Name: Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Lernen Sie die Isolation primärer Trophoblastzellen aus der Mausplazenta mit enzymatischer Verdauung und Percoll-Dichtegradient. Diese Methode ermöglicht funktionale Invasionsassays für plazentare Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten die Creative Services Team an der University of Missouri Academic Support Center, die dieses Video produziert danken. Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development des National Institutes of Health, Grantnummer HD055231 unterstützt

Ein. Dissection der Maus Plazenta <ol><li> Richten Sie Fügepaaren von Mäusen. </li><li> An jedem der folgenden Tage, für die Anwesenheit eines copulator Stecker überprüfen. Der Tag, an dem ein Stecker erkannt wird als 0,5 Tage post-coitus (DPC) 7. </li><li> Plazenten können zu einem gewünschten Stadium der Schwangerschaft gesammelt werden, mit einem sauberen Dissektion der Plazenta möglichen Beginn mit der Entwicklung des reifen Plazenta auf d 10.5. Hier zeigen wir, 14,5 dpc. Bei den angegebenen Laufwerken wird 40-60 Plazenten auf 10,5 dpc und 10-20 Plazenten auf 14,5 dpc ergeben eine deutlich sichtbare Trophoblasten Zellschicht. </li><li> Euthanize die schwangere Maus, und entfernen Sie die Gebärmutter, Schneiden an der Zervix, und entlang der mesometrium. </li><li> Mit einer scharfen Schere zwischen jedem conceptus (Abbildung 1A) geschnitten. </li><li> Mit zwei Paar Zangen, fassen Sie die Gebärmutterwand an der Schnittkante und auseinanderziehen, das Entfernen des Myometrium (Abbildung 1B) . Ein Paar gezackte, mäßig fein (gebogen oder gerade) Pinzette plus ein Paar sehr feinen Pinzette (# 5, zum Beispiel) wird empfohlen. </li><li> Gegenüber der Plazenta, öffnen Sie das decidua mit einer Pinzette oder Schere, Aussetzen Plazenta. Greifen Gebärmuttergewebe mit einer Pinzette Paar, schieben weitere Pinzette unterhalb der Plazenta zu trennen (Abbildung 1C). Falls erforderlich, separate Fötus und fetalen Membranen aus Plazenta. Es ist nicht möglich, alle dezidualen Gewebe durch Dissektion ohne auch verlieren Plazentagewebe entfernen, aber zusätzliche dezidualen Gewebe (blass) können von der Oberfläche der Plazenta durch leichtes Ablösen mit einer Pinzette entfernt werden. Wir werden auf der Percoll-Gradienten zur weiteren Reinigung angewiesen. </li><li> Platzieren Sie jede seziert Plazenta in 25 ml eiskaltem Dissoziationspuffer in einem 50 ml konischen Röhrchen, bis alle Sektionen vollständig sind. In späteren Stadien, grob zerkleinern Plazentagewebe mit einer Schere oder Rasierklinge, bevor sie in Dissoziationspuffer übertragen. </li></ol>tle "&gt; 2. Isolierung von Trophoblastzellen <ol><li> Locker cap konischen Rohr und in einem 37 ° C Bad für 45-60 Minuten. Mischen Sie die Dissoziation Lösung kräftig durch Pipettieren ca. alle 10 min. Die gesamte Dauer der Verdauung sollten engmaschig überwacht werden und wird wahrscheinlich verlangen einige trial and error, um eine optimale Erholung der Zellen zu erreichen. Gewebe sind in der Lage, durch einen 10 ml-Pipette übergeben werden, aber sichtbar Gewebestücke bleibt. Overdigestion wird in armen Zellüberleben und Platierungseffizienz führen. Optimal Zellüberleben und Platierungseffizienz wird auftreten, wenn Klumpen von wenigen Zellen vorhanden sind, anstatt wenn vollständige Dissoziation erreicht. Umgekehrt wird underdigestion reduziert Reinheit nach Percoll Trennung führen. Wenn die richtige Verdauung Punkt erreicht ist, an Ort Röhrchen auf Eis zu stoppen Kollagenase-Aktivität. </li><li> Übergeben Sie die Lösung durch eine Zelle Sieb, um unverdaute