Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. In den nächsten Tagen werde ich Ihnen das Verfahren zur Induktion und Messung einer adaptiven DTH-Reaktion bei Lewis-Ratten vorstellen.

Dieses Verfahren dauert fünf Tage, und ich werde Ihnen zeigen, wie man antigenspezifische T-Zellen aktiviert, wie man diese dann zwei Tage später initial in naiven Ratten injiziert. Zwei Tage danach werden wir die Ratten in den Ohren mit dem Antigen herausfordern, für das diese T-Zellen spezifisch sind. Und einen Tag später werden wir das Ausmaß der Entzündung bei diesen Ratten messen.

Um Serum für meine Gewebekultur zu erhalten, muss ich das Blut gewinnen. Dazu führe ich eine Herzpunktion durch. Ich platziere meinen linken Zeigefinger auf das Sonnengeflecht und führe die Nadel zwischen den Rippen hindurch bis zum Herzen, um so viel Blut wie möglich zu aspirieren.

Und aus einer einzigen Entnahme können wir je nach Tag und Effizienz zwischen zwei und zehn Milliliter Blut von einer Ratte gewinnen. Der Grund, warum wir Serum in der Kultur benötigen, besteht darin, dass wir Zellen – nämlich Lewis-Ratten-Zellen – in einem serumhaltigen Medium kultivieren möchten, das syngen ist. Dieses Serum stammt daher von Lewis-Ratten.

Danach überführe ich das Blut in ein Reagenzglas, entferne jedoch vorsichtig die Spritze, die Nadel, damit es zu keiner Hämolyse kommt, da ich mein Serum später für die Gewebekultur verwenden möchte. Nun werde ich den Thymus entfernen, da das Herz aufgehört hat zu schlagen und die Ratte tot ist.

Ich besprühe zunächst mit 70 % Ethanol, um sicherzustellen, dass kein Fell herumfliegt und in mein Organ gelangt, da ich dieses für die Gewebekultur benötige. Zum Durchführen der Dissektion verwende ich autoklavierte Instrumente. Zuerst schneide ich die Haut ab.

Nachdem ich die Haut entfernt habe, schneide ich vorsichtig auf jeder Seite des Brustkorbs entlang, um sicherzustellen, dass ich den Thymus nicht beschädige, der direkt über dem Herzen liegt. Der Thymus ist hier als ein blasses, fast weißes Organ direkt über dem Herzen zu erkennen. Ich entferne ihn, wobei ich darauf achte, das gesamte Organ zu entnehmen, aber ich gehe nicht allzu sorgfältig vor, um ihn sauber zu isolieren, da ich ihn später im Sicherheitswerkbank reinigen werde.

Und ich gebe es einfach in ein Gefäß mit PBS, das ich mit Penicillin und Streptomycin ergänzt habe. Um ein bakterielles Wachstum zu vermeiden, werde ich nun eine Einzelzell-Suspension meiner Zellen herstellen. Dazu verwende ich einen Zellfilter mit einer Porengröße von 70 Mikrometer.

Und ich werde natürlich ausschließlich sterile Ausrüstung verwenden. Ich überführe den Thymus in eine Petrischale. Wie Sie sehen, ist diese nicht besonders sauber.

Der Thymus ist das weißliche Organ, und es befinden sich Lymphknoten und Blutgerinnsel darauf. Diese werde ich entfernen. Außerdem werde ich etwa 10 ml PBS, ergänzt mit Antibiotika, in meinen Zellfilter geben, um bereit zu sein, den Thymus aufzunehmen, sobald er gereinigt ist.

Um es zu reinigen, entferne ich einfach alle Kontaminationen aus meinem Thymus. Nun ist mein Thymus nahezu vollständig sauber, daher werde ich ihn mit meiner Pinzette aufnehmen und mit der Schere über dem Zelltrichter in kleine Stücke schneiden, die ich anschließend alle in den Zelltrichter gebe. Nachdem ich damit fertig bin, werde ich den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, die natürlich steril ist, verwenden, um durch Andrücken der Thymusstücke durch den Zelltrichter eine einzelne Zellsuspension herzustellen.

