Name: Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Langzeit-Kokultur von NTHI mit primären menschlichen Atemwegsepithelien im EpiAirway-Modell. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Wirt-Pathogen-Interaktionen über längere Zeiträume.

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Wir möchten Patrick Hayden (MatTek) für hilfreiche Diskussionen danken, und Robert Smith und Libby Perry of Georgia Health Sciences University für ihre EM Fähigkeiten. Diese Studie wurde von NIDCD gewähren DC010187 zu DAD finanziert

1. Vorbereiten des Biosicherheitswerkbank für die EpiAirway Gewebe <ol><li> Das Tragen eines speziellen Laborkittel, mit Haar zurück und Handschuhen verbunden, starten Sie den laminaren Strömung. Nach 5 Minuten, verschieben Sie alle Werkzeuge im Schrank (Pipetten, Spitzen, Reaktionsgefäße usw.) auf der einen Seite, sprühen die Biosicherheit Schrankinneren und Flügel mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberen Papiertüchern. Spray die gereinigte Innenraum wieder mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Bewegen Sie die Werkzeuge, um auf der sauberen Seite und wiederholen Sie den Vorgang Ethanol. </li><li> Verwenden Sie Aerosolbarriere Pipettenspitzen und engagierten Pipetten in den Schrank. Zur Verwendung einzeln verpackte sterile serologische Pipetten, vorbei am gesteckt Ende durch den laminaren Strömung, aufzubrechen, und schieben Sie die Pipette in das Kabinett, das Verwerfen der Verpackung außen. </li><li> Die EpiAirway Beilagen müssen mit einer sterilen Pinzette gehandhabt werden. Legen Sie 6-Zoll-Fein-Spitze gebogenen Pinzette in selbstdichtend Sterilisation Beutel und Autoklaven. Bereiten Sie genug, um mindestens sechs pro Tag einsatzbereit. </li></ol> 2. Auspacken des EpiAirway Gewebe <ol><li> Sprühen Sie die Arbeitsfläche in der Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberem Küchenpapier. Spray wieder und lassen die Oberfläche zu trocknen, bevor zu verwenden. Öffnen Sie die EpiAirway Feld und entsorgen Sie die Styropor und Verpackungsmaterial. </li><li> Die EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung, AIR-100-MM ABF (MM), sind Eigentum von MatTek und ist im Kit mit den Einsätzen geschickt. In der Biosicherheitswerkbank, label sechs sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen mit den Medientyp und Datum, und lösen Sie die Kappen. Sprühen Sie die Medien-Flasche mit 70% Ethanol und öffnen im Schrank. Aliquot 25 ml MM in jedes Röhrchen mit einer neuen sterilen serologischen Pipette für jedes Rohr, ziehen Sie die Kappen, und lagern bei 4 ° C. Verwenden Sie ein frisches Aliquot MM jeden Tag. </li><li> Wiederholen Sie Punkt 2.2 mit einer frischen Flasche 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) mit Kalzium und Magnesium. Wiederholen Sie den Vorgang mit D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Speichern Sie alle Aliquots bei 4 ° C. </li><li> Die EpiAirway Einsätze AIR-100 kommen in einem 24-Well-Platte bei 4 ° C auf festen Medien-haltige Agarose, und muss in 6-well Platten für den Einsatz gebracht werden. Beschriften Sie jede Platte mit dem Datum und Beschreibung mit einem Ethanol-resistente Marker. Platz 1 Milliliter 4 ° C EpiAirway MM in jedes Well. Entfernen Sie die Transportsicherung Platte aus der Verpackung, Spray mit 70% Ethanol, und in der Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie das Klebeband und öffnen Sie die Platte. Mit autoklaviert Zange, entfernen Sie die feuchten Gaze über die EpiAirway Einsätze. </li><li> Pick-up ein Insert mit autoklaviertem Pinzette mit einer Drehbewegung in die Freigabe aus dem Agarose-Hilfe, und in einen Napf einer 6-Well-Platte. Einige Agarose kann, um den Einsatz halten, zumal die Temperatur der Transportplatte auf Umgebungstemperatur steigt. Verwenden Sie eine sterile Wattestäbchen, um vorsichtig die Agarose aus dem Einsatz. Berühren Sie nicht die Membran, und überprüfen, dass keine Luftblasen unter der Einsätze sind gefangen. Legen Sie die Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Lassen Sie mindestens 24 Stunden für die Gewebe in den Inkubator vor dem Start Co-Kulturen ausgleichen. </li></ol> 3. Wartung von EpiAirway Gewebe <ol><li> Mit autoklaviert Zange holen ein Insert und sanft Pipette 200 Mikroliter vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium