Name: Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie eine neuartige Methode zur longitudinalen Bewertung von Knochendichteverlust in Mäusen nach Rückenmarksverletzungen mittels Niedrigdosis-Röntgenbildgebung. Diese Technik ermöglicht präzise Verlaufsbeobachtungen über 40 Tage.

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Wir möchten sowohl Mission Connect und der Gillson-Longenbaugh Stiftung für die Bereitstellung der Mittel für dieses Projekt bedanken. Wir möchten auch Dr. Catherine Ambrose für ihre kritische Beratung bedanken und die Verwendung von ihr DXA Geräte. Schließlich möchten wir Dr. Kaori Ono, Department für Integrative Biologie und Pharmakologie, für ihre Anregungen danken DXA Oberschenkelknochens Analyse.

1. Maus Rückenmark durchtrennt Modell <ol><li> Erwachsene, männlich, C57BL6 Mäusen (ca. 20-25 g) werden betäubt mit einer Kombination von Ketamin (200 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Alle chirurgischen Eingriffe sind in einem institutionellen, IACUC genehmigten OP unter sterilen Bedingungen durchgeführt. </li><li> Einmal tief narkotisiert, ist das Fell des Rückens getrimmt mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Die rasierten Rücken wird zuerst geschrubbt mit einer Jod-Lösung von 70% Ethanol gefolgt. </li><li> Vor der ersten Einschnitt ist der Bereich des Rückens zu eingeschnitten werden zunächst mit einem Lokalanästhetikum (Marcain) in einer Konzentration von (0,25%, &lt;1ml/kg) infiltriert, um postoperative Schmerzen zu minimieren. </li><li> Mit einer kleinen Schere, eine kleine Öffnung in die Haut rund um den L2-Bereich gemacht. Diese Öffnung ist mit dem gleichen Satz von Schere erweitert, die sich in Längsrichtung auf die T2-Bereich. Die Ränder der Haut sind dann auseinander über die Verwendung von Bulldogklemmen statt. </li><li> Micro-Scheren werden dann verwendet,klare Muskelgewebe aus dem dorsalen Lamina bei Brust-Stufe 8 (T8). T8 identifiziert als in Kuh-und Wrathall (1998) 10 beschrieben werden. Kurz gesagt, kann T13 durch seine dorsal Dornfortsatz identifiziert werden. Mit einem Paar # 5 Dumont Pinzetten, kann die letzte Rippe palpiert / identifiziert werden und zurück zu T8 gezählt. Einmal gelöscht, Knochen Rongeure werden verwendet, um eine dorsale Laminektomie bei T8 durchzuführen. </li><li> Vollständige Spinal Durchtrennung Läsion: Sobald das Rückenmark bei T8 ausgesetzt, eine zusätzliche Reihe von sterilisierten Micro-Scheren werden verwendet, um das Rückenmark in der Ebene senkrecht zur Längsachse des Kabels sever unter einem Operationsmikroskop. Wir verwenden # 5 Dumont Pinzette vorsichtig aus dem einen Pol des Rückenmarks, die Vollständigkeit der Läsion zu bestätigen. </li><li> Nach Durchtrennung der Wirbelsäule, ein kleines Stück sterile Gelschaum in steriler Kochsalzlösung getränkt (0,9%) wird vorsichtig in die Läsion Hohlraum zur Blutstillung zu fördern platziert. </li><li> Ein zusätzliches Stück Gelschaum wird dann über die exponierte Spin platziertal Kabel. Die Haut wird dann mit einer sterilen, Edelstahl-chirurgische Klammern geschlossen. Themen werden dann in ihre Käfige zurück, platziert auf einem Papiertuch, um eine Aspiration von Einstreu zu verhindern und wärmte mit einem Heizkissen für einen Zeitraum von ca. 12 Stunden. Themen sind auch mit Hydrogel-Packs (ClearH2O) und Futtertabletten auf dem Boden ihrer Käfige in der frühen Wiederherstellung zur Verfügung gestellt. Verletzte Personen sind in der Lage, den Zugang Essen / Wasser in ihre Käfige einmal aus der Narkose erholt. </li><li> Alle verletzten Personen erhalten zweimal täglich manuelle Blase Evakuierungen (bei ca. 12 Stunden) unter Verwendung einer Modifikation des manuellen Verfahrens von Crede für die Dauer der Studie (40 Tage). </li><li> Verletzte Mäuse auch mit zweimal täglich intraperitoneale Injektionen von 0,9% iger Kochsalzlösung für drei Tage (0,5 cc) bereitgestellt, um zu halten Feuchtigkeit, und zweimal tägliche Injektionen von dem Opiat Buprenorphin (0,05 mg / kg) zur Kontrolle postoperativer Schmerzen für einen Zeitraum von 5 Tage. Wenn Tiere zeigen