Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Nachweis von Neuroviren in extrahierter RNA in einem Schritt Echtzeit-R-T-P-C-R mit spezifischen TECHMAN-Sonden. Aber heute werden wir über Neuroviren sprechen. Das ist in Lima, Peru und es ist eine Gruppe der Universität und auch der Johns Hopkins University.

Es stellt sich heraus, dass das Norovirus wahrscheinlich eine der vernachlässigten Ursachen für Durchfall ist. Unsere Gruppe hat herausgefunden, dass das Norovirus nach dem Coronavirus an zweiter Stelle steht, wenn es um die Krankenhausaufenthalte von Kindern wegen Durchfall und auch um die bevölkerungsbezogene Anzahl von Durchfallfällen geht. Warum wurde das NEUROVIRUS also noch nicht diagnostiziert?

Nun, der Grund dafür ist, dass es sich um ein RNA-Virus handelt und wir es nicht kultivieren können, also braucht es spezielle molekularbiologische Methoden, um zu diagnostizieren. Diese Methoden, die wir verwenden, sind R-T-P-C-R, und dies wird zeigen, wie man das R-T-P-C-R verwendet und diagnostiziert, um Neuroviren zu diagnostizieren. Eigene Ciag GUINE-Methode Boom etal 1989 verwendeten wir eine hauseigene G GUINE ATE-Methode zur Extraktion von viraler RNA für Stuhlproben.

Diese Methode ist eine Alternative zum kommerziellen ca amp viralen RNA-Kit. Beide Methoden basieren auf den Nukleinsäurebindungseigenschaften von Siliziumdioxidpartikeln. In Kombination mit den Anti-Nuchase-Eigenschaften von G Guad Dium Bio NA wird eine Kieselsäuresuspension für die RNA-Extraktion hergestellt.

Um die Kieselsäurepartikel herzustellen, nehmen Sie 30 Gramm Silikondioxid, fügen Sie 250 Millimeter demineralisiertes Wasser hinzu und suspendieren Sie das Silikon durch Schütteln. Nach 24 Stunden Sedimentation entfernen Sie 215 Milliliter des Supinats und portionieren es durch Ansaugen bei 250 Millilitern demineralisiertem Wasser und suspendieren das Silikon erneut durch Schütteln. Nach weiteren 24 Stunden wird das Supinat durch Absaugen entfernt und der pH-Wert der Kieselsäuresuspension mit Salzsäure und Suspension von Kieselsäure in Glasflaschen und Autoklavenextraktion mit g guin und Kieselsäure auf pH 2,0 eingestellt.

Wir werden uns nun mit der Extraktion von viraler RNA unter Verwendung der in einem vorherigen Schritt hergestellten Kieselsäurepartikel befassen. Bis zur Verwendung bei minus 70 Grad Celsius lagern. Um eine 10%ige Stuhlsuspension herzustellen, nehmen Sie etwa 0,1 Gramm Stuhl und vervollständigen Sie ihn vor der Extraktion mit einem Milliliter PBS.

Die Proben mit niedrigerer Last wirbeln fünf Sekunden lang vor und zentrifugieren sie dann 10 Minuten lang bei 4.000 U/min. Bei jeder Reaktion wird eine Neurovirus-positive Stuhlprobe als Positivkontrolle und DEPC-behandeltes Wasser in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Mischen Sie Folgendes, einen Milliliter L-Sechs-Puffer, 20 Mikroliter der vorbereiteten Kieselsäurepartikel und 200 Mikroliter Stuhlextrakt.

Kurz vortexen und die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. 15 Sekunden lang zentrifugieren. Waschen Sie dann das Pellet zweimal mit Puffer L zwei, dann zwei Wäschen mit 70 % Ethanol und einmal mit Säure.

Trocknen Sie das Pellet in einem trockenen Heizblock bei 56 Grad Celsius für fünf Minuten. Hydratisieren Sie die RNA im Kieselsäurepellet durch Zugabe von 50 Mikrolitern RNA-freiem destilliertem Wasser. Fügen Sie einen Mikroliter RNA-Sündenwirbel hinzu und lassen Sie ihn 15 Minuten lang bei 56 Grad Celsius stehen.

Zentrifüßler drei Minuten lang bei voller Geschwindigkeit und sammeln Sie eine Supinat-Temperatur, die die RNA enthält. Quantifizieren Sie die Proben mit der Non-Drop-Technik und lagern Sie die extrahierte RNA bei minus 70 Grad Celsius. Bis zur kommerziellen Extraktion von viraler RNA

Wir werden nun die RNA-Extraktion aus dem Stuhl mit der kommerziell erhältlichen viralen RNA kay amp demonstrieren. Das Kit enthält die folgenden Kieselgel-MinPin-Säulenpuffer, A-V-L-A-W, one a W2, A VE und leafly carrier RNA. Kurz. Die Vorgehensweise ist wie folgt.

Mischen Sie einen Teil des Puffers A VL mit Träger-RNA und Vortex-Rohr bei der Lösung in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 114 Mikrolitern Stuhlsuspension und mischen Sie es durch Nachkriegstexting. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben.

Fügen Sie den Proben Ethanol hinzu und mischen Sie sie 15 Sekunden lang, indem Sie Nachkriegstexte senden. Dann kurz zentrifugieren, die Lösung in einem Röhrchen mit zwei minimalen Auffangröhrchen auf die Schleudersäule auftragen. Fuge ziehen.

Setzen Sie dann die Schleudersäule in ein neues Auffangröhrchen ein. Waschen Sie die Säule mit gebundener RNA unter Verwendung des Puffers A, W und Puffer ohne Träger-RAN-Zentrifuge. Legen Sie die Säule in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und beobachten Sie die Säule mit Puffer.

