Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions
September 2nd, 2011
Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten In-vitro- Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Durchführung einer langfristigen Co-Kultur von Nontypable Hemophilus influenza oder NTHI mit primärem humanem respiratorischem Epithelgewebe unter Verwendung des epi-Atemwegsmodells. Dies wird erreicht, indem die apikale Oberfläche mit NTHI beimpft wird, damit die Bakterien in einem zweiten Schritt am Gewebe haften und in das Gewebe eindringen können. Die Einsätze werden alle 24 Stunden mit vorgewärmtem DPBS gewaschen, um den normalen Schleimfluss nachzuahmen und Muzinabfallprodukte und Zelltrümmer zu entfernen.
Anschließend werden die Gewebe zum gewünschten Zeitpunkt entnommen und das Überleben von entweder gesamtzellassoziiertem oder internalisiertem NTHI bestimmt. Schließlich können mit dieser Methode stammspezifische Merkmale des NTHI-Überlebens innerhalb des Gewebes im Laufe der Zeit auf der Grundlage der Anzahl lebensfähiger Bakterien bewertet werden. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über Langzeitinfektionen mit nicht typisierbarer Hemophilus influenza geben.
Es kann auch bei der Untersuchung anderer menschlicher Krankheitserreger wie Moraxella Alis verwendet werden, um dieses Verfahren zu demonstrieren. Dr. Doin leitete einen Postdoktoranden in meinem Labor. Nehmen Sie die Transportplatte aus der Verpackung und bereiten Sie den Beginn des Experiments vor. Besprühen Sie die Transportplatte mit 70%igem Ethanol und legen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank.
Aliquotieren Sie einen Milliliter mit vier Grad Celsius, Epi-Atemwege, Erhaltungsmedium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Öffnen Sie dann nach dem Entfernen des Klebebandes die Platte und entfernen Sie die Gaze, die die epi-Atemwegseinsätze bedeckt. Verwenden Sie eine Pinzette, um mit einer Drehbewegung einen Einsatz aus dem Aros zu lösen.
Legen Sie den Einsatz bei Bedarf in eine der Vertiefungen der Sechs-Well-Platte. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um die Aros vorsichtig von der Einlage zu entfernen, und vermeiden Sie es, die Membran zu berühren. Vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen unter den Einsätzen eingeschlossen sind.
Und dann stellen Sie die Sechs-Well-Platte in einen Inkubator. Waschen Sie die Einlagen täglich wie folgt, wärmen Sie DPBS mit Calcium und Magnesium vor und füllen Sie eine Spitze mit dem DPBS. Nehmen Sie dann mit einer sterilen Pinzette einen Einsatz auf und pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter des vorgewärmten DPBS auf das Gewebe.
Bewegen Sie dann den Einsatz, um das DPBS gleichmäßig zu verteilen, ohne das Gewebe zu berühren. Kippen Sie dann den Einsatz schräg und setzen Sie eine Pipettenspitze P 1000 gegen den Kunststoffring, der die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Aspirieren Sie dann vorsichtig die Pufferlösung und geben Sie die Lösung für spätere Untersuchungen in ein Kryoröhrchen.
Zum Schluss aspirieren Sie das basale Erhaltungsmedium und ersetzen es durch einen Milliliter frisches Medium. Mehr DPBS mit Calcium und Magnesium vorwärmen. Geben Sie drei Milliliter des vorgewärmten DPBS in ein 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie dann einzelne Kolonien von nicht typisierbarer Influenza oder NTHI, die über Nacht auf Schokoladenagar gezüchtet wurden, in das Röhrchen.
Wirbeln Sie nun die Röhre mindestens 10 Sekunden lang kräftig vor und messen Sie dann die optische Dichte. Fügen Sie weiterhin einzelne Kolonien des NTHI hinzu, bis die Bakterienkonzentration einen OD von 600 Nanometern von etwa 0,7 erreicht. Waschen Sie anschließend jeden EPI-Atemwegseinsatz wie zuvor mit vorwärmtem DPBS und geben Sie dann 28 Mikroliter der Bakteriensuspension auf die apikale Oberfläche jedes Einsatzes.
Vermeidung der Inokulation des basalen Erhaltungsmediums. Stellen Sie dann die Platte wieder in den Inkubator, um die NTHI-Schokoladenagarplatten zuerst vorzuwärmen und dann an der Oberfläche trocken zu trocknen. Als nächstes verdünnen Sie das NTHI-Inokulum seriell mit sterilem PBS mit 0,1 % Gelatine oder PBSG.