Anzeichen of Schmerzen nach der ersten 5 Tage Zeit, sie würden zusätzliche Buprenorphin (0,05 mg / kg) täglich zu empfangen, bis Anzeichen von Schmerzen (eingeschränkter Mobilität, gebeugt Statur, das Versagen der Bräutigam, Stimmgebung bei der Handhabung) gelöst sind. </li></ol> 2. Longitudinal Beurteilung der Knochendichte mit dem IVIS Lumina XR auf der gleichen Kohorte von spinal-durchtrennt Mäusen <ol><li> Beginnend am Tag 10 post-SCI-und Weiterbildung in Intervallen von 10 Tagen bis zum Tag 40, untersuchten wir rechts und links Oberschenkel-und Schienbein in lebenden, narkotisierten Patienten (Durchtrennung SCI und unverletzt Alter passenden Kontrollen). </li><li> Am Tag des Scannens, wurden die Probanden in ihre Käfige aus der Institution Vivarium Bereich in den Raum, in dem die Caliper IVIS Lumina XR untergebracht übertragen. Alle Fächer werden dann narkotisiert mit dem gleichen Ketamin / Xylazin Cocktail zuvor bei der Lieferung von SCI verwendet. Dieser Cocktail garantiert einen Zustand der Betäubung für einen Zeitraum von 1 bis 1,5 Stunden; ausreichend für die Dauer der scannIng. Verfahren. </li><li> Die Ermittler initialisiert die Lumina XR-Gerät und ermöglicht die interne Kamera auf Betriebstemperatur (-90 ° C) (~ 10 Minuten) zu erreichen. </li><li> Einmal betäubt, ist das Thema (Durchtrennung oder Kontrolle) vorsichtig auf das Tier-Plattform innerhalb der Lumina XR platziert. Ein hoher Vergrößerung Objektiv ist in das Gerät eingeführt, um den Fokus auf beiden Femur-und Tibia-Regionen (Sehfeld 2.4X2.4cm mit hoher Vergrößerung Objektiv) zu ermöglichen. Wenn das Motiv nicht ordnungsgemäß außerhalb des Sichtfeldes positioniert ist, wird die Tür geöffnet und das Thema neu positioniert, bis die linke oder rechte Hinterbein zentriert ist (siehe Abbildung 2a für die richtige Platzierung der hinteren Gliedmaßen). </li><li> Einmal richtig positioniert ist, kann die X-ray-Funktion ausgeführt werden. Treffen Sie eine Auswahl aus der Energie der Dropdown-Liste für Tiere (Living unterliegen, 35 Kv 100uA, gefiltert X-Rays) </li><li> Sobald das Tier in der richtigen Position, aktivieren Sie die X-ray-Funktion von Check-Kennzeichnung X-Ray in denBedienfeld. Erwerben Sie die X-ray image. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Ober-und Unterschenkels sichtbar sind (siehe Abbildung 2b). Raw-Bilddaten automatisch auf der Festplatte gespeichert. Vertreter. TIFF-Dateien werden ebenfalls gespeichert. Die Maus wird dann zu seiner eigenen Käfig zurück und durfte unter Prüfarztobservation erholen. Der Prozess wird dann mit dem nächsten Mausklick wiederholt. Hinweis: The Living Image Software zeigt verwandelt Röntgenbilder standardmäßig. Um rohe Röntgenbilder, entfernen Sie das Häkchen neben dem X-Ray Absorption in den Korrekturen / Filtering Tools. Wenn der X-ray-Daten für die Absorption wurde korrigiert, können Sie relativ Knochendichte durch den Vergleich der Signalintensitäten der Messung ROIs auszuwerten. Die ROI-Intensität mit zunehmender Gewebedichte. </li></ol> 3. Bildanalyse von IVIS X-ray-Scans <ol><li> Öffnen Sie die Software durch Doppelklick auf das Lebende Abbild Icon. </li><li> Laden Sie ein X-ray Bild, indem Sie die OK. The Living Bild-Browser zeigt die ausgewählten Daten zusammen mit der Benutzer-ID, Label-Information, und die Kamera Informationen zur Konfiguration. Zum Öffnen von Daten, führen Sie einen der folgenden Schritte aus: Doppelklicken Sie auf die Datenreihe, mit der rechten Maustaste auf die Daten ein und wählen Sie laden im Kontextmenü auf, wählen die Datenzeile und klicken Sie auf Laden, oder doppelklicken Sie auf das Bild. Die Bild-und Werkzeug-Palette angezeigt werden. Offene Daten sind in grün im Browser hervorgehoben. </li><li> Klicken Sie auf ROI-Tools in der Tool-Palette. In der ROI-Tools, wählen Measurement ROI aus der Dropdown-Liste. So laden Sie die 3 ROI ist in diesem Experiment verwendet, klicken Sie auf das quadratische Symbol und laden 3 Quadraten. </li><li> Mit einem Lineal, messen Sie die Länge des Oberschenkelknochens. Passen Sie die Länge von zwei der Quadrate zu 1 / 8 th der