Mit Hilfe dieser Methode kann transformiertes Shisom mit FU zial oder cial Tail Kontamination erhalten werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da ein Transformationsverfahren schwer zu erlernen und potenziell gefährlich sein kann.

Cica sind infektiös und erfordern in einer hohen Konzentration und Isolierung eine schonende und präzise Handhabung, um sicher und effektiv vorzugehen. John, ein Forschungsassistent in meinem Labor, wird ihr Verfahren demonstrieren. Füllen Sie ein sauberes 500-Milliliter-Becherglas zur Hälfte mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur mit einem handelsüblichen Aquariennetz und einer Pinzette. Übertragen Sie die befallenen Schnecken in das Becherglas.

Stellen Sie das Becherglas auf eine Notauffangwanne acht bis 12 Zoll unter einer Glühlampenlichtquelle und lassen Sie es dort ein bis zwei Stunden lang. Die Einwirkung von hellem Licht führt dazu, dass der CRC den Schneckenwirt verlässt. Um die Schnecken zu entfernen, achten Sie darauf, zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, um jeglichen Kontakt mit dem infektiösen Wasser zu vermeiden, das CRC enthält, das die menschliche Haut direkt durchdringen kann.

Die Schnecken werden entfernt und die Lösung etwa 15 Minuten lang unter eine Lichtquelle gelegt, damit die Partikelabfälle auf den Boden des Kolbens sinken können. Sobald sich der Abfall abgesetzt hat. Den Zirkel mit einer Pipette in einen sauberen Erlenmeyerkolben umfüllen, dabei die Rückstände am Boden des Becherglases vermeiden.

Stellen Sie den Kolben in einem Winkel von 45 Grad auf Eis. Inkubieren Sie die Lösung 45 bis 60 Minuten lang im Dunkeln, damit sich der CRC in einer Ecke absetzen kann. Sobald sich die Parasiten angesiedelt haben, verwenden Sie eine 50-Milliliter-Pipette, um den größten Teil der Schlinge zu entfernen und entsorgen Sie sie vorsichtig.

In einem Becherglas, das 10 % Bleiche oder 70 % Ethanol enthält, wird der Erlenmeyerkolben vorsichtig geschwenkt, um die Parasiten wieder zu suspendieren. Anschließend wird die Probe mit einer Pipette in sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und inkubieren Sie sie noch einmal 20 Minuten lang im Dunkeln, damit sich der Darmkrebs absetzen kann.

Sobald sich die Parasiten ansiedelt haben, verwenden Sie eine Pipette, um die meisten Überstände zu entsorgen, und lassen Sie fünf bis 10 Milliliter Flüssigkeit in jedem Röhrchen. Setzen Sie als Nächstes eine Spritze mit einer 22-Gauge-Doppelend-Köderverschluss-Emulgiernadel ein. Ziehen Sie die parasitenhaltige Lösung langsam aus jedem Röhrchen in die Spritze.

Achten Sie darauf, dass die infektiöse Mischung nicht in die Haube tropft. Drehen Sie die Spritze vorsichtig so, dass die Nadel nach oben zeigt, und befestigen Sie eine zweite Spritze am freien Ende der Nadel. Schieben Sie die Mischung etwa 20 Mal zwischen den beiden Spritzen hin und her, um den CRC umzuwandeln.

Positionieren Sie dann die Spritzen senkrecht, so dass die leere Spritze oben liegt. Entfernen Sie die obere Spritze vorsichtig und desinfizieren Sie sie in 70%igem Ethanol. Legen Sie die Parasiten Tropfen für Tropfen in eine saubere, hochwandige Pyrex-Kristallisationsschale.

Desinfizieren Sie dann die Nadel und die Spritze in 70%igem Ethanol. Stellen Sie dann die Schale auf einen weißen Hintergrund, um die Parasiten sichtbar zu machen, und erwärmen Sie sie mit 37 Grad Celsius. Vervollständigen Sie das RPMI, so dass der Boden der Pyrex-Schale vollständig bedeckt ist.

Vorsichtig schwenken, um das Shisom in der Mitte mit einer sterilen Pipette aufzufangen. Sammeln Sie einen Teil des konzentrierten Shisoms und geben Sie die Parasiten in eine frische 12-Well-Zellkulturplatte. Wiederholen Sie dies und spülen Sie den Schritt aus, bis keine Parasiten mehr vorhanden sind.

Sobald die Parasiten übertragen wurden, füllen Sie jede Vertiefung etwa zur Hälfte mit warmem RPMI, um das Vorhandensein von Shisom zu überprüfen. Visualisieren Sie die Platte mit einem inversen Lichtmikroskop. Zu diesem Zeitpunkt sollten sich die meisten Parasiten in Shisom verwandelt haben, was von CRC E unterschieden werden kann, da sie weniger modal sind und den charakteristischen cial Schwanz fehlen.

Eine kleine Anzahl intakter Darmkrebsschwänze, abgetrennter Darmkrebsschwänze oder anderer Ablagerungen kann ebenfalls vorhanden sein. Shta kann dann in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zu sechs Wochen lang mit wöchentlichem Medienwechsel angebaut und gehalten werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infektiösen Arien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie doppelte Schichten von Handschuhärmeln und die ordnungsgemäße Verwendung von Einrichtungen und Hauben für biologische Gefahren getroffen werden sollten.