Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Antibiotika-Empfindlichkeit von Blutkulturisolaten in kürzerer Zeit als mit herkömmlichen Methoden zu identifizieren und zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Blutkulturisolat identifiziert wird. Unter Verwendung eines neuartigen ribosomalen 16-s-DNA-MultiPro-PCR-Assays.

Dann wird das Isolat sechs Stunden lang mit einer Reihe von Antibiotika inkubiert. Der nächste Schritt besteht darin, das Wachstum oder das Wachstum in der Hemmung des Isolats in Gegenwart des Antibiotikums unter Verwendung eines quantitativen 16 s ribosomalen D-N-A-P-C-R-Assays zu bestimmen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Identifizierung und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung eines Blutkulturisolats durch diese Kombination von Kultur und PCR schneller erfolgen kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. denen mit automatisierten Phönix- oder IIC-Systemen, besteht darin, dass kein vorheriger Kultivierungsstatus erforderlich ist und dass die Ergebnisse der Identifizierung und der Antibiotika-Empfindlichkeitstests noch am selben Tag vorliegen können. Vandy Hanson und GID ing-Doktoranden aus unserem Labor werden das Verfahren demonstrieren: Verdünnen Sie 100 Mikroliter Blutkultur, die positiv für das mikrobielle Wachstum ist, in einem Reaktionsröhrchen, das 900 Mikroliter 0,9 % Natriumchlorid enthält. Zentrifugieren Sie dann die Probe fünf Minuten lang bei 13.400 G, um die Bakterien nach der Zentrifugation zu pelletieren.

Reese, suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern sterilem demineralisiertem Wasser. Installieren Sie die Probe bis zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius. Sobald alle Proben fertig sind, bereiten Sie die Real-Time-PCR-Reaktionsmischungen vor, um die spezifische ribosomale 16-s-DNA der interessierenden Bakterien zu amplifizieren.

Verwenden Sie demineralisiertes Wasser, um das Volumen auf 20 Mikroliter pro Reaktion einzustellen. Aliquotieren Sie 20 Mikroliter PCR-Mix pro Vertiefung in einer 96-Well-PCR-Platte. Geben Sie dann fünf Mikroliter Probe in jede Vertiefung und verschließen Sie die PCR-Platte.

Führen Sie als Nächstes die PCR auf dem A BI Prism 7, 900 HT Real-Time-PCR-System aus, um die Ergebnisse zu analysieren Sobald die PCR abgeschlossen ist, verwenden Sie zunächst die Registerkarte Analyseeinstellungen, um die CT-Analyse auf 0,1 einzustellen. Grenzen Sie dann die Basiskonfigurationen ein, um Zyklus sechs zu starten und Zyklus 15 zu beenden. Notieren Sie den CT-Wert für jede Probe.

Der Cutoff-Wert, um ein PCR-Ergebnis als positiv zu betrachten, kann in der Regel auf einen CT-Wert von 35 gesetzt werden. In diesem Beispiel wird das Identifikationsprofil einer mit E. coli infizierten Blutkultur in zwei Reaktionsmischungen gezeigt. Universelle 16 s ribosomale DNA-Primer wurden eingeschlossen und erzeugten zwei Amplifikationskurven von CT 25.2 und 25.95.

Die dritte Amplifikationskurve wird von der für Coli spezifischen Sonde abgeleitet. Andere spezifische Sonden erzeugten keine nachweisbaren Signale. Ist der Erreger identifiziert, können Antibiotikatests durchgeführt werden.

Beginnen Sie damit, fünf Milliliter Brühe aus einer positiven Blutkultur in ein Serumseparatorröhrchen zu überführen. Die Probe wird nach der Zentrifugation 10 Minuten lang bei 2000 mal G zentrifugiert, dann wird das Supan-Mittel aus dem Röhrchen verworfen. Übertragen Sie dann mit einem sterilen Wattestäbchen die Bakterien aus der Gelschicht der Tube in 0,9%iges Natriumchlorid, bis eine Lösung mit einer Trübung von 0,5 McFarland-Standard erhalten wird.

Dies entspricht etwa 1,5 mal 10 zu den acht koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. Als nächstes verdünnen Sie die Suspension in doppelter Konzentration Muller Hinton. Zwei Brühen, um eine Konzentration von etwa fünfmal 10 zu erhalten, die fünf koloniebildenden Einheiten pro Milliliter bilden.

Aliquotieren Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung der Suspension in einer Mikrotiterplatte, die bereits 50 Mikroliter pro Vertiefung einer Auswahl von Antibiotika enthält. Achten Sie darauf, dass Sie für jede Probe positive Wachstumskontrollen durchführen, indem Sie Vertiefungen mit Wasser anstelle von Antibiotika verwenden. Decken Sie den Teller ab, wenn er fertig ist.

Dann inkubieren Sie die Platte sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen. Achten Sie darauf, ein Aliquot der Bakteriensuspension bei vier Grad Celsius als negative Wachstumskontrolle zu lagern. Nach der sechsstündigen Inkubation werden der Inhalt jeder Vertiefung und die negative Kontrollprobe in separate sterile Röhrchen überführt.

Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 16.000 Mal. G, 80 Mikroliter Überstand entfernen und die Pellets in 80 Mikrolitern sterilem demineralisiertem Wasser wieder suspendieren. Verdünnen Sie die Proben bei eins bis 10 in Wasser, bevor Sie sie für die ribosomale DNA-Real-Time-PCR mit 16 s verwenden.

Bereiten Sie den PCR-Mix mit dem IQ cyber green Super Mix und 16 s ribosomalen DNA-Primern vor und aliquotieren Sie 20 Mikroliter pro Well in einer 96-Well-PCR-Platte. Geben Sie dann fünf Mikroliter jeder Probe in die Vertiefungen und verschließen Sie die Platte.

Führen Sie als Nächstes die PCR aus, um die Ergebnisse zu analysieren. Berechnen Sie zunächst den CT-Cutoff-Wert. Im Allgemeinen entspricht der Cutoff-CT dem CT der positiven Wachstumskontrolle plus dem 0,5-fachen CT der negativen Wachstumskontrolle abzüglich des CT der Wachstumskontrolle.

Für Piperacillin ist jedoch Piperacillin mit Tazobactam und CEF Dazadi in gramnegativen Stäbchen sowie für Amoxicillin, Oxacillin und Trimethoprim mit Sulfamethoxazol in Staphylococcus aureus oder aus Amoxicillin enthalten. Bei Enterokokken SPP sollte der Multiplikationsfaktor von 0,5 auf 0,25 reduziert werden. Die Suszeptibilität oder Resistenz der Stämme in jeder Probe kann durch Vergleich der CT der Probe mit der Cutoff-CT bestimmt werden.

Ein CT-Wert über dem Cutoff zeigt die Anfälligkeit an, während ein CT unter dem Cutoff einen Widerstand anzeigt. Hier ist ein Beispiel für ein Diagramm zur Amplifikation der Antibiotika-Empfindlichkeit. Der zuvor identifizierte E-Coli-Stamm wurde auf seine Empfindlichkeit gegenüber mehreren Antibiotika getestet, die jeweils durch eine separate Kurve dargestellt werden.

Proben mit einem niedrigen CT-Wert sind Proben, bei denen ein Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums stattgefunden hat, das auf eine Resistenz gegen das getestete Antibiotikum hinweist. Im Gegenteil, ein hoher CT-Wert stellt eine Probe dar, in der kein Wachstum stattgefunden hat, was auf eine Empfindlichkeit gegenüber dem getesteten Antibiotikum hinweist. Diese Technik kann in neun Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.