gesamten Femurlänge werden. Passen Sie die Breite der beiden Quadrate werden die insgesamt Femurlänge 1/24th. Mit Ihrer Lineal, messen 1 / 8 th der Abstand vom proximalen Ende des Oberschenkelknochens und verorten den Platz, so dass es innerhalb des Femur zentriert ist. Situate zweiten Platz, so dass es 1/4th der gesamten Femurlänge vom distalen Ende des Femurs (Abb. 3) liegt. Diese ROI können sowohl proximalen und distalen Femur Regionen zu messen. </li><li> Mit dem Lineal, messen Sie die Länge der Tibia. Passen Sie die Länge des dritten Platzes zu 1 / 8 th der gesamten Tibia-Länge sein. Passen Sie die Breite um 1 / 30 th der gesamten Tibia-Länge. Situate dem Platz so, dass zentriert ist und 1 / 8 th der gesamten Länge des Schienbeins Abstand vom proximalen Ende des Schienbeins (siehe Abbildung 3). </li><li> Klicken Sie auf den Messen Symbol (ein Bleistift und Lineal). Der ROI Intensitätsmessungen erscheinen im Röntgenbild und die ROI-Messungen Tabelle erscheint. Export dieser Tabelle to die gewünschte Position als. csv-Datei. Damit können Sie die Tabelle mit Excel zu öffnen. </li><li> Wiederholen Sie dies mit all Ihren gespeicherten Bilder. </li><li> Konsolidieren Sie alle Ihre Daten auf einem Excel-Arbeitsblatt. Statistische Signifikanz wurde mittels Student t-Test entweder mit Microsoft Excel oder SigmaPlot 11,0-Software (Systat Software) bestimmt. </li></ol> 4. Post-mortem-Analyse der Knochendichte: <ol><li> Nach der Übernahme der endgültigen Längs-X-ray-Scan innerhalb der IVIS Lumina XR sind Mäuse anschließend tief narkotisiert mit Beuthanasia (75 mg Pentobarbital / kg). Sobald tiefe Narkose erreicht ist, werden die Mäuse transkardial mit vereisten kalten perfundierten Phosphat-gepufferte mit heparain (40 mg / Liter) Kochsalzlösung exsanguinate. </li><li> Sobald entblutet, Verbrauchssteuern sowohl Oberschenkel. Achten Sie besonders darauf, so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen, denn diese erwiesen hat Dichtemessungen 11 beeinflussen. Wickeln Sie den Oberschenkel mit Wasser getränkten Gaze und an einem-20C bis Sie bereit sind, diese zu analysieren sind. </li></ol> 5. DXA-Analyse mit einem Hologic QDR 4000 Knochen Densitometer <ol><li> Thaw Gaze getränkt Oberschenkel-und Transfer zum Knochen Densitometer suite. </li><li> Kalibrieren Sie das Gerät gemäß dem Protokoll des Herstellers; sicherzustellen, dass die BMC-und BMD-Werte innerhalb der zulässigen Grenzen liegen. </li><li> Legen Sie eine Messing Kollimator in der Maschine. Dies ermöglicht dem Benutzer, um die Größe und den Winkel der Röntgenstrahl Begrenzung auf ein bestimmtes Ziel zu konzentrieren. </li><li> Tauchen Sie die aufgetauten Femur in eine Petrischale mit Wasser (Kondylen auf der linken Seite, mit dem Femur parallel zum Bett), und positionieren Sie es nur um das Recht des Lasers gefüllt. </li><li> Geben Sie eine Biografie (einen aussagekräftigen Titel, die zur Kennzeichnung von Tieren Informationen, Behandlung, etc. gehören) für den Oberschenkelknochen Sie sind im Begriff, zu scannen. </li><li> Geben Sie Scan aus der Auswahl-Menü, und wählen Sie dann RegionA hallo-res. Geben Sie Ihre Scan-Parameter: Ein Scan-Bereich von 2 x 0,7489 Zoll, mit 0,01 Zoll Zeilenabstand und 0,00499 Zoll Punkt-Auflösung. Hinweis: Überwachen Sie den Scan, während es im Gange ist. Da die Röntgenstrahlung Rasterabtastungen der Probe, zu überwachen, um sicherzustellen, dass genügend Wasser in der Kammer vollständig zu bedecken den Knochen Probe. </li><li> Geben Sie Analyze unter den Analysis-Auswahl-Menü. Folgen Sie den Anweisungen, um das gesamte Femur als ROI zu markieren. Ein Bericht Seite kommen mit der berechneten BMC (Gramm) und BMD (g / cm 2). </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte, um die verbleibenden Oberschenkel zu analysieren. </li><li> Konsolidieren Sie alle Ihre Daten auf einem Excel-Arbeitsblatt und statistische Analysen (t-Test). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die relative Knochendichte Verlust von einer Maus Tibia und Femur nach Verletzungen des Rückenmarks, wenn auf naive Mäuse im Vergleich nachweisbar ist mit der obigen Methode. Es gibt einen nachweisbaren signifikanten Abnahme der Knochendichte nachnur 10 Tage (12%, p &lt;0,0005), mit bis zu 15% Knochendichte Verlust auf 40 Tage (p &lt;0,0005, Abbildung 4). Knochendichte Verlust in den Oberschenkelknochen wurde bei 40 Tagen nach der Verletzung (7% sinken, p &lt;0,05, Abb. 5) beobachtet. Diese Ergebnisse liefern Beweise für die Verwendung von nicht-invasiven Röntgen-Bildgebung für die Längs-Beobachtung der Knochendichte zu ändern, nachdem Rückenmarksverletzungen. Um einen Vergleich der Wirksamkeit dieser Methode auf, was derzeit verfügbar; analysierten wir die ausgeschnittenen Oberschenkelknochen von diesen Mäusen 40 Tage nach der Verletzung mit DXA Bildgebung. Eine Darstellung der Datenausgabe kann in Abbildung 6 zu sehen. Wir fanden, dass es einen signifikanten Verlust an Knochendichte in der SCI-Mäuse im Vergleich zu naiv (12% sinken, p &lt;0,05, Abb. 7). Knochendichte nicht wesentlich geändert, aber einen ähnlichen Trend (Abbildung 8). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen in der Literatur gefunden; Picard et al beobachteten eine Rückgang von 13,5% (p &lt;0,001) in BMC, aber keine signifikanten decrLeichtigkeit in BMD (Picard 2008). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Experimental Timeline. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Vertreter Ausrichtung des linken Hinterbein-Schenkel:. A) Foto und b) x-ray. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. ROI Dimensionen und Orientierung innerhalb der Regionen des proximalen Femur und Tibia. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Knochendichte Verlust nach SCI in der proximalen Tibia 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) im Vergleich zu gleichaltrigen Naiven (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Knochendichte Verlust nach SCI im distalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) im Vergleich zu gleichaltrigen naiven Kontrollen (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM; * p &lt;0,01 bis 0,05; ** p &lt;0,001-0,01; *** p &lt;0,0001 bis 0,001; **** p &lt;0,0001. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Representative Bild von DXA-Daten zeigen, BMC und BMD-Ausgang. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. DXA Analyse der Knochendichte (Gramm) in den Oberschenkelknochen von SCI-Mäusen 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) vs gleichaltrigen Naiven (n = 5).Fehlerbalken stellen SEM; * p &lt;0,05. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. DXA-Analyse der Knochendichte (mg / cm 2) in den Oberschenkelknochen von SCI-Mäusen 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) vs gleichaltrigen Naiven (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM; kein signifikanter Unterschied.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Studie stellt eine neuartige, nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Dichte Veränderungen innerhalb der einzelnen Knochen (Schienbein und Oberschenkelknochen) in Längsrichtung, in einer einzigen Gruppe von Mäusen, mit dem Caliper IVIS Lumina XR Imaging-System. SCI produziert eine Abnahme der Knochendichte in beiden Oberschenkel-und Schienbein, wenn innerhalb einer einzigen Kohorte von spinal-durchtrennt Mäusen über einen 40 Tage-Test Zeitraum im Vergleich zu gleichaltrigen, unverletzt, Kontroll-Mäusen untersucht. Unsere Ergebnisse in den Oberschenkelknochen wurden bestätigt, post-mortem durch die Verwendung von DXA, was darauf hindeutet, dass die Anwendung des Instruments Caliper IVIS Lumina XR kann als ein sensibles Messinstrument dienen der langfristigen und progressive Wirkung der SCI auf Knochenverlust zu bewerten . Eine mögliche Nutzen für Forscher mit Hilfe dieses Systems ist die Fähigkeit, sich in Längsrichtung folgen der Entwicklung von pathologischen Veränderungen in der hinteren Extremität Knochen von Tieren nach SCI. Die Fähigkeit, eine einzige Kohorte über lange Zeiträume zu bewerten bietet strong Vorteile für die Ermittler in Bezug auf: 1) Kosten im Zusammenhang mit Tier kaufen und Langzeitpflege