Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man natürliche Killerzellen aus menschlichem Blut durch negative Selektion mit den Cocktail-Kits von Stem Cell Technologies isoliert.

Der Grund, warum wir dieses Kit von Stem Cell Technologies verwenden, liegt in der sehr hohen Reinheit der Zellen, die wir erhalten, und der negativen Selektion, die es uns ermöglicht, Zellen zu gewinnen, die nicht an einen Antikörper gebunden wurden. So treten keine unerwarteten Effekte bei diesen Zellen auf. Die Funktionsweise des Tsep-Kits beruht darauf, dass Antikörper vorhanden sind, die an alle Zellen im Blut binden, die für uns nicht von Interesse sind.

Im vorliegenden Fall binden Antikörper an Glycophorin A auf roten Blutkörperchen, wobei T-Zellen, B-Zellen und Monozyten beteiligt sind. Es wurde ein Antikörper gegen eine weiße Blutkörperchenart mit einem Antikörper gegen eine rote Blutkörperchenart verknüpft. Dadurch entsteht ein Komplex aus einer unerwünschten weißen Blutkörperchenzelle und mehreren roten Blutkörperchen. Da rote Blutkörperchen eine höhere Dichte aufweisen als weiße Blutkörperchen, sinken beim Zentrifugieren des Gemischs aus Blut und Antikörpern auf einer Dichtegradientenlösung die roten Blutkörperchen an das Röhrchenende und ziehen dabei alle unerwünschten weißen Blutkörperchen mit sich nach unten. Auf der Oberfläche verbleiben daher die reinen oder nahezu reinen natürlichen Killerzellen, die überhaupt nicht an einen Antikörper gebunden wurden.

Beginnen wir nun mit der Isolierung von NK-Zellen aus einer Röhre menschlichen Blutes. Dies ist frisch entnommenes Blut aus einer Röhre mit Natriumheparin. Ich werde den Roset ep, human NK Cell enrichment cocktail als Gradienten verwenden.

Später in meinem Experiment werde ich das 10 77 Histo-Paket verwenden, das eine Dichte von 1,077 aufweist, und ich habe außerdem eine Flasche PBS vorbereitet, die mit 2 % Fötales-Kalb-Serum ergänzt ist. Ich stelle sicher, dass diese Komponenten vor der Verwendung Raumtemperatur erreichen, da ich sie im Kühlschrank aufbewahre. Daher werde ich das gesamte Blutröhrchen nehmen und in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen geben.

Da es sich um einen Vakuumbehälter handelt, befindet sich darin ein Vakuum. Um ihn zu öffnen, ohne dass es spritzt, ortete ich die kleine Kerbe auf dem Deckel des Verschlusses und hebe diesen vorsichtig an, damit Luft in mein Röhrchen eindringen kann. Und sobald das Vakuum im Röhrchen aufgehoben ist, kann ich den Verschluss leichter entfernen und nehme dann eine 10-mL-Pipette, um das gesamte Blut aus dem Röhrchen abzupipettieren. Ich erwarte daher, dass sich etwa 10 mL Blut im Röhrchen befinden sollten.

Hier habe ich 9,5 ml Blut, und ich werde diese gesamten 9,5 ml in dieses 50-ml-Falcon-Röhrchen geben. Danach kommt die Pipette mit dem Blut direkt in die Bioabfallsammeltasche; das Röhrchen fülle ich immer mit etwas Bleiche auf, verschließe es und lege es anschließend ebenfalls in die Bioabfallsammeltasche. So sieht das Blut vor dem Zugabe des Antikörpercocktails aus.

Ich werde nun das Antikörpercocktail zum Blut hinzufügen, da ich etwa 9,5 ml Blut habe und 50 Mikroliter Cocktail pro ml Blut hinzufügen muss. Daher gebe ich 450 Mikroliter des Cocktails zu meinem Blut. Anschließend werde ich vorsichtig mischen, und fast unmittelbar werden Sie die Verklumpung beobachten können. Wie Sie jetzt sehen können, tritt die Verklumpung bereits auf.

Der Kreuzverlust zwischen den unerwünschten weißen Blutkörperchen und den roten Blutkörperchen findet also gerade statt. Ich stelle jetzt einen Timer auf 20 Minuten und lasse das Röhrchen 20 Minuten lang so im Sicherheitswerkbank stehen. Das Blut wurde nun 20 Minuten lang mit dem Rosetten-Sup-Cocktail inkubiert.

Ich werde es im Verhältnis 1:1 mit PBS plus fetalem Kälberserum verdünnen. Diese Mischung werde ich auf zwei 15-ml-Aliquots von Histo-Paque 1077 aufschichten. Danach werde ich die Probe 20 Minuten lang in der Zentrifuge zentrifugieren.

Ich habe also etwa 10 ml Blut plus Antikörper-Cocktail. Nun werde ich 10 ml PBS mit 2 % fetalem Kälberserum hinzufügen. Das ergibt eine Verdünnung im Verhältnis 1:1.

