Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology

Dieses Verfahren demonstriert eine neuartige Methode zur Detektion und Quantifizierung des zeitabhängigen Verlusts der Knochendichte der Hintergliedmaßen bei der Maus nach einer Rückenmarksverletzung. Dies wird erreicht, indem zunächst unter sterilen und gemäß ALAC genehmigten Bedingungen eine transversale Rückenmarksverletzung an einer anästhetisierten Maus durchgeführt wird. Nach einer Erholungsphase wird das Tier erneut anästhesiert, und Röntgenaufnahmen der Tibia und Fibula beider rechter und linker Hintergliedmaßen werden angefertigt.

Dies wird wöchentlich bis zu 40 Tage nach der Verletzung durchgeführt. Anschließend erfolgt eine Bildanalyse der Röntgenaufnahmen. Der letzte Schritt besteht in der postmortalen Beurteilung der Knochendichte an entnommenen Hinterbeinknochen.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie eine Rückenmarksverletzung einen schnellen und fortschreitenden Verlust der Knochendichte in den Hintergliedmaßen der Maus verursacht. Diese neuartige Methode bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung und verwendet dabei geringere Dosen an Röntgenstrahlen als andere bildgebende Verfahren. Osteoporose ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die Menschen mit Rückenmarksverletzung betrifft.

Was wir vorschlagen, ist eine neuartige Methode für Tierversuche zur Rückenmarkverletzung, die es einem Forscher ermöglicht, über lange Zeiträume hinweg den Knochenverlust im Zusammenhang mit Osteoporose longitudinal zu verfolgen. Dies ist aus zwei Gründen wichtig. Erstens wird dadurch die Möglichkeit geschaffen, die Mechanismen zu untersuchen, die die Entstehung der Osteoporose beeinflussen.

Der zweite Vorteil besteht darin, dass es uns eine Möglichkeit bietet, neue Interventionen zu testen, die darauf abzielen, die Entwicklung einer Osteoporose bei Patienten mit Rückenmarksverletzung entweder zu verhindern oder möglicherweise rückgängig zu machen. Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Rückenmarksverletzung verursachte Osteoporose ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise den altersbedingten Knochenschwund bei postmenopausalen Frauen sowie andere traumabedingte Abnahmen der Knochendichte. Knochenschwund infolge von Extremitätenfehlbelastung aufgrund von Immobilisation nach Fraktur oder anderen Verletzungen kann während des Heilungsprozesses zu einem erheblichen Knochenverlust führen. Die Anwendung der longitudinalen Ganzkörper-Röntgenbildgebung mit niedriger Dosis könnte neue Ansätze für die Entwicklung von Therapien eröffnen, die darauf abzielen, diese Probleme zu minimieren oder zu verhindern.

Führen Sie die Operation zur Rückenmarksverletzung gemäß den Sander-Verfahren und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des örtlichen institutionellen Tierversuchsausschusses durch. Beginnen Sie dann am Tag 10 nach der Rückenmarkoperation und setzen Sie die Untersuchung in Abständen von 10 Tagen bis zum Tag 40 fort. Untersuchen Sie rechtes und linkes Femur sowie Tibia lebender, anästhesierter Tiere mit transversaler Rückenmarksverletzung und ungeverletzter altersgematchter Kontrolltiere durch Abtastung mit dem IVUS-Lumina XR-System. Vor dem Scannen initialisieren Sie das Lumina XR-Gerät, um der internen Kamera zu ermöglichen, die Betriebstemperatur von minus 90 Grad Celsius zu erreichen.

Platzieren Sie ein anästhesiertes Tier auf die Plattform innerhalb des Lumina xr. Danach setzen Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung ein, um sowohl den Femur- als auch den Tibialbereich scharf stellen zu können. Überprüfen Sie, ob das Tier korrekt im Sichtfeld positioniert ist.

Öffnen Sie gegebenenfalls die Tür und positionieren Sie das Tier neu. Die korrekte Positionierung des Tieres ist hier dargestellt. Sobald das Tier richtig positioniert ist, kann die Röntgenfunktion ausgeführt werden.

Wählen Sie aus der Energieliste eine für das Tier geeignete Energie aus. Öffnen Sie dann das Bedienfeld. Aktivieren Sie die Röntgenfunktion, indem Sie Röntgen anhaken, und nehmen Sie das Röntgenbild auf.

Der gesamte Femur und die Tibia sollten wie hier gezeigt sichtbar sein. Da die Living-Image-Software standardmäßig transformierte Röntgenbilder anzeigt, stellen Sie sicher, dass rohe Röntgenbilder angezeigt werden, indem Sie das Menü für Korrektur-Filterwerkzeuge aufrufen und das Häkchen neben Röntgenabsorption entfernen. Die Rohbilddaten werden automatisch auf der Festplatte gespeichert.

Repräsentative TIFF-Dateien werden ebenfalls gespeichert. Nach der Bildgebung wird die Maus anschließend in ihren Heimkäfig zurückgebracht und unter Beobachtung des Untersuchers zur Erholung freigegeben. Der Vorgang wird dann mit der nächsten Maus wiederholt.

Öffnen Sie zunächst die Software, indem Sie im erscheinenden Dialogfeld doppelt auf das Symbol „Living Image“ klicken. Wählen Sie den gewünschten Ordner aus und klicken Sie auf „OK“. Laden Sie ein Röntgenbild, indem Sie auf die Schaltfläche „Durchsuchen“ klicken.