verbunden. Statt einer Studie erfordern eine große Anzahl von Tieren, die zu bestimmten Zeitpunkten geopfert werden, um zeitabhängige Veränderungen beurteilen müssen, können diese pathologischen Ergebnissen innerhalb der gleichen Kohorte über die gleiche Zeitspanne, 2) Variabilität befolgt werden: Neben Vergleich mit Kontrollgruppen, können die Ergebnisse innerhalb der einzelnen Kohorten von verletzten Personen generiert beurteilt und verglichen werden zwischen den Zeitpunkten für die gleiche Tiere über den Umfang der Studie; wieder, was sowohl intra-Variabilität der Tiere sowie die Notwendigkeit für größere Kohorten von Versuchspersonen. Während die Caliper IVIS Lumina XR hat uns wichtige Längs Informationen über die Entwicklung der SCI-induzierte Osteoporose, gibt es Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten: 1), während dieser Plattform hat uns erlaubt, hochauflösende X-ray dat erzeugena in das Hinterbein Knochen von Mäusen nach SCI, kann seinen Nutzen für kleine Nagetiere wie Mäuse beschränkt. Die maximale Höhe unterliegen innerhalb der Lumina XR erlaubt ist 2,8 cm. Alles, was über diese Höhe nicht erfolgreich abgebildet werden mit dem X-ray Komponente der Lumina XR. In unseren Händen hat dies unsere Fähigkeit, Ratten in der 200-250 Gramm Gewicht Studie ausgeschlossen. Zwar mag es möglich, Bild Ratten unter diesen Gewichtsbereich oder andere Nagetiere wie Hamster oder Rennmäuse, wird diese zusätzliche Prüfung durch das PI. 2) Gemeinsame Orientierung. Es ist wichtig, dass die Investigator sorgfältig arrangieren die Gliedmaßen in einer leicht reproduzierbaren Ausrichtung, erfolgreichen Vergleich zwischen Imaging-Sitzungen ermöglichen. Standardisierung von Gliedmaßen Platzierung wird es der Investigator die Generierung und Anwendung standardisierter ROI ist, die gespeichert und kann angewendet werden auf beide Fächer und Zeit. Insgesamt glauben wir, dass die IVIS Lumina XR eine hervorragende Plattform, mit der zu-Modell bietetdie Entwicklung von SCI-abhängigen Osteoporose bei Mäusen. Die Fähigkeit, Knochenschwund längs Studie innerhalb der gleichen Maus Kohorte wird es uns ermöglichen: 1) ein besseres Verständnis der zeitlichen Natur von Knochenschwund und Demineralisation nach SCI, 2) festzustellen, ob diese Veränderungen im Laufe der Zeit, 3 stabilisieren) zu erkunden, mit der Verfügbarkeit von sowohl transgenen und null Mauslinien, die Fähigkeit, die molekularen Mechanismen dieser pathologischen Veränderungen in einer reduktionistischen Weise, und 4) sehr wahrscheinlich der wichtigste Vorteil Studie beginnen, um neue Interventionen, die entweder verhindern, dass die Entwicklung von Osteoporose im Frühstadium testen von Verletzungen oder, umgekehrt solche Änderungen einmal Osteoporose bereits entwickelt hat. Schließlich ist die Lumina XR, neben der Bereitstellung ausgezeichneter X-ray Imaging Potenzial, können auch verwendet werden, um sowohl Biolumineszenz und Fluoreszenz-Signale in lebenden Tieren zu untersuchen. Man könnte sich leicht vorstellen, Einbeziehung der anderen Modalitäten innerhalb dieses Systems angeboten, bei einer mul Blickzahl von Faktoren, die Knochen Dynamik mechanistisch zu bestimmen folgenden SCI oder einer anderen Krankheit Prozess, führt zu Osteoporose.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Butler Schein Tiere Gesundheit </td><td> 001848 </td><td></td></tr><tr><td> Ketathesia (Ketamin Hydrochlorid) </td><td> Butler Schein Tiere Gesundheit </td><td> 023061 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Butler Schein Tiere Gesundheit </td><td> 037849 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacain </td><td> Butler Schein Tiere Gesundheit </td><td> 021801 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam; 7MM </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0085178 </td><td> Zur Förderung der Hämostase während Chirurgie </td></tr><tr><td> IVIS Lumina XR </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 135400 </td><td></td></tr><tr><td> ZFOV, 2,5 cm Bereich der Blick Objektiv </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 127285 </td><td> Absolut notwendig zuerzeugen hohe Vergrößerung X-ray Bilder von Knochen Struktur </td></tr><tr><td> QDR Knochen Densitometer </td><td> Hologic </td><td></td><td> Modell verwendet nicht mehr in der Produktion </td></tr></tbody></table>