Lassen Sie 10 Mikroliter Aliquots des Inokulums auf die Platten fallen und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Bestimmen Sie am nächsten Tag die KBE pro Milliliter, indem Sie die Verdünnung zählen, die 15 bis 30 verschiedene Kolonien in jedem Tropfen enthält, und rechnen Sie auf Ihr tatsächlich lebensfähiges Inokulum von NTHI zurück, um die Gesamtzahl der zellassoziierten Bakterien zu ernten. Spülen Sie die apikale Oberfläche der epi-Atemwege dreimal mit 200 Mikrolitern DPBS ohne Calcium oder Magnesium.
Kippen Sie dann den Einsatz und spülen Sie alle verbleibenden Pflegemedien von der Basalmembran ab. Legen Sie den gewaschenen Einsatz in eine frische Sechs-Well-Platte und geben Sie 250 Mikroliter sterile, 1%ige Saponinlösung auf die apikale Oberfläche jedes Gewebes. Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in den Inkubator, während die Platte inkubiert.
Richten Sie Röhrchen für die serielle Verdünnung ein, indem Sie jedes Verdünnungsröhrchen mit 900 Mikrolitern PBSG füllen. Schrubben Sie anschließend das Gewebe mit einer Pipettenspitze P 1000 in einer Hin- und Herbewegung von der Membran, gefolgt von einer kreisenden Bewegung, um das Gewebe von den Rändern des Einsatzes zu entfernen. Geben Sie dann die Suspension mit einer sterilen Pipettenspitze P 1000 mit großer Bohrung in ein leeres 1,5-Milliliter-Einorröhrchen.
Geben Sie nun 250 Mikroliter DPBS auf die apikale Oberfläche des Einsatzes und untersuchen Sie den Einsatz dann mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob noch Gewebe entnommen werden muss. Geben Sie die Suspension in das Einor-Röhrchen und füllen Sie es kräftig mit 500 Mikrolitern DPBS auf. Die Zellsuspension eine Minute lang vortexen.
Verwenden Sie dann eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Aspirieren Sie die Suspension durch die Nadel in die Spritze. Führen Sie die Suspension dreimal langsam durch die Nadel und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
Wirbeln Sie dann die Suspension eine weitere Minute lang kräftig durch. Verwenden Sie anschließend eine Pipettenspitze mit großem Durchlauf, um 100 Mikroliter der Suspension in das erste Verdünnungsröhrchen zu übertragen. Wirbeln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang kräftig vor und lassen Sie dann eine bis 10 Serienverdünnungsplatten die Verdünnung auf Schokoladenagarplatten tropfen.
Dann inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, um lebensfähige Bakterienzahlen zu erhalten, um internalisierte Bakterien zu ernten. Waschen Sie jede Einlage nur dreimal mit 200 Mikrolitern DPBS. Ersetzen Sie das basale Erhaltungsmedium durch Medien, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycinsulfat enthalten, und fügen Sie dann 300 Mikroliter des Gentamycin-haltigen Erhaltungsmediums auf die apikale Oberfläche hinzu.
Legen Sie die Einsätze für eine Stunde in den Inkubator, während die Einsätze inkubiert werden, und erwärmen Sie etwas DPBS. Entfernen Sie dann das Gentamycin-haltige Pflegemedium von der apikalen Oberfläche. Waschen Sie anschließend die apikale Oberfläche und die Basalmembran der Einlagen ausgiebig mit dem vorgewärmten DPBS.
Wiederholen Sie abschließend das soeben gezeigte Schrubb- und Ernteverfahren, bevor Sie serielle Verdünnungen und Plattierungen der internalisierten Bakterien in dieser Abbildung durchführen. Vergleich von Rasterelektronenmikroskop-Bildern von nicht infiziertem Epi-Atemwegsgewebe auf der linken Seite mit fünf Tage NTHI infiziertem Epi-Atemwegsgewebe auf der rechten Seite. Es ist zu erkennen, dass eine langfristige Co-Kultur mit NTHI nicht zu einer signifikanten Schädigung des apikalen Gewebes führt, was den Nutzen des epi-Atemwegsmodells unterstreicht.
Hier ist eine Grafik dargestellt, die die Anzahl der im Laufe der Zeit internalisierten NTHI während einer Epi-Atemwegs-Co-Kultur darstellt. Der Stamm R 2, 8, 6, 6 wurde mit etwa eins mal 10 der siebten KBE pro Insert inokuliert. Dann wurden internalisierte Bakterien geerntet und zu jedem angegebenen Zeitpunkt gezählt.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine langfristige Co-Kultur von NTHI mit dem primären Hormon Atemgewebe unter Verwendung des A-PRE-Modells durchführen können.
