Name: Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie antigen-spezifische TEM-Zellen aktivieren und verzögerte Typ-Hypersensitivität bei Lewis-Ratten induzieren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung entzündlicher Reaktionen über fünf Tage.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Dr. Alexander Flügel (Martinsried, Deutschland) für die Bereitstellung der GFP-markierten, Ovalbumin-spezifischen T-Zell-Linie in diesem Protokoll verwendet.

1. Die Stimulation der Ovalbumin-spezifischen T-Lymphozyten Ruhe-Ovalbumin-spezifischen T-Zellen sind mit Ovalbumin in Gegenwart von bestrahlten Lewis Ratten-Thymozyten (30 Gy) als Antigen-präsentierende Zellen (APC), in Stimulation Medium (Prepare in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamine angeregt + + 2ME Rattenserum + Ovalbumin, die Endkonzentrationen bemerkt in der Stückliste.) Rattenserum Vorbereitung <ol><li> Wir nehmen Serum von Ratten wir als Thymus Spender zu opfern. </li><li> Ratten sind tief narkotisiert durch Halothan Einatmen und so viel Blut wie möglich durch kardiale Perfusion (5-10 ml pro Ratte) mit 10 ml Spritzen und 23 G 1 &quot;Nadeln, nach denen die Ratten sofort enthauptet zu Tode sorgen gezogen. </li><li> Das Blut wird zur Gerinnung für 10 min bei 37 ° C erlaubt durch 10 min auf Eis. </li><li> Das Gerinnsel wird entfernt und die restliche Flüssigkeit gesponnen. </li><li> Das Serum wird gesammelt, sterilfiltriert und bei -20 ° C gelagert </li></ol> Vorbereitung der Antigen-präsentierenden Zellen <ol><li> Nehmen Sie die Thymus eines enthaupteten Ratte mit sterilen Instrumenten und legen Sie sie in PBS mit Penicillin und Streptomycin (PBS-PS), auf Eis. </li><li> Nehmen Sie den Thymus zu einer Gewebekultur Kapuze, reinigen Sie es von Blutgerinnseln und anderen kontaminierenden Gewebes und schneiden Sie sie in kleine Stücke schneiden, in eine Zelle Sieb (Fisher # 08-771-2) in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml platziert PBS- PS. </li><li> Jedes Stück ist durch die Zelle Sieb mit der Rückseite einer sterilen 1 ml Spritzenkolben gedrückt. Sammeln Sie die einzelnen Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. </li><li> Spülen Sie die Zelle Sieb mit 20-40 mehr ml PBS-PS. Die Suspension bei 1250g und das Pellet in PBS-PS, 5 ml / Thymus, auf Eis. </li><li> Bestrahlen dieser Suspension (30 Gy) in einem Gamma-Strahler und sofort waschen Sie es zweimal mit 50 ml PBS-PS. Hinweis: Die beste Thymus Spender sind junge erwachsene Ratten, 5-7 Wochen alt. Ratten bis zu 10 Wochen kann verwendet werden, aber die Anzahl der Zellen mit der Zeit abnimmt. Geschlecht ist nicht wichtig, obwohl manche Leute sagen, dass Männer besser Thymus Geber. Wir verwenden immer Frauen, weil alle unsere Tiere im selben Raum untergebracht sind, und wir wollen nicht, dass Männer und Frauen im gleichen Raum. </li></ol> Stimulation <ol><li> Waschen Sie den T-Lymphozyten einmal gezählt. </li><li> Zählen Sie die Antigen-präsentierenden Zellen. </li><li> Mix 3 x 10 6 Ovalbumin-spezifischen T-Zellen werden mit 150 x 10 6 APCs in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml der Stimulation Medium. </li><li> 48 Stunden lang bei 37 ° C. </li></ol> 2. Adoptiven Transfer der Ovalbumin-spezifischen T-Lymphozyten <ol><li> Die Ratten verwenden wir als Empfänger sind Frauen 7-10 Wochen alt. </li><li> Zählen Sie die T-Lymphozyten, sollten sie groß und rund. Die Antigen-präsentierenden Zellen tot sein. </li><li> Zentrifugieren Sie die T-Lymphozyten und resuspendieren sie bei 10 x 10 6 Zellen / ml in PBS. </li><li> Inject 1 ml intraperitoneal mit 3 ml Spritzen und 23 G 1 &quot;Nadeln. </li></ol> 3. Challenge mit Antigen in das Ohr <ol><li> Zwei Tage nach adoptiven Transfer, injizieren 20 pl einer 1 mg / ml Ovalbumin-Lösung (= relevante Antigen) in einem Ohr und Kochsalzlösung (oder irrelevant Antigen) in das andere Ohr. Nicht filtern die Antigen-Lösung, wie Sie Aggregate, die die Entzündungsreaktion verstärken kann verlieren. Hinweis: Die Ratten sollten betäubt, um Bewegungen zu vermeiden. Wenn Sie Rechtshänder sind, halten das Ohr zwischen dem linken Daumen und Zeigefinger, mit dem Zeigefinger wird im Inneren des Ohres und der Ratte zu Ihnen zeigt. </li><li> Injizieren Sie die Lösung in der Ohrmuschel mit 27G ½ &quot;Nadeln. Versuchen Sie, alle Ratten genau injizieren an der gleichen Stelle. </li></ol> 4. Messung von DTH <ol><li> Das Ohr beginnt sich rot und schwillt als ein Zeichen der Entzündung. Messen Sie die Dicke jedes Ohr mit einem federbelasteten Mikrometer (zum Beispiel Modell PK-0505 von Mitutoyo). </li><li> Nehmen Sie 5-6 Messungen für jedes Ohr zu jeder Zeit-Punkt und berechnen Sie den Mittelwert. </li><li> Die maximale Schwellung sollte zwischen 24 und 72 Stunden auftreten. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

