Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Langzeit-Kokultur von nicht typisierbarem Haemophilus influenzae oder NTHI mit primären humanen Atemepithelgeweben unter Verwendung des Epi-Airway-Modells durchzuführen. Dies wird erreicht, indem die apikale Oberfläche mit NTHI infiziert wird, um den Bakterien im zweiten Schritt die Adhäsion an und das Eindringen in das Gewebe zu ermöglichen. Die Inserts werden alle 24 Stunden mit vorgewärmtem DPBS gewaschen, um den normalen Schleimfluss nachzuahmen und Mukin-Abbauprodukte sowie zellulären Abfall zu entfernen.

Anschließend werden die Gewebe zum gewünschten Zeitpunkt entnommen und die Überlebensfähigkeit von entweder gesamtzellgebundenen oder internalisierten NTHI bestimmt. Schließlich können mit dieser Methode stammspezifische Eigenschaften des NTHI-Überlebens in den Geweben über die Zeit hinweg anhand von Keimzahlen bewertet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in langanhaltende Infektionen mit nontypisierbarem Haemophilus influenzae ermöglichen kann.

Es kann auch bei der Untersuchung anderer menschlicher Krankheitserreger wie Moraxella Alis verwendet werden. Diese Prozedur wird von Dr. Doin ran, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Entfernen Sie die Transportplatte aus der Verpackung und bereiten Sie sich auf den Beginn des Experiments vor. Besprühen Sie die Transportplatte mit 70 % Ethanol und stellen Sie die Platte in den Sicherheitswerkbank.

Geben Sie je ein Milliliter Vier-Grad-Celsius-Epi-Atemwegs-Wartungsmedium in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte. Entfernen Sie danach das Klebeband, öffnen Sie die Platte und nehmen Sie den Gazeüberzug von den Epi-Atemwegs-Inserts ab. Benutzen Sie mit einer Drehbewegung eine Pinzette, um ein Insert aus den Aros zu lösen.

Platzieren Sie den Insert in eine der Vertiefungen der 6-Loch-Platte, falls erforderlich. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um vorsichtig die Aros vom Insert zu entfernen, wobei Sie die Membran nicht berühren sollten. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter den Inserts befinden.

Und dann die sechswellige Platte in einen Inkubator stellen. Die Inserts täglich wie folgt waschen: DPBS mit Calcium und Magnesium vorwärmen und eine Pipettenspitze mit dem DPBS füllen. Anschließend mit sterilen Pinzetten vorsichtig ein Insert anheben und 200 Mikroliter des vorgewärmten DPBS auf das Gewebe pipettieren.

Danach den Einsatz vorsichtig schwenken, um das DPBS gleichmäßig zu verteilen, ohne das Gewebe zu berühren. Anschließend den Einsatz schräg halten und die Spitze einer P-1000-Pipette an den Kunststoffring anlegen, der die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Dann die Pufferlösung vorsichtig abpipettieren und in ein Kryoröhrchen für spätere Untersuchungen geben.

Entfernen Sie abschließend das basale Erhaltungsmedium durch Aspiration und ersetzen Sie es durch ein Milliliter frisches Medium. Erwärmen Sie zusätzliches DPBS mit Calcium und Magnesium vor. Geben Sie drei Milliliter des vorgewärmten DPBS in ein 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie anschließend einzelne Kolonien von nicht typisierbarem Influenza-Virus oder NTHI, die über Nacht auf Schokoladenagar gezüchtet wurden, in dem Röhrchen.

Versetzen Sie das Röhrchen nun mindestens 10 Sekunden lang kräftig im Vortex, und messen Sie anschließend die optische Dichte. Fügen Sie weiterhin einzelne Kolonien des NTHI hinzu, bis die Bakterienkonzentration einen OD von etwa 0,7 bei 600 Nanometern erreicht. Waschen Sie danach jeden EPI-Atemwegsinsert erneut mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie anschließend 28 Mikroliter der bakteriellen Suspension auf die apikale Oberfläche jedes Inserts.

Vermeiden Sie, das basale Pflegemedium zu beimpfen. Danach kehren Sie die Platte in den Inkubator zurück, um zunächst vorgewärmte und anschließend oberflächentrockene Schokoladen-Agar-Platten mit NTHI zu quantifizieren. Verdünnen Sie anschließend den NTHI-Inokulum seriell mithilfe von steriler PBS mit 0,1 % Gelatine oder PBSG.