Materialien zu entfernen, und zentrifugieren @ 500 xg für 5 Minuten. </li><li> Zu waschen, zu entfernenÜberstand und resuspendieren Zellen in 10 ml Waschlösung. Zentrifuge @ 500 xg für 5 Minuten. </li><li> Während der Zentrifugation, bereiten Percoll Lösung durch Mischen 9,6 ml Percoll, 13,4 ml Waschlösung und 1,1 ml 10x Medium 199 in einem 50-ml-Röhrchen für geeignete Hochgeschwindigkeitszentrifugation. </li><li> Überstand entfernen und Zellpellet in 2 ml Waschlösung. </li><li> Hinzufügen von Zellen zur Lösung Percoll und zentrifugieren @ 30.000 xg für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Röhrchen aus Zentrifuge, ohne die Steigung. Um den Gradienten, Platz Rohr vor einer hellen Lichtquelle zu visualisieren. Suchen Sie den Trophoblasten Band (Abbildung 2), und saugen mit einer Pipette, kümmert sich nicht um die roten Blutkörperchen Band unterhalb stören. Volume des Trophoblasten Band 5-8 ml betragen. </li><li> Übertragen Trophoblastenzellen mit einem 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Waschlösung auf ein Gesamtvolumen von 45ml. </li><li> Zentrifuge @ 500 xg für 5 Minuten. Überstand entfernen, und resuspendieren in Kultur medium (NCTC-135). Zellen können auf dünnschichtigen Matrigel oder Gewebekultur-Plastik bei 37 ° C und 5% CO 2 kultiviert werden. Am Tag 10,5 ergibt jeweils Plazenta rund 50.000 lebenden Zellen, von denen 80-90% Cytokeratin positive sind. </li></ol> 3. Trophoblastinvasion Assay <ol><li> 1-2 ml Kulturmedium (NCTC-135) zu jedem Matrigel Kammer und bei 37 °, 5% CO 2 für 30-90 min. </li><li> Entfernen Medium und 1,5 ml x 10 5 frisch isolierten Zellen in 2ml mittleren bis oberen Kammer. 1 ml Medium unteren Kammer unteren Membran bedecken. </li><li> Kultur Zellen in Einsätze für 18-24 Stunden. </li><li> Scrape Zellen und Matrigel aus dem Einsatz mit einem Schaum-Tupfer. </li><li> Spülen der Oberseite und der Unterseite der Kammer in 2 ml PBS. </li><li> Fix für 5 min in 1 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. </li><li> Stain, indem untere Kammer mit 400 ul DAPI (300nm) und Inkubation für 30 min. </li><li> Dreimal kurz in PBS. </li><li entfernen membranen aus eins mit einem scharfen skalpell.><li> Fügen Sie einen 10 ul Tropfen Eindeckmedium (50% Glycerin in PBS) zu rutschen. Mit einer Pinzette, lag Membran auf Drop. Hinzufügen 10 ul Tropfen des Mediums, dann vorsichtig Deckglas. </li><li> Photograph und Anzahl Zellen. Seien Sie sicher zu orientieren die Membran entsprechend (Zell-Seite nach oben oder Zell-Seite nach unten) für das Mikroskop verwendet wird. Image J Software (National Institutes of Health) eine manuelle Zählung Funktion, die für diesen Zweck verwendet werden können, ebenso wie Adobe Photoshop oder einem manuellen Zähler. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Dissection der Maus Plazenta. (A) Der Uterus wird durch Schneiden entlang den Eileiter (gelb), entlang der Oberfläche mesometrial entfernt und an der Zervix (unten). Individuelle conceptuses kann dann durch Schneiden mit einer Schere getrennt dargestellt werden. (B) Der Uterus Wand durch Anordnen zweier Pinzetten im Schnitt uterinen Oberfläche und Reißen entlang der Anti-mesometrial Seite, in der Nähe des Fötus und weg von der Plazenta entnommen. (C) Die Plazenta wird dann durch Greifen mit einer Zange und einem anderen zwischen der gleitenden Plazenta und Gebärmuttergewebe isoliert. Nabelschnur und anderen extraembryonalen Membranen können dann aus der Plazenta abgetrennt werden. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Percoll Trennung von Trophoblastzellen. Nach dem Zentrifugieren wird drei großen Bands zu sehen sein, wie in der Karikatur auf der linken Seite gezeigt, und fotografieren rechts. Die obere Bande enthält Zelltrümmern und Fibroblasten und erst am deutlichsten. Eine enge (rot) Band nahe der Unterseite mit roten Blutkörperchen sichtbar sein wird knapp unterhalb der diffuse Trophoblasten Band. Zellaggregate wird wahrscheinlich in den Trophoblasten Band gesehen, wie in den beiden direkt links des Pfeils auf dem Foto gezeigt. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Invasive Trophoblastenzellen (weißer Pfeil) wird durch die Schicht und den Matrigel-Membran Poren passieren, die auf der unteren Oberfläche der Membran. Die Poren sind sichtbar (schwarz Pfeilspitze). Die Anzahl der Zellen auf der gesamten Membranoberfläche oder einer repräsentativen Bereich gezählt werden. Ein Graustufenbild fluoreszierender DAPI Kernfärbung wurde umgedreht, um Visualisierung von Zellen zu verbessern. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Trophoblastzellen können identifiziert werden, und die Reinheit des isolierten Population beurteilt, durch Immunfärbung für Cytokeratin 7 (Mitte, Magenta). Die Zellen werden mit DAPI (oben, blau) gegengefärbt. Zusammengefügte Bild, unten.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Video zeigen wir die Isolierung von Trophoblastzellen aus der Maus Plazenta. Wir zeigen dann eine in vitro-Assay für Trophoblastinvasion. Mit diesem Verfahren wird eine weitgehend, aber nicht vollständig, können reine Population von Trophoblasten Zellen gewonnen werden. Wenn weitere Reinheit erforderlich ist, könnte Magnetkügelchen Trennung oder Durchflusszytometrie durchgeführt werden, wie es für primäre humane Trophoblastenzellen beschrieben worden. Die richtige Länge der Kollagenase Dissoziationsschritt müs...

isolation of primary maus trophoblastzellen und trophoblastinvasion assay

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Die Plazenta ist verantwortlich für den Transport von Nährstoffen, Gasen und Wachstumsfaktoren für den Fötus, sowie die Beseitigung von Abfällen. So haben Mängel in Plazentaentwicklung wichtige Konsequenzen für den Fötus und Mutter, und sind eine der Hauptursachen für embryonale Letalität. Der wesentliche Zelltyp des fetalen Teils der Plazenta ist die Trophoblasten. Primäre Maus plazentalen Trophoblastenzellen sind ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung normalen und abnormalen Plazentaentwicklung, und anders als Zelllinien, können isoliert und verwendet werden, um Trophoblasten in spezifischen Stadien der Schwangerschaft zu studieren. Zusätzlich kann Primärkulturen von Trophoblasten aus transgenen Mäusen verwendet, um die Rolle von bestimmter Gene in Plazenta-Zellen zu studieren. Die hier vorgestellten Protokoll basiert auf der Beschreibung von Thordarson et al. 1, bei dem eine Percoll Gradienten verwendet werden, um ein relativ reines Trophoblasten Zellpopulation aus isolierten Maus Plazenten erhalten wird. Es ist ähnlich wie die weiter verbreitet verwendetd Methoden für menschliche Trophoblasten Zellisolation 2-3. Reinheit kann durch immuncytochemische Anfärben der isolierten Zellen für Cytokeratin 7 4 bewertet werden. Hier werden die isolierten Zellen dann unter Verwendung eines Assays, um Matrigel Invasion Trophoblasten Invasivität in vitro 5-6 beurteilen. Die befallenen Zellen werden durch Immunzytochemie und gebeizt zum Zählen analysiert.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Die Plazenta ist für den Transport von Nährstoffen, Gasen und Wachstumsfaktoren zum Fötus sowie für die Ausscheidung von Abfallstoffen verantwortlich.
