Name: Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung der Leukozytenadhäsion an das Endothel in druckbelasteten Gefäßen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung unter physiologischen Bedingungen und liefert Erkenntnisse über Entzündungsmechanismen bei Hypertonie.

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Diese Studie wurde zum Teil durch die Regierung von Victoria ist OIS Programm, das National Health and Medical Research Council of Australia Programm-und Projektmanagement Zuschüsse (JPF Chin-Dusting) und Postgraduate-Stipendium (D Michell) unterstützt.

1. Isolating Halsschlagadern <ol><li> Euthanase10 Wochen alte Sprague Dawley Ratten über CO 2 / O 2 Ersticken. </li><li> Excise links und rechts Arteria carotis communis mit Aorta und Herz sicherzustellen minimal Dehnung der Gefäße. </li><li> In eiskalten Krebs-Puffer trennen die Halsschlagadern aus der Aorta und Herz und führen in der Nähe Dissektion. </li><li> Halten Sie isolierten Gefäßen in Krebs auf Eis vor der Montage. </li></ol> Ca. Zeit = 45 Minuten 2. Priming des Schiffes Kammer <ol><li> An der proximalen und distalen Anschlüsse des Schiffes Kammer bündig Krebs-Puffer bei einem physiologischen pH durch Infusion Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) aufrechterhalten durch den Puffer bei 37 ° C. </li><li> Stellen Sie sicher, Schläuche und Kanülen sind komplett gespült und ausgerichtet sind. </li><li> Flush Kreb-Puffer durch das P1 (proximal) und P2 (distalen) Wandler. Close Hähne keine Luftblasen in den Wandlern zu gewährleisten. </li><li> Schließen Sie die Sensoren an den entsprechenden Anschlüssen und wieder bündig mehr Krebs-Puffer gewährleistet keine Luftblasen. Close abgreift, um die Kammer. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 3. Durch das Aufdrücken des Schiffes Kammer <ol><li> Schalten Sie Druckgeräte: Druck Servo-, Druck-Monitor, Schlauchpumpe (Abbildung 1). </li><li> Mit der Schlauchpumpe auf Druck und der Druck auf Servo automatisch ablaufenden Krebs-Puffer durch den Schlauch bei 20 mmHg (Zifferblatt bei 1), sodass keine Luftblasen. </li><li> Die Leitungen zu den geschlossenen P2 Wandler. Der Druck wird sich stabilisieren. </li><li> Öffnen P2 tippen, um das Schiff Kammer zu spülen, keine Blasen schließen Sie dann ab. </li><li> Füllen Sie das Bad mit Krebs-Puffer (5 bis 7 mL). </li></ol> Ca. Zeit = 10 Minuten 4. Montage des Schiffes <ol><li> Unter einem Binokular statt schwarzem Polyester Bande auf jede Kanüle (Abbildung 2). </li><li> Bewegen Sie Kanülen und Kanüle Inhaber auseinander und montieren ¼ Gefäß (Aortenbogen Ende) auf die P1 Kanüle. Stellen Sie sicher nicht, das Schiff zu reißen. </li><li> Mit einer Spritze mit Krebs-Puffer gefüllt sanft spülen überschüssiges Blut aus dem Gefäß über P1 Wandler. Schließen Sie P1 an die Kammer. </li><li> Sichere Schiff in den P1 Kanüle mit dem Polyester Krawatte. </li><li> Bewegen Kanülen / Kanüle Inhaber näher für die Montage auf der P2-Kanüle. </li><li> Berg distale Ende des Schiffes (~ ¼ der Länge) auf distalen Kanüle. Sicherer mit Polyester-Krawatte. </li></ol> Ca. Zeit = 20 Minuten 5. Durch das Aufdrücken des Schiffes <ol><li> Passen Sie die Kanüle Inhaber keine beugen oder strecken in das Schiff zu sichern. </li><li> Mit P1 und P2 geschlossen, um die Kammer-Schalter der Druck Servo von automatisch auf manuell. Überprüfen Sie auf der Druck-Servo gibt es keine kontinuierliche Abnahme der Druck innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ja, ist ein Leck auftritt und die Anschlüsse und Sensoren benötigen, um im Platz zu sichern. </li><li> Passen Sie den Druck Servo zurück zur automatischen öffnen P2 in die Kammer. Unter dem Mikroskop beobachten, das Schiff ausdehnen, wenn der Hahn in die Kammer geöffnet wird. </li><li> Schalten Sie den Druck Servo-Handbuch. Kontrollieren Sie