Ich muss vorsichtig mischen, da, wie Sie sehen, die PBS nicht sofort mit dem Blut vermischt, wenn ich sie hinzugebe. Daher mische ich einfach vorsichtig. Jetzt habe ich eine 1:1-Mischung von PBS mit Blut, und dies werde ich zu meinen 15 ml Histo-Pack hinzufügen.

Und ich werde es vorsichtig aufschichten, um eine Vermischung des Blutes mit dem Histo-Paket zu vermeiden. Dazu verwende ich statt einer 25-M-Pipette, die das gesamte Blut aufnehmen würde, eine 10-ml-Pipette und führe den Vorgang in mehreren Schritten durch. Um leichter aufschichten zu können, halte ich mein Histo-Paket-Röhrchen nahezu horizontal.

Ich werde etwas Blut auf das Röhrchen geben und es zum Histo-Pack bringen. Dann werde ich das Blut sehr langsam auf das Histo-Pack aufschichten. Sobald ich eine gleichmäßige Blutschicht habe, kann ich tatsächlich etwas schneller dosieren und das Röhrchen langsam wieder in eine vertikale Position zurückführen.

Nun habe ich meine gesamte Menge von 20 ml der Mischung aus Blut, Antikörper-Cocktail und PBS auf zwei 15-ml-Histopacks aufgeschichtet. Wie Sie an der Grenzfläche des Röhrchens erkennen können, beginnen sich langsam kleine Aggregate aus roten Blutkörperchen zu bilden, die langsam in das Gradientenmedium absinken. Wir werden die Probe kurz zentrifugieren, um diesen Prozess zu beschleunigen. Innerhalb von 20 Minuten werden sich alle roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens gesammelt haben.

Und es gibt einen sehr wichtigen Punkt beim Durchführen eines gt: Sie sollten die Bremse ausschalten, da ein zu schnelles Abbremsen Ihre Zutaten stören könnte. Deshalb schalten wir immer die Bremse aus und anschließend werde ich meinen Sohn RI für 20 Minuten aktivieren und ihn seine Arbeit verrichten lassen. Die Zutat wurde nun 20 Minuten lang zentrifugiert.

Wir haben also die verschiedenen Zellschichten. Wir beginnen hier am Boden des Reaktionsgefäßes. Hier befinden sich alle roten Blutkörperchen und die Zellen, die uns nicht interessieren.

Darüber befindet sich eine klare Schicht des Gradienten und darüber eine gelbliche Plasmaschicht. Die Zellen, die uns heute interessieren, sind die NK-Zellen; sie bilden einen dünnen, weißen Zellflaum zwischen der Gradienten- und der Plasmaschicht.

Daher ist diese Schicht sehr, sehr dünn, da NK-Zellen nur eine Minderheit der Blutzellen darstellen. Nun werde ich die Schicht der NK-Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette entfernen. Diese Schicht werde ich in ein neues, leeres 50-ml-Falcon-Gefäß geben.

Ich gehe also zur Schicht und pipettiere sie ab. Natürlich gibt es so wenige Zellen. Wenn man viele Zellen hat, kann man die Schicht sehr sauber erhalten, wenn so wenige Zellen vorhanden sind.

Und wie auf dem Hinweis des Herstellers empfohlen, wird empfohlen, etwas des Gradienten mit den Zellen abzupipettieren, um deren Verlust zu vermeiden. Daher pipettiere ich so lange ab, bis ich noch Zellen erkennen kann. Sobald alle Zellen entnommen sind, sollte ein deutlicher Kontrast zwischen dem klaren Reagenz und dem gelblichen Plasma erkennbar sein.

Ich glaube, ich habe nun alle meine Zellen gewonnen. Wenn Sie sich das Gradientenpräparat ansehen, erkennen Sie nichts Weißes und Verschwommenes an der Grenzfläche zwischen dem Histo-Pack und dem Plasma. Nun habe ich alle NK-Zellen, die ich im Gradienten sehen konnte, entfernt, in ein neues 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt und sofort etwas PBS, ergänzt mit 2 % Fötales Kälberserum, dem Röhrchen zugegeben.

Ich fülle es also auf 50 ml auf und werde die Zellen abzentrifugieren, um sie zu pelletieren. Das wird die erste Wäsche sein. Ich werde den Vorgang ein zweites Mal wiederholen, um die Zellen insgesamt zweimal zu waschen.

Und danach sind die Zellen bereit für jedes gewünschte Verfahren, entweder für die Kultivierung oder für die Durchflusszytometrie-Färbung. Sie sollten mindestens 80 % Reinheit an NK-Zellen erzielen, möglicherweise sogar mehr. Mit diesem Verfahren habe ich bis zu 98 % Reinheit erreicht.

Heute habe ich Ihnen eine sehr schnelle und zuverlässige Methode zur Isolierung natürlicher Killerzellen aus menschlichem Blut mithilfe der TS-Isolationskits von Stem Cell Technologies gezeigt. Und natürlich können Sie, falls Sie andere Zelltypen aus menschlichem, Ratten- oder Mäusematerial isolieren möchten, einen der zahlreichen T-Zell-Isolationskits verwenden. Es gibt Kits für T-Zellen, B-Zellen und sogar für Untergruppen von T-Zellen, beispielsweise.