Folglich führen Defekte ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre plazentare Trophoblastenzellen aus Mäusen für die Zellkultur zu isolieren. Wir werden außerdem eine Anwendung dieser Zellen demonstrieren, einen Matri-Gel-Invasionsassay. Der Uterus wird von der trächtigen Maus entfernt und die Plazenta wird präpariert.Das Plazentagewebe wird enzymatisch verdaut, um einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen zu gewinnen; die Zellen werden anschließend anhand eines Dichtegradienten separiert. Die Bande, die Trophoblastenzellen enthält, wird abgesaugt, und die resultierende Zellpopulation kann dann gewaschen und ausplattiert werden. Als Nächstes demonstrieren wir den Invasionstest: Die Zellen werden auf eine Schicht Matrigel ausplattiert, die eine dünne Membran bedeckt.Invasive Zellen durchdringen die Matrigel-Schicht und passieren die acht Mikrometer großen Poren in der Membran. Anschließend werden die Zellen fixiert und die Membran entfernt. Die eingewanderten Zellen können dann angefärbt und gezählt werden.Hallo, ich bin Kathleen Pennington aus dem Schultz-Labor der Abteilung für Geburtsmedizin, Gynäkologie und Frauenheilkunde an der University of Missouri in Columbia, Missouri. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren, das wir verwenden, um primäre Trophoblastenzellen aus trächtigen Mäusen zu isolieren. Anschließend demonstrieren wir den Invasionstest, den wir zur Untersuchung der Zellen verwenden.Wir verwenden diese Verfahren, um Faktoren zu untersuchen, die die Entwicklung plazentarer Trophoblastenzellen und deren Fähigkeit zur Invasion einer extrazellulären Matrix beeinflussen. Beginnen wir. Richten Sie zunächst Zuchtpaare von Mäusen an jedem der folgenden Tage ein.Überprüfen Sie das Vorhandensein eines Koitusbolzens. Der Tag, an dem ein Bolzen nachgewiesen wird, gilt als Tag 0,5.Die Nachgeburt kann in dem gewünschten Stadium der Schwangerschaft entnommen werden. Hier demonstrieren wir die Dissektion einer Plazenta vom Tag 14,5 am Arbeitstisch. Für frühere Stadien kann jedoch ein Mikroskop erforderlich sein, um die Gewebe sichtbar zu machen: Lokalisieren Sie zunächst die Gebärmutter und schneiden Sie dann an der Verbindung zwischen Gebärmutter und Eileiter.Setzen Sie das Entfernen von Fett und Blutgefäßen am Gebärmutterhals und an der anderen Röhrenverbindung fort. Um die Gebärmutter zu entfernen, überführen Sie die Gebärmutter mit einer scharfen Schere in eine saubere Petrischale. Trennen Sie jeden Embryonalanlage. Sobald getrennt, überführen Sie jede Embryonalanlage in eine saubere Schale.Der Fötus liegt von der Plazenta aus gesehen auf der anti-myometrialen Seite. Die Plazenta liegt entlang der meso-Seite des Uterus. Verwenden Sie ein Paar Pinzetten, um den Uterus nahe der Schnittfläche zu fassen.Ziehen Sie vorsichtig die beiden Pinzettenpaare voneinander weg und reißen so die Uteruswand entlang der anti-myometrialen Seite auf. Dadurch werden in der Regel auch die Membranen rupturiert. Es verbleibt ein deutlich sichtbarer Fötus oben, mit der roten Plazenta darunter und dem weißen Uterusgewebe.Darunter verwenden Sie feine Pinzette, um die Fötussehne und das amnionale Gewebe von der Plazenta zu trennen. Halten Sie das Uterusgewebe mit einem Paar Pinzetten fest und führen Sie das andere Paar zwischen die Plazenta und das darunterliegende Uterusgewebe. Zu diesem Zeitpunkt kann überschüssiges Deziduagewebe von der Plazenta entfernt werden.Es verbleiben jedoch wahrscheinlich einige Deciduazellen. Legen Sie jede präparierte Plazenta in einen eiskalten Dissoziationspuffer, bis alle Präparationen abgeschlossen sind. Verschließen Sie nach Beendigung der Präparationen den kegelförmigen