wieder für eine kontinuierliche Abnahme des Drucks innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ein Leck vorhanden ist dann ist das System nicht dicht Druck und es wird wahrscheinlich ein Loch in das Schiff sein. </li><li> Zurück zur automatischen Öffnen P1 in die Kammer. Auf die manuelle Einstellung zu überprüfen, dass der Druck stabil bleibt. </li><li> Wenn kein Leck, auf manuelle Einstellung zu erhöhen Rad 2 (40 mmHg). </li><li> Passen Sie die automatische und beobachten das Schiff unter dem Mikroskop. Wenn nötig, passen Sie die Kanülenhalter keinen Knick in der vessel.Check auf Undichtigkeiten auf manuelle Einstellung zu gewährleisten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,6 bis 5,7 erhöht die Wählscheibe auf 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) und so weiter, bis der gewünschte Druck erreicht ist. </li></ol> Ca. Zeit = 15 bis 30 Minuten 6. Inkubation des unter Druck stehenden Behälter <ol><li> Verbinden Sie den Temperaturregler eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Mit einem zweiten Schlauchpumpe perfuse Krebs-Puffer (1 mL / min) in das Gefäß Kammer Bad. </li><li> Connect Aspirator an die Kammer sicher, dass nur die oberste Schicht des Bades entfernt wird. </li><li> Inkubieren unter Druck stehenden Behälter bei 37 ° C für 1 Stunde mit dem Druck auf automatisch. </li><li> Überprüfen Sie den Druck nicht undicht ist (Umschalten auf manuelle) in regelmäßigen Abständen. </li><li> Die Auswirkungen der verschiedenen pharmakologischen Interventionen können durch einfaches Hinzufügen der Verbindung zum Bad während der Inkubation beobachtet werden. </li></ol> Ca. Zeit = 1 Stunde 7. Perfusion der unter Druck stehenden Behälter mit Vollblut <ol><li> Während der Inkubation erhalten mindestens 7,5 mL Vollblut / Schiff in 40 U Heparin / ml Blut gesammelt. Inkubieren in einem 50 ml Falcon bei 37 ° C. </li><li> 10 Minuten vor dem Ende der ter Inkubation Label Blut mit VybrantDil (1:1000) für 10 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach 10 Minuten sammeln Blut in eine Spritze Clearing keine Blasen und legen auf eine Spritzenpumpe mit einem Heizmantel auf 37 ° C. </li><li> Schließen Sie P1 Wandler, um die Kammer / Schiff und verbinden Spritze und Ablaufschlauch. </li><li> Purge Blut bei 1000 ul / min durch den Ablaufschlauch keine Luftblasen zu entfernen. </li><li> Öffnen P1 in die Kammer. Der Druck Servo wird automatisch angepasst, um gewünschten Druck zu halten. </li><li> Perfundieren Blut bei 100 ul / min. </li><li> Mit einem Fluoreszenz-Mikroskop gekoppelt mit einer digitalen Kamera aufnehmen zwei Felder des perfundierten Gefäß für 15 Sekunden bei 1, 3, 5, 7,5 und 10 Minuten. </li><li> Beitrag Perfusion endothelialen Integrität und Funktion kann über pharmakologische Techniken wie Myographions und Adhäsionsmolekül Expression kann immunhistochemisch bestimmt werden, um weiter zu validieren die entzündliche Reaktion zu beurteilen. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 8. Repräsentative Ergebnisse: Eine schematische Darstellung der Druckkammer Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit einer Digitalkamera gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop Ergebnisse können sofort per Live-Video-Aufnahmen sichtbar gemacht werden. Vertreter Videobilder werden in Abbildung 3, wo Leukozyten gelten als Anhänger des Endothels, wenn sie 10 Sekunden lang stationär geblieben zu sehen sind. Mit Video-Aufnahmen auf Endlosschleife eingehalten Zellen können als Mittelwert pro Feld gezählt werden. Während beide niedrig sind (Abbildung 3A) und hoch (Abbildung 3B) Druck ein gewisses Maß an Haftung verursachen einen signifikanten Anstieg der Leukozyten-Adhäsion an der höheren intraluminalen Druck gesehen, und das ist auch quantitativ (Abbildung 4) demonstriert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Unter