longitudinal evaluation of mouse hind limb knochenverlust nach rückenmarksverletzungen mit novel, in vivo methodology

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Rückenmarksverletzung (SCI) wird oft von Osteoporose in der sublesional Regionen des Beckens und der unteren Extremitäten begleitet, was zu einer höheren Frequenz von Knochenbrüchen 1. Da diese Frakturen oft in Regionen, die normale sensorische Funktion verloren haben, auftreten, ist der Patient ein größeres Risiko einer Fraktur-abhängigen Erkrankungen, einschließlich des Todes. SCI-Dämpfung in beiden Knochenmineraldichte (BMD, g / cm 2) und Knochenmineralgehalt (BMC, g) ist die mechanische Nichtnutzung 2, aberranten neuronalen Signalübertragung 3 und hormonelle Änderungen 4 zugeschrieben. Die Verwendung von Tiermodellen der SCI-induzierten Osteoporose kann wertvolle Informationen über die Mechanismen der Entstehung von Osteoporose folgenden SCI sowie eine Testumgebung für die Generierung von neuen Therapien 5-7 (überprüft und in 8). Mausmodelle von SCI sind von großem Interesse, da sie einen reduktionistischen Ansatz zu Mechanismus-ba erlaubensed Beurteilung durch den Einsatz von null und transgenen Mäusen. Während solche Modelle wichtige Daten überlassen haben, gibt es noch einen Bedarf für die minimal-invasive, sichere, reproduzierbare und quantifizierbare Methoden zur Ermittlung des Umfangs der Knochenverlust nach SCI, vor allem im Laufe der Zeit und innerhalb der gleichen Kohorte von Versuchstieren, die Diagnose zu verbessern , Behandlungsmethoden und / oder Prävention von SCI-induzierte Osteoporose. Eine ideale Methode zur Messung der Knochendichte bei Nagetieren erlauben würde mehrere, sequentielle (im Laufe der Zeit) Forderungen an Low-Level von Röntgenstrahlung. Diese Studie beschreibt die Verwendung von einem neuen Ganzen-Tier-Scanner, der IVIS Lumina XR (Caliper Instruments), die zur Niedrig-Energie-(1-3 milligray (mGy)) mit hoher Auflösung, hoher Vergrößerung Röntgenbilder liefern kann der Maus Hinterbein Knochen im Laufe der Zeit folgende SCI. Signifikante Knochendichte Verlust war in den Schienbeinen von Mäusen um 10 Tage nach der spinalen Durchtrennung gesehen, wenn sie unverletzt, gleichaltrigen Kontrolle verglichen (naiv) Mäuse (13% zu verringern, p &lt;0,0005). Der Verlust der Knochendichte in den distalen Oberschenkelknochen war auch nachweisbar Tag 10 post-SCI, während ein Verlust von Dichte im proximalen Femur wurde erst 40 Tage nach der Verletzung (7% sinken, p &lt;0,05) nachweisbar. SCI-abhängige Verlust der Maus Femur Dichte wurde post mortem durch den Einsatz von Dual-Energy X-ray (DXA), die aktuelle &quot;Goldstandard&quot; für die Knochendichte-Messungen bestätigt. Wir erkennen eine 12% Verlust von BMC in den Oberschenkel von Mäusen 40 Tage nach SCI mit dem IVIS Lumina XR. Dieser Vergleich mit einem zuvor berichtet BMC Verlust von 13,5% von Picard und Kollegen, die DXA-Analyse auf Maus Oberschenkel post-mortem 30 Tage post-SCI 9 verwendet. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die IVIS Lumina XR ein neuartiges, high-resolution/high-magnification Verfahren zur Durchführung von Langzeit-, Längs-Messungen der hinteren Gliedmaßen Knochendichte in der Maus nach SCI bietet.

Ein Längs-Untersuchung von Knochenschwund in der Oberschenkel-und Schienbein von erwachsenen Mäusen wurde nach Verletzungen des Rückenmarks mit sequentieller low-dose X-ray-Scans durchgeführt. Tibia Knochenverlust wurde während der Studie festgestellt, während Knochenverlust in den Oberschenkelknochen wurde erst 40 Tage nach der Verletzung festgestellt.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology

Rückenmarksverletzungen (Spinal Cord Injury, SCI) gehen häufig mit Osteoporose in den sublesionalen Regionen des Beckens und der unteren Extremitäten einher, was zu einem höheren ...