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Überblick
Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von erweiterten bakteriellen Co-Kulturen mit EpiAirways, einem biologisch relevanten in vitro Modell unter Verwendung von primärem humanem Atemwegsepithelgewebe. Der Ansatz kann mit jedem Mikrobentyp verwendet werden, der für eine Langzeit-Co-Kultur geeignet ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Atemwegsbiologie
- In-Vitro-Modelle
Hintergrund
- Nontypeable Hemophilus influenza (NTHI) ist ein bedeutender Krankheitserreger bei Atemwegsinfektionen.
- Das Verständnis bakterieller Interaktionen mit Atemwegsepithelgeweben ist entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen.
- Das EpiAirways-Modell ahmt die menschliche Atemwegsumgebung nach.
- Langzeit-Co-Kultur-Studien können Einblicke in das Überleben und Verhalten von Bakterien liefern.
Zweck der Studie
- Um eine Langzeit-Co-Kultur von NTHI mit primärem humanem Atemwegsepithelgewebe durchzuführen.
- Um das Überleben von NTHI innerhalb der Gewebe im Laufe der Zeit zu bewerten.
- Um stammspezifische Eigenschaften des NTHI-Überlebens zu beurteilen.
Verwendete Methoden
- Impfung der apikalen Oberfläche des Epithelgewebes mit NTHI.
- Waschen der Einsätze alle 24 Stunden mit vorgewärmtem DPBS, um den Schleimfluss nachzuahmen.
- Ernte der Gewebe zu gewünschten Zeitpunkten für die Analyse.
- Bestimmung des Überlebens von insgesamt zellassoziierten oder internalisierten NTHI.
Hauptergebnisse
- Einblicke in Langzeitinfektionen mit NTHI wurden gewonnen.
- Lebensfähige Bakterienzahlen wurden verwendet, um die Überlebenseigenschaften von NTHI zu bewerten.
- Die Methode zeigte die Fähigkeit, bakterielles Verhalten in einem relevanten Modell zu beurteilen.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Forschungen zu Atemwegsinfektionen beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung bakterieller Co-Kulturen mit humanem Atemwegsgewebe.
- Es verbessert das Verständnis von NTHI-Interaktionen mit Epithelzellen.
- Der Ansatz kann für andere Mikroben in ähnlichen Studien angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The EpiAirway model enables long-term co-culture of respiratory pathogens with primary human epithelial tissues, addressing a critical gap in preclinical infection modeling. This approach supports mechanistic de-risking of host-pathogen interactions and improves predictive confidence in early-stage antimicrobial target validation. By maintaining tissue integrity and physiological relevance over extended periods, it enhances translational continuity from discovery to preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of cell-associated and internalized bacteria over time.
- Operational Value: Supports functional target validation by assessing strain-specific survival characteristics in a human-relevant system.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by modeling chronic infection phenotypes not supported by submerged cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative dependent variable measurements (CFU counts) for evaluating antimicrobial efficacy and bacterial persistence.
- Operational Value: Enables assay standardization through daily washing with pre-warmed DPBS to mimic mucociliary clearance and reduce variability.
- Scientific Value: Supports screening readiness by allowing mucin production and cytokine profiling as secondary readouts for host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant system (normal human tracheo-bronchial cells) to improve translational biomarker alignment for respiratory infections.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by maintaining tissue structure and function during long-term co-culture.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by characterizing long-term host-pathogen interactions without significant apical tissue damage.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal tracking of bacterial adherence, invasion, and survival.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility via standardized inoculum preparation (OD 600 nm ~0.7) and serial dilution plating for viable bacterial counts.
- Analytics: Generates quantitative readouts (CFU/mL) that allow comparison of strain-specific survival and evaluation of intervention effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of primary human tissues that retain cytokine production and mucin secretion capabilities.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform adaptable to other respiratory pathogens (e.g., Moraxella catarrhalis) beyond NTHi.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in chronic infection models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via antibiotic-free conditions and defined washing protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying compounds that reduce bacterial internalization or persistence over time.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal infection dynamics rather than acute cytotoxicity endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue handling and biosafety level 2 practices for co-culture of bacteria and human cells.
- Dependent on specialized inserts and air-liquid interface culture systems (e.g., MatTek EpiAirway).
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation, washing frequency, and harvesting procedures.
- Adaptation considerations include validation of pathogen compatibility with mucociliary clearance mimicry and tissue integrity over time.
- Practical limitation: Extended co-culture increases contamination risk, requiring strict aseptic technique in shared biosafety cabinets.