Druck ex vivo Schiff Kammer schematisch. Ein kanülierten Schiff verbunden mit einem proximalen (P1) Wandler und einem distalen (P2) Wandler, dass der Blutdruck ermöglicht, innerhalb des Behälters manipuliert werden. Perfusion wird durch die P1 Wandler und Druck über P2 Wandler gewartet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Cannuala mit Krawatten. Schwarze Polyester-Verbindungen sind zu jeder Kanüle befestigt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Vertreter von Videobildern. Dynamische Zelladhäsion (roter Pfeil) unter Fluoreszenz bei 80 mmHg (A) und 120 mmHg (B) nach 10 Minuten Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Leukozytenadhäsion in Sprague Dawley Halsschlagadern nach 1 Stunde Inkubation bei niedrigen (80 mmHg) und hohem Druck (120 mmHg). *** P &lt;0,001, wie 2-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferroni post hoc Test analysiert.

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</ol>

Das Studienprotokoll wurde von der Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics Committee und der Alfred Hospital Ethics Committee genehmigt.

Dies ist eine modifizierte Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in intakten isolierten Blutgefäßen unter Druckbedingungen in Echtzeit zu studieren. Perfusion des Schiffes Kammer allein ermöglicht eine schnelle Validierung von pro-inflammatorischen Stämme von großen Mäusen und Ratten Schiffe. Aktivieren Druck Manipulation ermöglicht dynamische Zell-Interaktionen von niedrig bis sehr hoch intraluminalen Druck, damit eine bessere Mimik-Ing physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eingehalten werden. Durchmesser der Gefäße können ebenfalls gemessen mit einer ausreichenden Zell-Imaging-Programm und damit Scherströmung und kann ermittelt werden und somit manipuliert werden. Mit seiner Myographions Fähigkeiten, fügen pharmakologische Interventionen in das Bad gelegt weitere Dimension der experimentellen Bedingungen möglich mit diesem Modell ermöglicht Untersuchungen von mechanistischen und Signalwege. Während endothelial Erhaltung kann nicht während der Druck Manipulation bestätigt werden, können Reaktionen auf ACh und PE post Perfusion 9 geführt werden. Anzumerken ist, dass dieses Setup die Auswirkungen der intraluminale Druck auf Zell-Zell-Interaktionen nicht die Auswirkungen des pulsierenden Blutflusses noch systolische oder diastolische Druck zeigt werden. Hinzu kommt, dass akute Druckänderungen auf Leukozytenadhäsion beobachtet wurden, kann dieses Setup auch genutzt werden, um bei chronischen Druck-Effekte (dh die Erhöhung Inkubationszeiten und mit einem chronischen Druck Tiermodell) zu suchen. Sprague Dawley Arteria carotis communis werden in dieser Einrichtung aber gezeigt, andere Stämme und Arten können mit entsprechenden Anpassungen an die Kanüle Größe verwendet werden. In der Tat ist es wichtig zu beachten, dass das Alter und Gewicht der Tiere Gefäßgröße beeinflussen und damit, dass die Einrichtung muss für jedes Schiff individuell angepasst werden. Close und sorgfältige Dissektion des Bindegewebes kann Visualisierung der Leukozyten immens verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> SteREO Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera und Controller </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Beleuchtungssystem </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Vessel Kammer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Servo Controller und Schlauchpumpen </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Pressure Monitor </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Druckaufnehmer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil Zell-Kennzeichnung Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Verwenden 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukozytenadhäsion an das vaskuläre endothel bei hohen intraluminalen druck