Und die einzelnen Zellen werden durchlaufen und sich in meinem PBS außerhalb des Cell Trainers befinden. Nun habe ich meine Zellen durch den Cell Trainer gedrückt, und Sie können sehen, dass der PBS nicht mehr klar ist. Er ist gefüllt mit meiner Einzelzell-Suspension, die ich in ein 50-ml-Gefäß überführen werde, das ich auf Eis halte.

Und ich werde den Vorgang mehrmals wiederholen, indem ich meinen Zellfilter mit PBS auffülle, mit dem Spritzenstößel stärker nachpresse und in mein Gefäß übertrage, bis sich zwischen 30 und 40 ml PBS in meinem Gefäß befinden. So sieht der Zellfilter aus, wenn ich fertig bin. Nachdem ich nun alle Zellen gesammelt habe, werde ich sie etwa 10 Minuten bei 1200 U/min abzentrifugieren.

Hier sind die Zellen, die ich aus der Zentrifuge genommen habe, und das Pellet ist ziemlich groß, was bei einer solchen Menge zu erwarten war. Jetzt entferne ich die Überstände. Das Pellet bleibt natürlich weiterhin am Boden des Röhrchens. Um die Suspension später zu erleichtern, werde ich das Pellet aufbrechen, während es noch fast trocken ist.

Und dafür tippe ich es ziemlich kräftig mit dem Finger an, bis Sie sehen, dass der PT vollständig disaggregiert ist und wir wieder eine Einzelzell-Suspension vorliegen haben. Nun werde ich meine Zellen in steriler PBS resuspendieren und gebe fünf Milliliter PBS pro Timer hinzu. Da ich nur einen Timer habe, füge ich einfach fünf Milliliter hinzu.

Und diese Suspension werde ich dem Spülgerät zuführen, um die Zellen zu gewinnen. Das von mir verwendete Spülniveau beträgt 30 Grad, um sicherzustellen, dass die Zellen noch lebendig sind, aber innerhalb weniger Stunden absterben werden. So können sie das Antigen weiterhin verarbeiten, verunreinigen jedoch nicht meine Kultur.

Wenn wir uns die T-Zellen ansehen, die wir aktivieren möchten, stellen wir fest, dass sie keineswegs gesund aussehen. Einige haben bereits mit dem Absterben begonnen. Sie weisen seltsame Formen auf und sind nicht mehr vorhanden.

Daher sind diese Zellen bereit zur Aktivierung. Nach den Zeitpunkten sind sie tatsächlich dringend auf Antigen angewiesen. Es ist äußerst wichtig, sie schnell zu waschen, da einige von ihnen abgestorben sein werden und toxische Verbindungen in die Lösung freisetzen könnten.

Ich gebe hinzu und ergänze das Reagenzglas mit meiner PBS-Lösung auf insgesamt 50 ml. Gleichzeitig werde ich die T-Zellen, die auf die Stimulation warten, in ein anderes 50-ml-Reagenzglas überführen, damit ich beide Reagenzgläser gleichzeitig versenden kann.

Hier ist das Blut, das ich vor einiger Zeit gesammelt habe. Ich habe es 10 Minuten bei 37 Grad stehen lassen und anschließend auf Eis gestellt. Wie Sie sehen können, hat es sich vollständig geronnen. Ich benötige nun das Serum aus diesem Blut.

Um es im ersten Schritt mit einer sterilen Pasteurpipette aufzusammeln, werde ich das Gerinnsel vom Röhrchen ablösen und die gesamte Flüssigkeit sammeln, die das Serum enthält, an dem ich interessiert bin, sowie einige Zellen, die nicht im Gerinnsel eingeschlossen wurden. Diese Flüssigkeit werde ich in ein anderes Röhrchen überführen. Dabei können gelegentlich kleine Gerinnselstücke mitübertragen werden, was jedoch kein großes Problem darstellt, da ich die Zellen, die sich ohnehin noch in der Flüssigkeit befinden, anschließend entfernen muss.