Die antigene Herausforderung kann auch an anderen Standorten durchgeführt werden, zum Beispiel in der Haut des Rückens (2). Wir finden jedoch, dass eine Herausforderung. Mit der Ohrmuschel, wie in diesem Video gezeigt, ermöglicht die präzise Messung der DTH-Reaktion.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM endgültig, im Stimulationsmedium</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;#8211; Streptomycin &amp;#8211; L-Glutamin</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>jeweils 100 U/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM endgültig im Stimulationsmedium</td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1 % endgültig, im Stimulationsmedium</td></tr><tr><td>RPMI-Vitamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1 % endgültig, im Stimulationsmedium</td></tr><tr><td>Beta-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2-ME, 50 &amp;#x03BC;M endgültig, im Stimulationsmedium</td></tr><tr><td>Syngenes Rattenserum</td><td></td><td></td><td>1 % endgültig. Siehe Erklärung im Protokoll.</td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml endgültig, im Stimulationsmedium.</td></tr></tbody></table>

induktion und Überwachung von adoptive allergien vom verzögerten typ in ratten

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten, dass der Injektionsstelle eines Antigens, gegen die das Immunsystem grundiert hat infiltrieren vermittelt. Die Entzündungsreaktion wird durch Rötung und Schwellung der Website von antigenen Herausforderung geprägt. Es ist eine bequeme Modell, um die in vivo Wirksamkeit von Immunsuppressiva zu bestimmen. Kutane DTH kann entweder durch adoptiven Transfer von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten oder durch aktive Immunisierung mit einem Antigen, und die anschließende intradermal Herausforderung mit dem Antigen auf die entzündliche Reaktion in einem bestimmten Hautareal hervorrufen induziert werden. DTH-Reaktionen können auf verschiedene Antigene hervorgerufen werden, z. B. Ovalbumin, Tuberkulin-, Tetanus-Toxoid, oder Keyhole Limpet Hämocyanin. Solche Reaktionen können auch gegen Autoantigen induziert werden, zum Beispiel um basisches Protein (MBP) in Ratten, die mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis induziert mit MBP, einem Tiermodell für Multiple Sklerose (1) Myelin. Hier zeigen wir, wie ein Adoptiv-DTH-Reaktion in Lewis-Ratten zu induzieren. Wir werden zunächst zu stimulieren Ovalbumin-spezifischen T-Zellen in vitro und injizieren diese aktivierten Zellen intraperitoneal naive Ratten. Nachdem die Zellen in vivo für 2 Tage ins Gleichgewicht, werden wir die Ratten mit Ovalbumin in der Ohrmuschel eines Ohres Herausforderung, während das andere Ohr wil erhalten Kochsalzlösung. Die entzündliche Reaktion sichtbar sein wird 3-72 Stunden später und die Dicke der Ohren wird als Indiz für DTH Schwere gemessen werden.

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T (TEM)-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie um Antigen-spezifische TEM-Zellen zu aktivieren, bewegen Adoptiveltern DTH in Lewis-Ratten und überwachen die entzündliche Reaktion.