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, Bluthochdruck wird berichtet, dass in etwa ein Viertel der Bevölkerung und ist der führende biomedizinische Risikofaktor für die Mortalität weltweit. In den Gefäßen Hypertonie ist mit einer endothelialen Dysfunktion und erhöhte Entzündung führt zu Arteriosklerose und verschiedenen Krankheiten wie chronischen Nierenerkrankungen 2, 3 und Schlaganfall Herzinsuffizienz 4 zugeordnet. Ein erster Schritt in Gefäßentzündungen führt zu Arteriosklerose ist die Haftung Kaskade, die die Rollen, Anbindehaltung, die Einhaltung und anschließende Transmigration von Leukozyten durch das Endothel handelt. Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten an das Endothel wird durch eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und E-Selektin sowie Erhöhungen in vermittelter Zytokin-und Chemokin-Freisetzung und eine Hochregulation von reaktiven Sauerstoff-Spezies 5. In-vitro-Methoden wie z. B. statische Haftung Assays helfen, die Mechanismen der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sowie die Analyse von Zell-Adhäsionsmoleküle zu bestimmen. Methoden in der früheren in vitro Studien verwendet haben gezeigt, dass akute Erhöhungen der Druck auf das Endothel kann Monozytenadhäsion, eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen und Entzündungsmarker 6 hingegen, ähnlich wie bei vielen in-vitro-Assays, diese Erkenntnisse noch nicht in Echtzeit durchgeführt führen unter physiologischen Strömungsverhältnisse, noch mit Vollblut. Daher sind in-vivo-Untersuchungen zunehmend in Tiermodellen genutzt werden, um vaskuläre Entzündungen und die Bildung von Zahnbelag zu demonstrieren. Intravital Mikroskopie ist mittlerweile weit verbreitet, um Leukozytenadhäsion, Walzgut, Migration und Transmigration 7-9 zu bewerten. Bei der Kombination der Auswirkungen von Druck auf die Leukozyten an endotheliale Adhäsion der in-vivo-Studien sind weniger umfangreich. Eine solche Studie untersucht die Echtzeit-Effekte von Strömungs-und Scherung auf arterielle Wachstum und Umbau, sondern Entzündungsmarker waren nur über Immunhistochemie 10 beurteilt. Hier präsentieren wir ein Modell für die Aufnahme Leukozytenadhäsion in Echtzeit in intakten Druck Blutgefäße mit Vollblut Perfusion. Die Methodik ist eine Modifikation eines Ex-vivo-Perfusion Schiff Kammer-Modell 9, die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Endothel-adhäsiven Wechselwirkungen in intakten Behältern ermöglicht. Unsere Modifikation ermöglicht die Manipulation der intraluminale Druck bis 200 mmHg Berücksichtigung Studie nicht nur unter physiologischen Strömungsverhältnisse, sondern auch Druckbedingungen. Während der Druck Myographie Systeme zuvor unter Beweis gestellt haben, um Gefäßwand und Lumen Durchmesser 11 sowie Gefäß Kontraktion zu beobachten ist dies das erste Mal zeigen, Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Echtzeit. Hier zeigen wir die Technik mit Halsschlagadern von Ratten entnommen und Kanüle eingeführt, um eine maßgeschneiderte Flusskammer gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Das Schiff Kammer ist mit einem großen unteren Deckglas so einem großen Durchmesser Objektiv mit kurzer Arbeitsabstand zum Bild des Schiffes ausgestattet. Darüber hinaus können ausgewählte Agonisten und / oder Antagonisten eingesetzt zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die Zelladhäsion werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber Intravitalmikroskopie sind keine Beteiligung von invasiven Chirurgie und somit ein höherer Durchsatz erreicht werden kann. Diese Methode ermöglicht auch die Verwendung von lokalisierten Inhibitor Behandlung, um die gewünschte Gefäß während intravital nur ermöglicht systemische Inhibitor Behandlung.

Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Weltweit wird berichtet, dass etwa ein Viertel der Bevölkerung an Hypertonie leidet, welche den führenden biomedizinischen Risikofaktor für die Mortalität weltweit darstellt. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Leukozytenadhäsion an das Endothel in entnommenen unter Druck stehenden Gefäßen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Arteria carotis von einer Ratte oder Maus isoliert wird. Anschließend wird das Gefäß in einer Druckkammer befestigt.Der Behälter wird dann unter Druck gesetzt und eine Stunde lang bei einem gewünschten Druck inkubiert. Schließlich wird markiertes Vollblut durch den druckbeaufschlagten Behälter perfundiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Echtzeit-Adhäsion von Leukozyten an das Endothel über eine maßgeschneiderte ex vivo Gefäßkammer zeigen, die mit einer Präzisionspumpe, einer Servoeinheit und einem Fluoreszenzmikroskop gekoppelt ist.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie statischen Adhäsionsassays besteht also darin, dass die Leukozytenadhäsion in intakten, funktionellen Arterien unter Verwendung von Vollblut beobachtet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hypertonieforschung zu beantworten, beispielsweise den Einfluss eines hohen intraluminalen Drucks auf die Entzündung und dessen Beitrag zur Atherosklerose. Nach der Isolierung der Arteria carotis von 10 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten sowie der Vorbereitung und Druckbeaufschlagung der Perfusionskammer wird das Gefäß unter einem Stereomikroskop montiert, indem zunächst schwarze Polyesterfäden auf jede Kanüle gelegt werden, das Gefäß in das Bad überführt und dann ein Viertel des Gefäßes auf die P1-Kanüle aufgesetzt wird.Achten Sie darauf, den Gefäß mit einer mit Krebs-Puffer gefüllten Spritze nicht zu beschädigen. Spülen Sie überschüssiges Blut vorsichtig durch den P-eins-Transducer aus dem Gefäß. Schließen Sie P eins gegenüber der Kammer ab.Befestigen Sie das Gefäß mit der Polyesternacktschleife an der P-eins-Kanüle. Bringen Sie die Kanülen und Kanülenhalter näher zusammen, um sie an der P-zwei-Kanüle zu montieren. Montieren Sie das distale Viertelende des Gefäßes auf die P-zwei-Kanüle.Befestigen Sie es mit einer Polyester-Schlaufe, um den Druck in dem Gefäß zu erhöhen. Stellen Sie die Kanülenhalter so ein, dass keine Biegung oder Dehnung des Gefäßes auftritt, während P eins und P zwei gegenüber der Kammer geschlossen sind. Schalten Sie den Druckregler von automatisch auf manuell.Überprüfen Sie am Druckservo, ob innerhalb von 10 Sekunden kein Druckabfall auftritt. Ein Druckabfall weist auf eine Leckage hin, und die Verbindungen sowie der Wandler müssen befestigt werden, um eine druckdichte Abdichtung zu gewährleisten. Stellen Sie den Druckservo wieder auf automatisch ein, öffnen Sie dann P zwei zur Kammer unter dem Mikroskop und beobachten Sie die Dilatation des Gefäßes.Wenn der Hahn zur Kammer geöffnet ist. Schalten Sie den Druckregler auf manuell. Überprüfen Sie erneut, ob ein Druckabfall auftritt.Wenn ein Druckabfall anhält, ist das System nicht druckdicht und es befindet sich wahrscheinlich ein Loch im Behälter. Wechseln Sie zurück auf automatisch und öffnen Sie P eins zur Kammer. Überprüfen Sie bei manueller Einstellung, ob der Druck stabil bleibt.Wenn stabil, erhöhen Sie die Einstellung auf zwei, wodurch der Behälter auf 40 Millimeter Quecksilber druckbeaufschlagt wird. Schalten Sie auf automatisch und beobachten Sie den Behälter unter dem Mikroskop. Falls erforderlich, stellen Sie den Kanülenhalter so ein, dass keine Biegung des Behälters in der manuellen Einstellung auftritt.