Ich werde nun mein kleines Röhrchen mit der darin enthaltenen Flüssigkeit zentrifugieren. Dadurch werden die Zellen sowie eventuelle Gerinnsel entfernt. Jetzt zentrifugiere ich den flüssigen Teil des Blutes, um die Zellen vom Serum zu trennen. Ein Zentrifugieren für zwei Minuten wird ausreichen.

Jetzt wurde das Serum zentrifugiert, daher werde ich das Serum von den Zellen abtrennen. Dies ist kein perfektes Beispiel, da das Serum gelblich sein sollte und dieses hier rötlich ist, was zeigt, dass ich eine Hämolyse hatte. Es ist also nicht absolut perfekt, aber ich werde Ihnen trotzdem zeigen, wie ich es filtriere.

Ich verwende eine 0,2-Mikron-Spritzenfiltersystem und werde mein Serum filtrieren, um sicherzustellen, dass es steril ist. Da ich jedoch eine Hämolyse hatte, werde ich dieses Serum nicht für meine Stimulation verwenden. Stattdessen verwende ich Rattenserum von Louis, das während eines vorherigen Experiments eingefroren wurde.

Hier sind die PTs der T-Zellen auf der linken Seite und der antigenpräsentierenden Zellen auf der rechten Seite. Ich werde nun das Snat aus beiden Röhrchen entfernen. Wie zuvor werde ich die Pellets durch leichtes Antippen mit dem Finger aufbrechen, um sicherzustellen, dass die Zellen wieder in einer Einzelzell-Suspension vorliegen.

Und das werde ich für beide Zellgruppen durchführen, die T-Zellen und die antigenpräsentierenden Zellen. Danach werde ich sie suspendieren und zählen. Anschließend werde ich 3 Millionen der T-Zellen mit 150 Millionen der antigenpräsentierenden Zellen mischen und in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern geben.

Und in einem Gesamtvolumen von 10 ml befinden sich hier zwei Röhrchen mit Serum. Rechts steht das, das ich heute vorbereitet habe und das aufgrund von Hämolyse rötlich ist, während sich links ein Röhrchen befindet, das ich vor einigen Tagen vorbereitet und eingefroren habe. Es ist gelblich, weist keine Hämolyse auf und ist deutlich besser.

Das ist diejenige, die ich heute für meine Gewebekultur verwenden werde. Ich habe genügend Zellen, um sechs Petrischalen zu stimulieren, daher werde ich 30 ml Medium in die antigenpräsentierenden Zellen und 30 ml desselben Mediums in die T-Zellen geben. Danach werde ich in das Reagenzglas mit den antigenpräsentierenden Zellen das Antigen hinzufügen, das aus Albumin besteht.

Mein Stammansatz beträgt 1 Milligramm pro ml, und ich möchte eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro ml in meinen Petrischalen erreichen. In die T-Zelle werde ich Ratten-Serum aus Louis hinzufügen. Ich werde so viel hinzufügen, dass am Ende 1 % Ratten-Serum in meinen Petrischalen vorliegt.

Ich werde meine Suspension von antigenpräsentierenden Zellen homogenisieren und anschließend fünf Milliliter dieser Zellsuspension in jede meiner Petrischalen übertragen. Wenn Sie Ihre Suspension von antigenpräsentierenden Zellen entnehmen, werden Sie bemerken, dass sich stets ein kleiner Fettklumpen und faseriges Gewebe befindet. Das ist völlig normal.

Es ist bei all unseren Zeiten der Standortvorbereitungen vorhanden. Es gibt keinen Grund zur Sorge. Ich entferne es entweder, falls ich es schaffe, oder lasse es andernfalls einfach in der Petrischale.

Es beeinflusst meine Zellkultur überhaupt nicht. Und sobald ich alle APCs in meine Petrischalen übertragen habe, werde ich das Verfahren mit den T-Zellen wiederholen. Dazu werde ich in jede dieser Petrischalen fünf ml T-Zell-Suspension geben.