Dieses Verfahren demonstriert eine neuartige Methode zur Detektion und Quantifizierung des zeitabhängigen Verlusts der Knochendichte der Hintergliedmaßen bei der Maus nach einer Rückenmarksverletzung. Dies wird erreicht, indem zunächst unter sterilen und gemäß ALAC genehmigten Bedingungen eine transversale Rückenmarksverletzung an einer anästhetisierten Maus durchgeführt wird. Nach einer Erholungsphase wird das Tier erneut anästhesiert, und Röntgenaufnahmen der Tibia und Fibula beider rechter und linker Hintergliedmaßen werden angefertigt.Dies erfolgt wöchentlich bis zu 40 Tage nach der Verletzung. Anschließend wird eine Bildanalyse der Röntgenaufnahmen durchgeführt. Der letzte Schritt besteht in der postmortalen Beurteilung der Knochendichte an entnommenen Hinterbeinknochen.Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie eine Rückenmarksverletzung einen schnellen und fortschreitenden Verlust der Knochendichte in den Hintergliedmaßen der Maus verursacht. Diese neuartige Methode bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung und verwendet dabei geringere Dosen an Röntgenstrahlen als andere bildgebende Verfahren. Osteoporose ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die Menschen mit Rückenmarksverletzung betrifft.Was wir vorschlagen, ist eine neuartige Methode für Tierversuche zur Rückenmarkverletzung, die es einem Forscher ermöglicht, über längere Zeiträume hinweg den Knochenverlust im Zusammenhang mit Osteoporose longitudinal zu verfolgen. Dies ist aus zwei Gründen wichtig. Erstens wird dadurch die Möglichkeit geschaffen, die Mechanismen zu untersuchen, die die Entstehung der Osteoporose beeinflussen.Die zweite Möglichkeit besteht darin, dass es uns eine Methode bietet, neue Interventionen zu testen, die darauf abzielen, die Entwicklung einer Osteoporose bei Patienten mit Rückenmarksverletzung entweder zu verhindern oder möglicherweise rückgängig zu machen. Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Rückenmarksverletzung verursachte Osteoporose ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise den altersbedingten Knochenschwund, der bei postmenopausalen Frauen auftritt, sowie andere traumatisch bedingte Abnahmen der Knochendichte. Knochenschwund infolge von Gliedmaßenfehlbelastung, verursacht durch Immobilisation nach Fraktur oder anderen Verletzungen, kann während des Heilungsprozesses zu erheblichem Knochenverlust führen. Die Anwendung der longitudinalen Ganzkörper-Röntgenbildgebung mit niedriger Dosis könnte neue Ansätze für die Entwicklung von Therapien eröffnen, die darauf abzielen, diese Probleme zu minimieren oder zu verhindern.Führen Sie die Operation zur Rückenmarksverletzung gemäß den Sander-Verfahren und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des örtlichen institutionellen Tierversuchsausschusses durch. Beginnen Sie dann am Tag 10 nach der Rückenmarkoperation und setzen Sie die Untersuchung in Abständen von jeweils 10 Tagen bis zum Tag 40 fort. Untersuchen Sie rechtes und linkes Femur sowie Tibiae lebender, anästhesierter Tiere mit transversaler Rückenmarksverletzung und ungeverletzter altersgematchter Kontrolltiere durch Abtastung mit dem IVUS-Lumina XR-System. Vor der Abtastung initialisieren Sie das Lumina XR-Gerät, um der internen Kamera zu ermöglichen, die Betriebstemperatur von minus 90 Grad Celsius zu erreichen.Platzieren Sie ein anästhesiertes Tier auf die Plattform innerhalb des Lumina xr. Danach setzen Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung ein, um sowohl den Femur- als auch den Tibialbereich scharf stellen zu können. Überprüfen Sie, ob das Objekt korrekt im Sichtfeld positioniert ist.Falls erforderlich, öffnen Sie die Tür und positionieren Sie das Tier erneut. Die korrekte Positionierung des Tieres wird hier gezeigt. Sobald das Tier richtig positioniert ist, kann die Röntgenfunktion ausgeführt werden.Wählen Sie aus der Energieliste eine für das Tier geeignete Energie aus. Öffnen Sie dann das Bedienfeld. Aktivieren Sie die Röntgenfunktion, indem Sie Röntgen anhaken, und nehmen Sie das Röntgenbild auf.Der gesamte Femur und die Tibia sollten wie hier gezeigt sichtbar sein. Da die Living-Image-Software standardmäßig transformierte Röntgenbilder anzeigt, stellen Sie sicher, dass rohe Röntgenbilder angezeigt werden, indem Sie das Menü für Korrektur- und Filterwerkzeuge aufrufen und das Häkchen neben Röntgenabsorption entfernen. Die Rohbilddaten werden automatisch auf der Festplatte gespeichert.Repräsentative TIFF-Dateien werden ebenfalls gespeichert. Nach der Bildgebung wird die Maus anschließend in ihren Heimkäfig zurückgebracht und unter Beobachtung des Untersuchers zur Erholung freigegeben. Der Vorgang wird dann mit der nächsten Maus wiederholt.