Überprüfen Sie die Lecks. Erhöhen Sie dann die Einstellwerte schrittweise, wobei einer der Schalter zwischendurch auf automatisch gestellt wird, um das Gefäß unter dem Mikroskop zu beobachten, bis der gewünschte Druck erreicht ist. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, bewegen Sie die Kammer zum Stereomikroskop.Verbinden Sie die Temperaturregelung, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Anschließend schließen Sie die peristaltische Pumpe und den Aspirator an, um das Krebs-Pufferbad frisch zu halten. Inkubieren Sie das unter Druck stehende Gefäß eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Überprüfen Sie regelmäßig auf Lecks. Kennzeichnen Sie 7,5 Milliliter vorbehandeltes, als Ganzblut gesammeltes Blut mit fluoreszierendem Farbstoff im Dunkeln. Anschließend 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Sammlen Sie das Blut in einer Spritze, entfernen Sie eventuelle Luftblasen und befestigen Sie sie an einer Spritzenpumpe mit einer Heizjacke, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Schließen Sie den P-eins-Transducer zur Kammer und verbinden Sie die Spritze und die Abfallleitung. Spülen Sie das Blut mit 1000 Mikrolitern pro Minute durch die Abfallleitung, um Luftblasen zu entfernen, und öffnen Sie P eins zur Kammer. Der Druckservo stellt sich automatisch ein, um den gewünschten Druck aufrechtzuerhalten, und perfundiert das Blut mit 100 Mikrolitern pro Minute. Mit einem an eine digitale Kamera gekoppelten Fluoreszenzmikroskop werden zwei Felder des perfundierten Gefäßes zu mehreren Zeitpunkten jeweils 15 Sekunden lang aufgezeichnet. Hier sind repräsentative Bilder von Leukozyten dargestellt, wobei Leukozyten dann als an das Endothel angeheftet gelten, wenn sie sich 10 Sekunden lang nicht bewegen. Bei Videoaufnahmen in Dauerschleife können die Zellen als Durchschnitt pro Feld gezählt werden, wobei sowohl niedriger als auch hoher Druck eine gewisse Adhäsion verursacht.Bei höherem intraluminalen Druck wird ein signifikanter Anstieg der Leukozytenadhärenz beobachtet. Dies wird in diesem Diagramm quantitativ dargestellt, wobei eine größere Anzahl von Zellen pro Feld bei 120 im Vergleich zu 80 Millimeter Quecksilber haften bleibt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie PCR und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Gen- und Proteinausprägung von Adhäsionsmolekülen zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Dieses Video zeigt einen auf Laminarströmung basierenden Assay zur Charakterisierung der Interaktion von Leukozyten und zellulären Partnern wie Endothelzellen. Diese Methode liefert dynamische Einblicke in die Adhäsion, Deadhäsion und Transmigration von Leukozyten, wenn sie über eine intakte und konfluente Schicht von Gefäßzellen perfundiert werden.

Ein Laminar-Flow-basierter Assay zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Hier stellen wir ein Protokoll, das die Ermittler Leukozytenrekrutierung Dynamik ex vivo durch Verbinden einer Kammer mit Endothelzellen stamm Adhäsionsmolekülen auf das Kreislaufsystem der Maus beschichtet beurteilen können. Dieses Verfahren bietet deutliche Vorteile, da es eine Leukozyten-Beurteilung nach relativen biologischen Bedingungen.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Lernen Sie die Visualisierung der Leukozytenadhäsion an das Endothel in druckbelasteten Gefäßen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung unter physiologischen Bedingungen und liefert Erkenntnisse über Entzündungsmechanismen bei Hypertonie.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

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