Jetzt befinden sich alle meine Zellen in den Petrischalen, und es ist sehr wichtig, sie gründlich zu mischen, damit jede T-Zelle die Möglichkeit hat, mit einer antigenpräsentierenden Zelle in Kontakt zu kommen. Dazu staple ich meine Petrischalen und mische, indem ich unsichtbare Achten mit den Petrischalen zeichne. Ich wiederhole dies mehrmals, um sicherzustellen, dass alle Zellen gut vermischt sind.

Und nachdem ich alles vermengt habe, stelle ich diese Schalen für 48 Stunden in einen Brutschrank mit feuchter Atmosphäre bei 37 Grad C und 5 % CO2. Das Medium hat leicht seine Farbe verändert, es ist nun orangefarbener, und die Zellen wurden gut aktiviert.

Ich überprüfe also nacheinander alle Petrischalen unter dem Mikroskop. Die sehr großen Zellen sind die aktivierten T-Zellen und die sehr kleinen Zellen sind die abgestorbenen antigenpräsentierenden Zellen. Die Stimulierung ist sehr gut, da man erkennen kann, dass die T-Zellen sehr groß sind.

Und wenn ich die Petrischale etwas bewege – oops – sehen Sie auf der linken Seite hier, jetzt in der Mitte, einen großen Zellverband, und das sind aktiv teilende Zellen. Ich werde nun alle Zellen in Zentrifugenröhrchen überführen, um sie abzuzentrifugieren, zu zählen und anschließend 10 Millionen in Ratten zu injizieren. Die Stimulierung war also so gut, dass ich nicht alle diese T-Zellen benötige, um eine Ratte zu impfen.

Ich werde also nur Zellen aus zwei Petrischalen verwenden. Ich werde sie abzentrifugieren, um 10 Millionen Zellen in die Ratte zu injizieren, und den Rest der Zellen in Kultur geben, um sie in einigen Tagen einzufrieren.

Und das Kulturmedium ist das übliche T-Zell-Kulturmedium, dem Wachstumsfaktor für T-Zellen und Pferdeserum zugesetzt werden. Die T-Zellen sind nicht adhärent, daher muss ich nicht viel tun. Ich stelle lediglich sicher, dass die Mehrheit der Zellen mit dem Medium überführt wird.

Und dann werde ich am Ende alle Petrischalen mit frischem Medium ausspülen, um sicherzustellen, dass ich alle Zellen erhalte. 10 Milliliter Medium, das gleiche, das ich für die Stimulation verwendet habe, und dann denke ich, jede Petrischale, aber die T-Zellen sind bereits beim ersten Mal herausgekommen, als ich das Medium entnommen habe. Normalerweise kommt das Medium also hier heraus, es ist nicht unbedingt notwendig, aber da diese Zellen wertvoll sind, möchte ich keine verlieren.

Daher werde ich sie abzentrifugieren. Das entfernt einen Teil der toten Zellen und ermöglicht es, hauptsächlich mit lebenden Zellen zu beginnen. Außerdem möchte ich ihnen ein frisches Medium zugeben.

Ich werde das Ganze erneut bei 1.500 U/min etwa acht Minuten lang zentrifugieren. Ich lasse die Bremse weiterhin aktiviert, da ich lediglich die Zellen pelletiere. Wir zentrifugieren also beide Proben, und in einer habe ich die kleinen Pellets.

Das stammt von den beiden Petrischalen. Und hier ist das Pellet aus den vier Petrischalen. Die Pellets sind riesig, weil sie nicht nur die aktivierten T-Zellen enthalten, sondern auch die Daten tragenden antigenpräsentierenden Zellen.

Jetzt werde ich den Überstand entfernen und in die Zellen, die ich hier injizieren werde, ein Milliliter Medium hinzufügen, das ich verwenden werde, um die Injektion durchzuführen. Die anderen Zellen werde ich in hundert Milliliter Kulturmedium mit T-Zell-Wachstumsfaktor und Pferdeserum suspendieren. Das sind die Zellen, die ich injizieren werde.

Und für diese Zellen werde ich je 50 ml in zwei Plastikflaschen geben. In jeden Kolben werde ich 10 % T-Zell-Wachstumsfaktor, der aus Knochen hergestellt ist, geben. Außerdem füge ich 10 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum hinzu.