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Die verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion (Delayed-Type Hypersensitivity, DTH) ist eine Entzündungsreaktion, die durch CCR7-Effektor-Gedächtnis-T-Lymphozyten vermittelt wird, welche die Injektionsstelle von ... infiltrieren.

Ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. In den nächsten Tagen werde ich Ihnen das Verfahren zur Induktion und Messung einer adaptiven DTH-Reaktion bei Lewis-Ratten vorstellen.Dieses Verfahren dauert fünf Tage, und ich werde Ihnen zeigen, wie man antigenspezifische T-Zellen aktiviert, wie man diese dann zwei Tage später initial in naiven Ratten injiziert. Zwei Tage danach werden wir die Ratten in den Ohren mit dem Antigen herausfordern, für das diese T-Zellen spezifisch sind. Und einen Tag später werden wir das Ausmaß der Entzündung bei diesen Ratten messen.Um Serum für meine Gewebekultur zu erhalten, muss ich das Blut gewinnen. Dazu führe ich eine Herzpunktion durch. Ich platziere meinen linken Zeigefinger auf das Sonnengeflecht und führe die Nadel zwischen den Rippen hindurch bis zum Herzen, um so viel Blut wie möglich zu aspirieren.Und aus einer einzigen Entnahme können wir je nach Tag und Effizienz zwischen zwei und zehn Milliliter Blut von einer Ratte gewinnen. Der Grund, warum wir Serum in der Kultur benötigen, besteht darin, dass wir Zellen –

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie die aktive DTH in Lewis-Ratten induzieren und Überwachung der entzündlichen Reaktion.

Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer verzögerten Typ-Überempfindlichkeit (DTH)-Reaktion bei der Ratte Ohr. Dies wird durch eine Demonstration der Vorbereitung der Ratte Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der Effektor / Memory T-Zell-Antwort folgte.

Imaging Effektor-Memory-T-Zellen im Ohr nach Induktion der Adoptive DTH

Dieses Video zeigt, wie autoimmune Hypophysitis in SJL Mäusen und wie sie ihre Strenge durch Histopathologie beurteilen zu induzieren.

Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis in SJL Mäuse

Wir beschreiben eine wertvolle diagnostische Assays, die möglicherweise verwendet werden könnten, um den Abzug der Immunsuppression nach der Transplantation ohne erhöhten Risiko einer Abstoßungsreaktion zu entscheiden. Der Test basiert auf den Grundsätzen der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und liefert genaue Beurteilung der beiden Spender spezifischen Effektor-und regulatorischen Immunantworten durch Empfänger montiert.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Wir beschreiben hier Methoden für neonatale Capsaicin Behandlung atopischen Dermatitis bei Ratten und Exposition von verdampftem Formaldehyd zu untersuchen, die Wirkungen von Formaldehyd Inhalation auf atopische Dermatitis zu induzieren.

Auswirkungen der Exposition von Formaldehyd zu einem Rattenmodell der Neurodermitis durch Behandlung der Neugeborenen Capsaicin induziert

Dieses Protokoll verwendet G6PI gemischte Peptide, um rheumatoide Arthritis-Modelle zu konstruieren, die näher an denen der menschlichen rheumatoiden Arthritis in CD4+ T-Zellen und Zytokinen sind. Hochreine invariante natürliche Killer-T-Zellen (hauptsächlich iNKT2) mit spezifischen Phänotypen und Funktionen wurden durch In-vivo-Induktion und In-vitro-Reinigung zur Adoptivimmuntherapie erhalten.

Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis

Hier stellen wir ein prägnantes Protokoll zur Erstellung eines Frühgeborenen-Rattenmodells vor, das die Forschung zur frühen postnatalen Schmerzbehandlung erleichtert. Bei der Methode wird drei Tage vor der erwarteten Geburt ein Kaiserschnitt durchgeführt, Frühgeborene von Ratten mittels Hysterektomie extrahiert und mit den biologischen Nachkommen einer Leihmutter integriert.

Ein Frühgeborenen-Rattenmodell für Schmerzstudien

Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

Mausmodell der epikutan induzierten Immunmodulation

Erfahren Sie, wie Sie antigen-spezifische TEM-Zellen aktivieren und verzögerte Typ-Hypersensitivität bei Lewis-Ratten induzieren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung entzündlicher Reaktionen über fünf Tage.

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Weitere Videos entdecken