Geben Sie Aliquote von jeweils 10 Mikroliter Inokulum auf die Platten und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag ermitteln Sie die Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter, indem Sie die Verdünnung zählen, die 15 bis 30 deutliche Kolonien pro Tropfen aufweist, und rechnen anschließend zurück auf Ihr tatsächliches lebensfähiges Inokulum von NTHI, um die Gesamtzahl der zellgebundenen Bakterien zu ermitteln. Spülen Sie die apikale Oberfläche der Epi-Airways dreimal mit jeweils 200 Mikroliter DPBS ohne Calcium oder Magnesium.

Danach kippen Sie den Einsatz und spülen Sie das restliche Pflegemedium von der basalen Membran ab. Legen Sie den gewaschenen Einsatz in eine neue sechswellige Platte und geben Sie 250 Mikroliter sterile 1%-Saponin-Lösung auf die apikale Oberfläche jedes Gewebes. Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in den Inkubator, während die Platte inkubiert wird.

Richten Sie Röhrchen für die serielle Verdünnung ein, indem Sie jedes Verdünnungsröhrchen mit 900 Mikrolitern PBSG füllen. Danach bürsten Sie das Gewebe mit einer P-1000-Pipettenspitze mithilfe einer vorwärts-rückwärts-Bewegung von der Membran ab, gefolgt von einer kreisförmigen Bewegung, um das Gewebe von den Rändern des Inserts zu lösen. Anschließend geben Sie mit einer sterilen, großgebohrigen P-1000-Pipettenspitze die Suspension in ein leeres 1,5-Milliliter-Einmalkunststoffröhrchen.

Geben Sie nun 250 Mikroliter DPBS auf die apikale Oberfläche des Inserts und untersuchen Sie das Insert unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob noch Gewebe zur Gewinnung vorhanden ist. Fügen Sie die Suspension dem Einor-Röhrchen hinzu und überlagern Sie sie kräftig mit 500 Mikrolitern DPBS. Vortexen Sie die Zellsuspension eine Minute lang.

Dann unter Verwendung einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel die Suspension durch die Nadel in die Spritze aufziehen. Die Suspension langsam dreimal durch die Nadel leiten, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen zu erzeugen.

Anschließend die Suspension erneut kräftig eine Minute lang verwirbeln. Danach 100 Mikroliter der Suspension mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser in das erste Verdünnungsrohr überführen. Das Rohr fünf Sekunden lang kräftig verwirbeln und anschließend eine serielle Verdünnung im Verhältnis 1:10 herstellen, indem man Tropfen der Verdünnung auf Schokoladen-Agar-Platten aufträgt.

Anschließend die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren, um lebensfähige Bakterienzahlen zur Gewinnung internalisierter Bakterien zu erhalten. Jeden Insert nur dreimal mit 200 Mikrolitern DPBS waschen. Das basale Erhaltungsmedium durch Medium ersetzen, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicinsulfat enthält, und dann 300 Mikroliter des Gentamicin-haltigen Erhaltungsmediums auf die apikale Oberfläche geben.

Bringen Sie die Inserts für eine Stunde in den Inkubator zurück und erwärmen Sie währenddessen etwas DPBS vor. Entfernen Sie anschließend das auf der apikalen Oberfläche enthaltene Erhaltungsmedium mit Gentamycin. Waschen Sie danach die apikale Oberfläche und die basale Membran der Inserts umfassend mit dem vorgewärmten DPBS.

Abschließend wiederholen Sie den zuvor gezeigten Vorgang zum Abschrubben und Sammeln, bevor serielle Verdünnungen durchgeführt und die internalisierten Bakterien in dieser Abbildung ausplattiert werden. Ein Vergleich von Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen uninfizierter Epi-Atemwegsgewebe auf der linken Seite mit fünf Tage lang mit NTHI infizierten Epi-Atemwegsgeweben auf der rechten Seite zeigt, dass eine Langzeit-Kokultur mit NTHI keine signifikanten Schäden an den apikalen Geweben verursacht und unterstreicht damit die Nützlichkeit des Epi-Atemwegsmodells.

Hier ist ein Diagramm dargestellt, das die Anzahl der über die Zeit internalisierten NTHI-Bakterien während einer epi- Atemwegs-Kokultur zeigt. Der Stamm R 2 8 6 6 wurde mit etwa einem Mal 10 hoch 7 CFU pro Insert inoculiert. Anschließend wurden die internalisierten Bakterien zu den jeweils angegebenen Zeitpunkten gewonnen und gezählt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Langzeit-Kokultur von NTHI mit primären, hormonbehandelten Atemwegsgeweben unter Verwendung eines PRE-Modells durchführt.