Dann füge ich den größten Teil des benötigten Mediums hinzu. Ich pipettiere nicht auf und ab, da T-Zellen es nicht mögen, zu stark pipettiert zu werden. Ich pipettiere daher nur die absolut notwendigsten Mindestmengen und gebe dann einfach das restliche Medium hinzu, und sie sind fertig.

Sie sind bereit, in den Inkubator gestellt zu werden. Ich überprüfe sie jeden Tag. Wahrscheinlich muss ich sie nach 24 Stunden teilen, spätestens aber nach 40 bis 48 Stunden. Aber ich werde sie täglich kontrollieren.

Sie neigen dazu, im T-Zell-Wachstumsfaktor sehr schnell zu wachsen. Daher müssen sie mindestens alle 48 Stunden, wahrscheinlich eher, geteilt werden. Ich werde auch die Farbe des Kulturmediums überprüfen.

Jetzt sind sie aktiviert, also vollständig aktiviert. Das ist der beste Zeitpunkt, um sie der Ratte zu verabreichen. Und in zwei Tagen werden wir die Ratte am Ohr herausfordern.

Wenn wir warten, bis die Zellen – wenn wir einige Tage warten, bis die Zellen wieder in den Ruhezustand zurückgekehrt sind –, kehren sie so schnell zum Ort der Entzündung zurück. Nun werde ich sie in den Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 stellen und eine 25-Gauge-Nadel verwenden, um die Ratte zu injizieren. Nachdem die Zellen nun injiziert wurden, werde ich die Ratte hier belassen und sie in 48 Stunden an den Ohren herausfordern.

Vor einigen Tagen habe ich GFP-markierte, albuminspezifische T-Zellen in eine Ratte injiziert. Und heute werde ich dieselbe Ratte am Ohr herausfordern. Im rechten Ohr werde ich Albumin injizieren.

Und in das linke Ohr injiziere ich lediglich etwas PBS. Die Dosis an Volin, die ich injiziere, beträgt 20 Mikrogramm in 20 Mikroliter. Das verwendete Albumin ist eine 1:1-Mischung aus mit Texas Rot markiertem Albumin und unmarkiertem Albumin.

Das ist also die Toilette, auf der ich Ihnen zeigen werde, wie ich die Injektion durchführe. Ich habe meine linke Hand frei – ich bin Rechtshänder. An meiner linken Hand habe ich den Handschuh abgenommen, um einen Finger unter das Ohr und den anderen darüberlegen zu können, um die Haut zu straffen. So kann ich genau erkennen, wo sich die Nadel befindet, und zwischen die beiden Hautschichten in die Luft eindringen, die hier sehr dünn ist.

Dafür verwende ich Nadeln mit 27 Gauge, um etwas äußerst Dünnes zu haben, das dort eingeführt werden kann. Wenn ich es umdrehe, sehen Sie deutlich, wohin das Texas-rot und wohin das PBS gelangt ist. Wir befinden uns nun 42 Stunden nach der Herausforderung im Jahr, und ich werde einen federbelasteten Messmikrometer verwenden, um die Dicke des Ohres zu messen.

Ich werde also beide Ohren messen, das rechte Ohr, das mit dem Albumin herausgefordert wurde, und das linke Ohr, das nicht herausgefordert wurde. Und der Unterschied in der Dicke der Ohren gibt uns einen Hinweis auf die Intensität der Entzündung. Was ich Ihnen hier gezeigt habe, ist das gesamte Verfahren, um eine adaptive DTH bei Ratten durchzuführen.

Ich habe Ihnen gezeigt, wie man antigen-spezifische T-Zellen in vitro aktiviert, wie man sie adoptiv in Ratten überträgt und anschließend wie man diese Ratten herausfordert und das Ausmaß der Entzündung misst. Im Chand-Labor verwenden wir dieses Verfahren routinemäßig, um die Wirkung von Kaliumkanalblockern auf die Entzündung bei Ratten zu testen.