Reagenzglasbehälter mit der Plazenta und der Dissoziationslösung locker und stellen Sie ihn für 45 bis 60 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Nach 10 Minuten die Dissoziationslösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen und den Verdauungsfortschritt sorgfältig überwachen. Die geeignete Dauer des Kollagenase-Dissoziationsschritts muss bei jedem Experiment individuell bestimmt werden und wird mit der Erfahrung erlernt. Eine Überverdauung reduziert die Zellausbeute erheblich, während eine Unterdigestion zu geringerer Reinheit sowie zu reduzierten Zellzahlen führen kann.Beenden Sie die Reaktion, wenn nur noch wenige Stücke unverdauten Gewebes vorhanden sind. Lassen Sie die Lösung durch einen Zellfilter laufen, um unverdaute Materialien zu entfernen, und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang mit 500 ×g, um die Plazentazellen zu pelletieren. Waschen Sie anschließend die Zellen.Um die Dissoziationslösung zu entfernen. Entfernen Sie snat und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Waschlösung, zentrifugieren Sie bei 500 ×g für fünf Minuten. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Per-Call-Lösung vor, indem Sie 9,6 ml Per-Call und 13,4 ml Waschlösung in einem für Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeigneten Gefäß mischen.Fügen Sie 1,1 ml 10x Medium, 1 99 hinzu, um die pro Zelle Lösung herzustellen, und invertieren Sie den Kolben zur Mischung. Nach der Zentrifugation und der Waschlösung entfernen Sie das Überstand und resuspendieren das Zellpellet. Waschen Sie in zwei ml Waschlösung, geben Sie die Zellen zur Protokolllösung hinzu und mischen Sie, um den Gradienten herzustellen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und nehmen Sie den Kolben aus der Zentrifuge, ohne den Gradienten zu stören.Der Gradient kann leichter visualisiert werden, indem das Röhrchen vor eine Lichtquelle gehalten wird. Ein weißes Band, das hauptsächlich zellulären Abfall enthält, ist nahe dem oberen Ende des Röhrchens sichtbar, und ein Band aus roten Blutkörperchen ist höchstwahrscheinlich nahe dem unteren Ende des Röhrchens erkennbar. Direkt darüber.Dies ist das Trophoblastenband. Aspirieren Sie das Medium bis knapp oberhalb des Trophoblastenbandes und entsorgen Sie es. Übertragen Sie dann mit einer Pipette das Trophoblastenband in ein sauberes Zentrifugenröhrchen, das 35 ml Waschlösung enthält, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 500 ×g.Um die Trophoblastenzellen zu pelletieren, resuspendieren Sie das Pellet in Trophoblasten-Kultivierungsmedium. Hier werden die Zellen in Invasionskammern in einer 6-Loch-Platte kultiviert. Die Matrigel-Kammern wurden zuvor gemäß den Herstelleranweisungen gewaschen; pipettieren Sie 0,5 bis 1 ml Kultivierungsmedium in das Loch unterhalb jedes Inserts. Gebe anschließend 1,5 × 10⁵ Zellen in eine Portion Medium in die Kammer. Inkubiere bei 37 °C und 5 % CO2. Entferne die Invasionskammern nach 18 bis 24 Stunden aus dem Inkubator.Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Kammer dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, sanft, aber gründlich. Schaben Sie die Zellen und das größere Gel von der oberen Oberfläche des Inserts ab. Fixieren Sie mithilfe eines Wattestäbchens die durchgewanderten Zellen auf der unteren Membranfläche, indem Sie die Vertiefung mit 4 %iger Paraformaldehydlösung füllen und fünf Minuten lang inkubieren.Dreimal mit PBS spülen. Die eingewanderten Zellen färben, indem man die Vertiefung mit einer Kernfärbung wie Dappy füllt. 