Eine W2-Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit platziert die Stiftsäule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert mit voller Geschwindigkeit. Und erhöhen Sie die RNA mit Puffer und VE, lagern Sie virale RNA bei minus 70 Grad Celsius bis zum Nachweis von Neuroviren in extrahierter RNA durch einen Schritt Echtzeit-PCR mit spezifischen Techman-Sonden, um eine Mausmischung für Genogruppe eins und Dina Gruppe zwei herzustellen, halten Sie Ihre Enzym-RT-Mischung während des Assays auf Eis. Das Set enthält die folgende PCO-Wasserbeherrschung, zwei Eier, Primer und Sonden für Dina.

Primer der ersten Gruppe und Sonde für Dina Gruppe zwei. Und schließlich das Enzym RT Mix Vortex H Reagenz vor der Verwendung QU zu PCR Wasser, der Mastermix zwei X Primer Koks G, einen Vorwärts- und Rückwärtsvers und Sondenring eins A und ein B für UniGroup. Ein Muskelmix und Grundierung COG G zwei für VA Vers und Sonde.

Ring zwei für den Mastermix der Theo Group zwei. Und schließlich fügst du ein Enzym artix zu beiden Muskelmischungen der INO-Gruppe hinzu. Vortex und alco 10 Mikroliter des entsprechenden Muskelmixes in die Reaktionsvertiefungen geben.

In einem anderen Schrank werden fünf Mikroliter unverdünnte RNA, fünf Mikroliter RNA, G eins und G zwei Positivkontroll-RNA und fünf Mikroliter Negativkontrolle zu den entsprechenden Reaktionsrädern gegeben. Zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang bei 6.000 g. Im ersten Schritt zeigt die Software die erweiterte Einrichtung.

Und im Eigenschaftenbildschirm des Experiments wird das Experiment als Norovirus identifiziert. Der Experimenttyp ist die Anwesenheit oder Abwesenheit auf dem Zielbildschirm. Geben Sie den Namen des Ziels, das Sie nachweisen möchten, in die PCR-Reaktionsplatte ein.

Gina, Gruppe eins und zwei Reporterin Fam und Quencherin Tamara auf dem Proben- und Replikationsbildschirm. Geben Sie die Anzahl der Proben sowie der Positiv- und Negativkontrollen auf der Reaktionsplatte ein und wählen Sie dann aus, welche Proben oder welche Zielrichtung für die In-Run-Methode eingerichtet werden sollen. Zuerst wird eine reverse Transkription bei 50 Grad Celsius für die Synthese komplementärer DNA durchgeführt.

Erhöhen Sie dann die Temperatur auf neun bis fünf Grad Celsius, um eine Heißstart-Polymerase zu aktivieren. Beginnen Sie das Radfahren nach Dauer bei neun bis fünf Grad Celsius, gefolgt von einem kombinierten Knie- und Verstärkungsschritt bei 60 Grad Celsius. Wiederholen Sie einen Zyklus vier- bis fünfmal und kehren Sie zur Plattenaufstellung zurück.

Klicken Sie auf Vorlage speichern, und speichern Sie das Experiment. Klicken Sie auf Ausführung starten. Auf dem Amplification-Plot-Bildschirm können Sie die Sample-Verstärkung anzeigen, während Ihr Gerät während eines Laufs eingefrorene Daten sowie den Plot-Kontrast sammelt.

Normalisierte Tauchfluoreszenz und Zykluszahl. In den ersten Zyklen der PCR ändert sich das Fluoreszenzsignal kaum. Dies definiert die Baseline.

Ein Anstieg der Fluoreszenz um die Grundlinie deutet auf den Nachweis eines akkumulierten Ziels hin. Um die Grundlinie sollte ein fester Fluoreszenzschwellenwert festgelegt werden. Der Parameter CT-Schwellenwertzyklus ist definiert als die fraktionale Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz den festen Schwellenwert überschreitet.

Das Amplifikationsdiagramm-Screening ist nützlich für die Identifizierung und Untersuchung abnormaler Amplifikationen, wie z. B. erhöhte Fluoreszenz in negativen Kontrollvertiefungen und Abwesenheit von nachweisbarer Fluoreszenz bei einem erwarteten Zyklus. Die Kit-Methode ist zuverlässig, erfordert aber einen enormen Zeit- und Ressourcenaufwand. Hier haben wir eine ebenso zuverlässige Methode gezeigt, die kostengünstig ist und in den Ländern leicht verfügbare Reagenzien verwendet, wobei die Abhängigkeit von im Ausland gekauften Materialien umgangen wird, was letztendlich zu einer leichter zugänglichen Diagnose und schnellen Behandlung der häufigsten viralen Ursachen von Gastroenteritis bei Kindern führen wird. Unter Verwendung der wirtschaftlichen hauseigenen Methode zur Isolierung von Nukleinsäuren, die ähnliche Ergebnisse erzielten wie diese.

Erhältlich mit dem kommerziellen Kit von Kerogen, zusammen mit dem TAC MAN, R-T-P-C-R, das in unserem Labor entwickelt wurde. Wir können ein breites Spektrum an Neurovirusinfektionen nachweisen. Der Assay hat sich für die Routinediagnostik als nützlich erwiesen, da er die Verarbeitung des Produkts nach der Amplifikation überflüssig macht und somit die Zeit des Assays verkürzt.

Neben der Diagnose kann das Protokoll auch zur Klärung der Epidemiologie der Neurovirusinfektion verwendet werden und ist somit nützlich für die Kontrolle der öffentlichen Gesundheit dieser Krankheit.