Öffnen Sie zunächst die Software, indem Sie im erscheinenden Dialogfeld auf das Symbol „Living Image“ doppelklicken. Wählen Sie den gewünschten Ordner aus und klicken Sie auf „OK“. Laden Sie ein Röntgenbild, indem Sie auf die Schaltfläche „Durchsuchen“ klicken.Der Browser für Live-Bilder zeigt die ausgewählten Daten zusammen mit der Benutzerkennung an. Beschriftungsinformationen und Kamera-Konfigurationsinformationen. Um Daten zu öffnen, doppelklicken Sie auf die Datenzeile. Das Bild und die Werkzeugpalette werden angezeigt.Die offenen Daten werden im Browser in Blau hervorgehoben. Klicken Sie anschließend auf ROI-Werkzeuge. Öffnen Sie in der Werkzeugpalette unter ROI-Werkzeuge die Dropdown-Liste Typ und wählen Sie Mess-ROI aus.Um die drei in diesem Experiment verwendeten ROIs zu laden, klicken Sie auf das quadratische Symbol und laden Sie Quadrate. Messen Sie mit einem Lineal die Länge des Femurs und passen Sie die Länge der beiden Quadrate so an, dass sie ein Achtel der gesamten Femurlänge beträgt. Stellen Sie die Breite der Quadrate auf ein Vierundzwanzigstel der gesamten Femurlänge ein.Verwenden Sie nun das Lineal, um ein Achtel der Distanz vom proximalen Femurende aus zu messen, und positionieren Sie ein Rechteck so, dass es in dieser Position zentriert ist. Verschieben Sie das zweite Rechteck zum distalen Femurende und platzieren Sie es so, dass es mittig innerhalb der trabekulären Region des Knies liegt. Messen Sie anschließend die Länge der Tibia.Passt die Länge der Box auf ein Achtel der gesamten Tibialänge an. Passt die Breite auf ein Dreißigstel der gesamten Tibialänge an. Platziert die Box schließlich so, dass sie zentriert ist und ein Achtel der gesamten Tibialänge vom proximalen Tibiaende entfernt liegt, wie hier gezeigt.Klicken Sie anschließend auf das Messsymbol. Die ROI-Intensitätsmessungen erscheinen im Röntgenbild und die Tabelle mit den ROI-Messungen wird angezeigt. Exportieren Sie diese Tabelle an den gewünschten Speicherort als CSV-Datei. Dadurch kann die Tabelle in Excel geöffnet werden.Wiederholen Sie diesen Schritt mit allen gespeicherten Bildern, die analysiert werden sollen. Schlussendlich werden alle Daten in einer einzigen Excel-Tabelle zusammengeführt. Die statistische Signifikanz wird mittels eines Student’schen T-Tests mit Software wie Microsoft Excel oder Sigma Plot 11.0 bestimmt. Falls gewünscht, können die Ergebnisse mit den Ergebnissen eines postmortalen Analysen der Knochendichte mittels Dual-Energy-X-Ray-Absorptiometrie unter Verwendung standardisierter Protokolle für diese Methode verglichen werden.Der relative Knochendichteverlust eines Mäuses, Schienbeins und Oberschenkels nach einer Rückenmarkverletzung im Vergleich zu naiven Mäusen ist mit der oben beschriebenen Methode nachweisbar. Diese Abbildung zeigt den Knochendichteverlust nach einer Rückenmarkverletzung im proximalen Schienbein 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung. Im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrolltieren ist bereits nach 10 Tagen ein signifikanter Rückgang der Knochendichte um 12 % im Schienbein zu verzeichnen, der bis zu einem Verlust von 15 % nach 40 Tagen ansteigt.Hier sehen wir den Knochendichteverlust nach einer Rückenmarkverletzung im proximalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung. Im Vergleich zu altersangepassten Kontrolltieren wurde ein um 7 % stärkerer Knochendichteverlust im proximalen Femur 40 Tage nach der Verletzung beobachtet. Dieses Diagramm zeigt den Knochendichteverlust nach einer Rückenmarkverletzung im distalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung.Im Vergleich zu altersentsprechenden naiven Kontrollen konnte ein Verlust der Knochendichte im distalen Femur bereits 10 Tage nach der Verletzung beobachtet werden und blieb während des restlichen Experimentzeitraums bestehen. Dieses repräsentative Bild der Dual-Energie-Röntgenabsorptionsmessdaten zeigt die Knochenmineralmenge und die Knochendichte. Die entnommenen Femora wurden 40 Tage nach der Rückenmarksverletzung analysiert.Um die Wirksamkeit der in diesem Protokoll demonstrierten Methode mit anderen derzeit verfügbaren Methoden zu vergleichen, zeigt diese Abbildung die Analyse der Knochenmineraldichte mittels Dual-Energy-X-ray-Absorptiometrie in Gramm im Femur von Mäusen mit Rückenmarkverletzung 40 Tage nach der Operation im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrolltieren. Es wurde ein signifikanter Rückgang der Knochenmineraldichte um 12 % bei den Mäusen mit Rückenmarkverletzung im Vergleich zu den naiven Tieren beobachtet.Hier sehen wir eine Analyse der Knochendichte mittels Dual-Energie-Röntgenabsorptiometrie in Milligramm pro Quadratzentimeter am Femur von Mäusen mit Rückenmarkverletzung 40 Tage nach der Verletzung im Vergleich zu altersentsprechenden, gesunden Kontrolltieren. Der Verlust der Knochendichte änderte sich nicht signifikant, folgte jedoch einem ähnlichen Trend wie der Verlust des Knochenmineralgehalts. Dieser Vorgang kann in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden, aber denken Sie daran: Es ist wichtig, die Hintergliedmaßen korrekt zu positionieren.Nach der Betrachtung dieses Videos sollten Sie eine Vorstellung davon haben, wie man eine longitudinale Beurteilung der Knochendichte an lebenden Tieren nach einer Rückenmarksverletzung mithilfe des Caliper Instruments Lumina XR-Geräts durchführt.

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