20 Minuten inkubieren.Nochmals dreimal mit PBS waschen. Mit einer Skalpellklinge einen Tropfen Eindeckmedium auf einen Objektträger geben, die Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus der Invasionskammer entfernen. Die Membran so auf den Objektträger übertragen, dass die Zellen nach oben zeigen.Legen Sie die Membran über den Tropfen. Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Geben Sie einen weiteren Tropfen Eindeckmedium hinzu und decken Sie mit einem Deckglas ab.Untersuchen und fotografieren Sie sorgfältig die durchgewanderten Zellen auf der Membranoberfläche. In Abbildung eins sind invasive Trophoblastenzellen zu sehen, die die Matrigel-Schicht und die Membranporen durchquert haben und auf der Unterseite der Membran erscheinen. Die Poren können ebenfalls sichtbar sein.Die Anzahl der invadierten Zellen kann manuell oder mithilfe von Computer-Software zwischen Behandlungsgruppen gezählt und verglichen werden. Abbildung zwei zeigt zusätzlich zu Kernfärbungen, dass die Immunzytochemie zur Charakterisierung der invadierten Zellen verwendet werden kann. Hier haben wir einen Antikörper gegen Zytokeratin 7 verwendet, um zu bestätigen, dass es sich bei den Zellen um Trophoblasten handelt.Wir haben die Isolierung von Trophoblastenzellen aus der Mausplazenta demonstriert. Anschließend zeigten wir einen In-vitro-Assay für die Trophoblasteninvasion. Mit dieser Methode kann eine weitgehend, jedoch nicht vollständig, reine Population von Trophoblastenzellen erhalten werden.Falls eine weitere Reinigung erforderlich ist, könnte eine Trennung mittels magnetischer Kügelchen oder eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden, wie bereits für primäre humane Trophoblastzellen beschrieben. Obwohl wir die Verwendung kommerziell hergestellter Matri-Gel-Invasionskammern gezeigt haben, können diese auch hergestellt werden, indem Matri-Gel in der gewünschten Dicke auf nicht beschichtete Transwell-Kammern aufgetragen wird. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Dieses Manuskript präsentiert ein einzigartiges in vitro Modell von immungereinigten humanen villösen Zytotrophoblastzellen, die unter Hypoxie/Reoxygenierung kultiviert wurden. Dieses Modell ist geeignet, um die schützende Wirkung vielversprechender Behandlungen wie Melatonin auf Schwangerschaftskomplikationen zu untersuchen, die mit erhöhtem oxidativem Stress und veränderter Plazentafunktion verbunden sind.

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.

Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Der In-vitro-Zellinvasionstest wird verwendet, um das Potenzial von Krebsmetastasen zu messen, indem das zelluläre Potenzial für Invasion und Migration mithilfe von Zellkultureinsätzen, die Proteinmatrix enthalten, quantifiziert wird. Die Zellen werden herausgefordert, durch die Proteinmatrix und eine poröse Membran in Richtung eines Chemoattractants zu wandern und dann durch Lichtmikroskopie quantifiziert zu werden.

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von röhrenartigen Strukturen, die im klassischen in vitro Angiogenese-Röhrenbildungsassay gebildet wurden, bei dem Zellen, wie z. B. Trophoblastzellen, in kapillarartigen Strukturen über einer Schicht aus extrazellulärer Basalmembranmatrix organisiert sind. Die gewonnenen Strukturen werden zur RNA- und Proteinisolierung für verschiedene biochemische Analysen verwendet.

Trophoblastenzellgewinnung aus Angiogenese-Röhrchenbildungsassay für die Analyse der Differenzierungsmarkerexpression

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Lernen Sie die Isolation primärer Trophoblastzellen aus der Mausplazenta mit enzymatischer Verdauung und Percoll-Dichtegradient. Diese Methode ermöglicht funktionale Invasionsassays für plazentare Forschung.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Weitere Videos entdecken