Der Live-Bild-Browser zeigt die ausgewählten Daten zusammen mit der Benutzerkennung an. Beschriftungsinformationen und Kamera-Konfigurationsinformationen. Um Daten zu öffnen, doppelklicken Sie auf die Datenzeile. Das Bild und die Werkzeugpalette werden angezeigt.

Die offenen Daten werden im Browser in Blau hervorgehoben. Klicken Sie anschließend auf ROI-Werkzeuge. Öffnen Sie in der Werkzeugpalette unter ROI-Werkzeuge die Dropdown-Liste Typ und wählen Sie Mess-ROI aus.

Um die drei in diesem Experiment verwendeten ROIs zu laden, klicken Sie auf das quadratische Symbol und laden Sie Quadrate. Messen Sie mithilfe eines Lineals die Länge des Femurs und passen Sie die Länge der beiden Quadrate so an, dass sie ein Achtel der gesamten Femurlänge beträgt. Stellen Sie die Breite der Quadrate auf ein Vierundzwanzigstel der gesamten Femurlänge ein.

Verwenden Sie nun das Lineal, um ein Achtel der Distanz vom proximalen Femurende aus zu messen, und positionieren Sie ein Rechteck so, dass es in dieser Position zentriert ist. Verschieben Sie das zweite Rechteck zum distalen Femurende und platzieren Sie es so, dass es mittig innerhalb der trabekulären Region des Knies liegt. Messen Sie anschließend die Länge der Tibia.

Passt die Länge der Box auf ein Achtel der gesamten Tibialänge an. Stellt die Breite auf ein Dreißigstel der gesamten Tibialänge ein. Platziert die Box abschließend zentriert und im Abstand von einem Achtel der gesamten Tibialänge vom proximalen Tibiaende, wie hier dargestellt.

Klicken Sie anschließend auf das Messsymbol. Die ROI-Intensitätsmessungen erscheinen im Röntgenbild und die ROI-Messtabelle wird angezeigt. Exportieren Sie diese Tabelle an den gewünschten Speicherort als CSV-Datei. Dadurch kann die Tabelle in Excel geöffnet werden.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit allen gespeicherten Bildern, die analysiert werden sollen. Konsolidieren Sie abschließend alle Daten in einem einzigen Excel-Arbeitsblatt. Die statistische Signifikanz wird mittels eines Student'schen T-Tests unter Verwendung von Software wie Microsoft Excel oder Sigma Plot 11.0 bestimmt. Falls gewünscht, können die Ergebnisse mit denen eines postmortalen Analysen der Knochendichte unter Verwendung der Dual-Energy-X-Ray-Absorptiometrie anhand standardisierter Protokolle für diese Methode verglichen werden.

Der relative Knochendichteverlust einer Maus, des Schienbeins und des Oberschenkelknochens nach einer Rückenmarkverletzung im Vergleich zu naiven Mäusen ist mit der oben beschriebenen Methode nachweisbar. Diese Abbildung zeigt den Verlust der Knochendichte nach einer Rückenmarkverletzung im proximalen Schienbein 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung. Im Vergleich zu altersentsprechenden naiven Tieren ist bereits nach 10 Tagen ein signifikanter Rückgang der Knochendichte des Schienbeins um 12 % zu verzeichnen, der nach 40 Tagen bis zu 15 % betragen kann.

Hier sehen wir den Knochendichteverlust nach einer Rückenmarksverletzung im proximalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung. Im Vergleich zu altersentsprechenden unbehandelten Kontrollen wurde 40 Tage nach der Verletzung ein um 7 % stärkerer Knochendichteverlust im proximalen Femur beobachtet. Dieses Diagramm zeigt den Knochendichteverlust nach einer Rückenmarksverletzung im distalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung.

Im Vergleich zu altersentsprechenden naiven Kontrollen konnte ein Verlust der Knochendichte im distalen Femur bereits 10 Tage nach der Verletzung beobachtet werden und blieb während des restlichen Experiments bestehen. Dieses repräsentative Bild der Dual-Energie-Röntgenabsorptionsgeometrie-Daten zeigt die Knochenmineralgehalte und die Knochenmineraldichte. Die entnommenen Femora wurden 40 Tage nach der Rückenmarksverletzung analysiert.

Um die Wirksamkeit der in diesem Protokoll demonstrierten Methode mit anderen derzeit verfügbaren Methoden zu vergleichen, zeigt diese Abbildung die Analyse der Knochenmineraldichte mittels Dual-Energy-X-ray-Absorptiometrie in Gramm im Femur von Mäusen mit Rückenmarkverletzung 40 Tage nach der Operation im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrolltieren. Es wurde ein signifikanter Rückgang der Knochenmineraldichte um 12 % bei den Mäusen mit Rückenmarkverletzung im Vergleich zu den naiven Tieren beobachtet.

Hier sehen wir eine Analyse der Knochendichte mittels Dual-Energie-Röntgenabsorptiometrie in Milligramm pro Quadratzentimeter im Femur von Mäusen mit Rückenmarkverletzung 40 Tage nach der Verletzung im Vergleich zu gesunden, altersentsprechenden Kontrolltieren. Der Verlust der Knochendichte änderte sich nicht signifikant, folgte jedoch einem ähnlichen Trend wie der Verlust des Knochenmineralgehalts. Dieser Vorgang kann in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden, aber denken Sie daran: Es ist wichtig, die Hintergliedmaßen korrekt zu positionieren.

Nach der Betrachtung dieses Videos sollten Sie eine Vorstellung davon haben, wie man eine longitudinale Beurteilung der Knochendichte an lebenden Tieren nach einer Rückenmarksverletzung mithilfe des Caliper Instruments Lumina XR-Geräts durchführt.