auf das Gewebe und Rock des Einsatzes. Kippen Sie das Insert in einem Winkel und platzieren Sie Ihre sterile P1000 Pipettenspitze gegen die Kunststoff-Ring, dass die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Berühren Sie nicht das Gewebe. Saugen Sie das D-PBS spülen und in einen markierten sterile Kryoröhrchen. Die Proben können bei -20 ° C eingefroren und untersucht für Mucin und / oder Zytokin-Expression zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Ändern Sie den basalen MM täglich durch Absaugen und Austauschen mit 1 Milliliter frisches MM. Verwenden Sie eine neue Barriere Pipettenspitze für jedes Well. Behandeln Sie die verwendeten Medien mit 10% Bleiche Nacht und entsorgen. </li></ol> 4. Inokulation von EpiAirway Gewebe <ol><li> Streak eine frische Kultur nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) aus gefrorenen Glycerin Lager auf Schokolade-Agar. Wachsen Sie über Nacht in einer feuchten 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag, resuspendieren einzelne Kolonien von NTHi in vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium zu einer OD (600 nm) von ca. 0,7. Vortex kräftig vor der Messung der optischen Dichte. Das Verhältnis der optischen Dichte auf Kolonie-bildenden Einheiten pro ml (KBE / ml) von NTHi ist, dass eine OD (600 nm) von 0,2 entspricht in etwa 1,0 x 10 8 CFU / ml. Daher ist eine OD (600 nm) von 0,7 etwa 3,5 x 10 8 CFU / ml. Dieser Algorithmus sollte für jeden NTHi Belastung vor der Impfung überprüft werden. </li><li> Die EpiAirway Gewebe AIR-100 sind auf Einsätze mit einer Fläche von 0,6 cm 2 und eine 0,4 Mikron Membran gewachsen. Die Gewebe werden von ~ 8,0 x 10 5 bis ~ 1,0 x 10 6 komponiert &lt;/ Sup&gt;-Zellen. Daher entspricht eine Impfung von 1,0 x 10 7 CFU zu einer Multiplizität der Infektion von etwa 10 bis 12. Um zu impfen, spülen jedes EpiAirway einfügen wie in 3.1, dann fügen Sie 28 Mikroliter der Bakteriensuspension in 4,2 bis der apikalen Oberfläche von jedem EpiAirway Einsatz im Biosicherheitswerkbank vorbereitet. Nicht impfen die basale MM. Return jede Platte in den Inkubator. </li></ol> 5. Die Quantifizierung der NTHi Inokulum <ol><li> Bereiten Sie eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Lösung mit 0,1% Gelatine (PBS-G), Autoklaven zu sterilisieren. Label sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit der gewünschten 1:10 Verdünnungen auf der OD (600 nm) des Inokulums und aliquoten 900 Mikroliter der sterile PBS-G in jedes Röhrchen basiert. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um den geimpften NTHi aufzuzählen. Legen Sie diese Platten in einem Luft-Inkubator auf den Kopf mit der Unterseite der Platte ruht auf der Hälfte der oben für eine Stunde. Damit wird die Platte sowohl warm bis 37 ° C und die Oberfläche zu trocknen, die Erleichterung der Drop-Beschichtung von NTHi. </li><li> Starten Sie das serielle 1:10 Verdünnungen des Inokulums durch Zugabe von 100 Mikroliter der Bakteriensuspension von 4,2 auf der ersten Röhre. Vortex jeder Verdünnung kräftig für 5 Sekunden bevor die nächste. Drop 10 Mikroliter Aliquots auf den vorgewärmten und Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten, mit der Hälfte der Platte für jede Verdünnung. Fünf bis sechs 10 Mikroliter Aliquots können auf einer Hälfte eines jeden 100 mm Platte ohne fließendes zusammen passen. Wenn trocken, statt den Kopf in einer befeuchteten 37 ° C CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag bestimmen die CFU / ml durch Zählen der Verdünnungen, 15-30 verschiedene Kolonien in jedem Tropfen haben und die Berechnung zurück an Ihren aktuellen lebensfähig Inokulum von NTHi. </li></ol> 6. Langfristige Co-Kultur mit NTHi <ol><li> Alle 24 Stunden, waschen Sie die Einsätze wie in 3.1, dann ist die Waschungen jedes Gewebe, das mit dem gleichen Stamm von Bakterien und bei -20 ° C in einer markierten Kryoröhrchen für zukünftige Analysen wurden geimpft Pool. Diese Proben können auf das Vorhandensein von Mucin durch Dot-Blots oder für die Expression von Zytokinen mittels ELISA getestet werden. Alternativ kann Gewebe für mRNA geerntet werden und qPCR können auf Gene von Interesse durchgeführt werden. Ändern Sie den basalen MM täglich in 3,2. Fahren Sie für die Dauer der Co-Kultur. </li></ol> 7. Die Ernte der EpiAirway Gewebe <ol><li> Bereiten Sie eine frische 1% ige Lösung von Saponin in D-PBS ohne Calcium und Magnesium-, Filter-sterilisiert und warm bis 37 ° C. </li><li> Warm eine 50 ml Tube MM und anderen von D-PBS ohne Calcium und Magnesium zu 37 ° C. </li><li> Bereiten Verdünnungsröhrchen wie in 5.1, sowie eine leere sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pro Platte, mit der Nummer und NTHi Belastung gekennzeichnet. </li><li> Die EpiAirways kann entweder für insgesamt Zell-assoziierten Bakterien geerntet werden, die sowohl Anhänger und verinnerlicht Organismen oder für internalisierte Bakterien nur. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um Drop-Platte der Zell-assoziierten oder überfallen NTHi, Etiketten und trocken für eine Stunde in einer Luft-Inkubator wie in 5.2. </li><li> Zur Ernte insgesamt Zell-assoziierten Bakterien, spülen Sie die apikale Oberfläche der EpiAirways dreimal mit 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium, dann kippen Sie das Insert und spülen Sie alle verbleibenden MM von der Basalmembran. Die erste Wäsche kann für eine spätere Analyse eingefroren werden; entsorgen Sie die folgenden Wäschen. </li><li> Legen Sie die gewaschenen einfügen in eine neue 6-well-Platte ohne MM und Pipette 250 Mikroliter der sterile 1% Saponin-Lösung von 7,1 auf der apikalen Oberfläche der einzelnen Gewebe. Zurück zu den Inkubator für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie aus dem Inkubator und mit einem sterilen P1000 Pipettenspitze, schrubben die Gewebe von der Membran mit einem Hin-und Herbewegung, durch eine kreisförmige Bewegung, um das Gewebe an den Rändern des Einsatzes zu entfernen. Mit einer großen Bohrung sterile P1000 Pipettenspitze, legen Sie die Suspension in die leere beschriftet Rohr in 7,3 zubereitet. Eintragen von 250 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium auf der apikalen Oberfläche der Einlage. </li><li> Untersuchen Sie die CD mit einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob es eine verbleibende Gewebe geerntet werden. Wenn nötig, wieder schrubben mit einem anderen sterilen P1000 Pipettenspitze, dann fügen Sie diese Suspension auf das Rohr von 7,8 mit einer großkalibrigen sterile P1000 Pipettenspitze. Bringen Sie das Gesamtvolumen des Rohres zu 1 Milliliter mit D-PBS ohne Calcium oder Magnesium. </li><li> Kräftig Wirbel der Zellsuspension bei Höchstgeschwindigkeit für 1 Minute. Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet, saugen die Suspension in der Spritze durch die Nadel. Langsam gehen die Suspension durch die Nadel 3-mal, dabei nicht zu Blasen zu erzeugen. Vortex kräftig wieder für 1 Minute. </li><li> Mit einer großen Bohrung Pipettenspitze, Platz 100 Mikroliter der Suspension in den ersten Verdünnungsröhrchen in 7 vorbereitet.3. Vortex kräftig für fünf Sekunden, dann machen serielle 1:10 Verdünnungen. Drop-Platte den gewünschten Verdünnungen auf die Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten. </li><li> Zur Ernte verinnerlicht Bakterien nur, waschen jeden Einsatz 3 mal mit je 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium. Bewahren und frieren die ersten Waschgang. Add Gentamicinsulfat auf vorgewärmten MM, um eine endgültige Konzentration von 100 Mikrogramm / ml. Bereiten Sie 1,5 ml Medium pro Platte geerntet werden. Ersetzen Sie die basale MM mit der Gentamicin-haltigen MM, und 300 Mikroliter Gentamicin-haltigen MM auf der apikalen Oberfläche. Legen Sie die Platte wieder in die CO 2-Inkubator für eine Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Gentamicin-haltigen MM aus der apikalen Oberfläche und waschen die apikale Oberfläche und Basalmembran des Einsatzes ausführlich mit vorgewärmten D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Gehen Sie wie in 7,7-7,11. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (A.) nicht infizierten EpiAirway Gewebe und (B) Gewebe nach einer 5-Tage-Co-Kultur mit NTHi sind in Abbildung 1 dargestellt. Langfristige Co-Kultur mit NTHi nicht zu erheblichen Schäden an der apikalen Ergebnis Gewebe, unterstreicht den Nutzen der EpiAirway Modell. Eine graphische Darstellung, die Zahl der internalisierten Bakterien im Laufe der Zeit im Gewebe quantifiziert wird in Abbildung 2 dargestellt. Beide Ergebnisse sind recht reproduzierbar, so dass die EpiAirway Gewebe eine konsistente und biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege in die Studie NTHi Wirt-Pathogen- Wechselwirkungen. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie EpiAirway Gewebe. A. infizierte Kontroll-Gewebe. B. Tissue nach fünf Tagen der Co-Kultur mit NTHi. Keine signifikanten Schäden an der apikalen Oberfläche ist in den infizierten Geweben beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Anzahl der NTHi verinnerlicht im Laufe der Zeit während EpiAirway Co-Kultur. Der Stamm R2866 wurde auf etwa 1,0 x 10 7 CFU / insert (Tag 0), dann für verinnerlicht Bakterien bei jedem angegebenen Zeitpunkt geerntet geimpft. Bars repräsentieren n = 3 Wiederholungen in mindestens verdoppeln. Fehlerbalken sind SD.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Methode erlaubt die Untersuchung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem biologisch relevanten Hintergrund von primären humanen respiratorischen Gewebe an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Hier haben wir NTHi als der Erreger verwendet, sondern das Zusammenspiel von Bakterien, die nicht vorstellen unannehmbar Zytotoxizität im Laufe der Zeit kann mit dieser Methode quantifiziert werden. Die EpiAirway Modell kann auch für das Studium von Viren, Medikamente oder Chemikalien, die Auswirkungen des menschl...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25g </td><td> 1% in D-PBS ohne Calcium oder Magnesium-, Filter-sterilisiert </td></tr><tr><td> 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway Antibiotika-freien Geweben </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Geliefert mit kit </td></tr><tr><td> 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Verdünnen auf 1X vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,1% in 1 X PBS und Autoklaven </td></tr><tr><td> Difco GC Medium Base (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave 36 g in 500 ml ddH 2 O und kühl bis 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL Hämoglobin (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave 10 g in 500 ml ddH 2 O, kühl bis 60 ° C und vermischen sich mit der GC Basisnährboden oben </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX Anreicherung (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Das Gemisch von GC Basisnährboden und Hämoglobin bis 55 ° C und 10 ml rehydratisiert IsoVitaleX, pour Schokolade-Agar-Platten </td></tr><tr><td> Anatomische Pinzette, feine Spitze, gebogene </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Self-Abdichtung Sterilisation Beutel </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin-Sulfat, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Add 10 Mikroliter / ml bis EpiAirway MM für die Gentamicin töten </td></tr></tbody></table>

die nutzung der epiairway modell zur charakterisierung langfristige host-pathogen interactions

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sind Menschen angepassten Gram-negative Bakterien, die wiederkehrende und chronische Infektionen der Schleimhaut der Atemwege 1 Ursache kann; 2. Um die Mechanismen, mit denen diese Organismen an und im respiratorischen Gewebe überleben, ein Modell, in dem langfristig erfolgreiche Co-Kultur von Bakterien und menschlichen Zellen durchgeführt wird, gefordert werden kann, zu studieren. Wir verwenden primären humanen respiratorischen Epithelzellen Gewebe angehoben, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die EpiAirway Modell (MatTek, Ashland, MA). Diese sind nicht unsterblich, gut differenzierten, 3-dimensionale Gewebe, die Tight Junctions, Flimmer-und nonciliated Zellen, Becherzellen, dass Mucin zu produzieren, und behalten die Fähigkeit, Zytokine in Reaktion auf eine Infektion zu erzeugen enthalten. Diese biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege kann in einer Reihe von Arten verwendet werden; das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, langfristige Zusammenarbeit Kultur EpiAirway Gewebe mit NTHi und zu quantifizieren zellassoziierte und verinnerlicht Bakterien im Laufe der Zeit durchführen . Wie gut, kann Mucin Produktion und die Zytokin-Profil der infizierten Co-Kulturen bestimmt werden. Dieser Ansatz verbessert existierende Verfahren in, dass viele aktuelle Protokolle verwenden untergetaucht Mono-oder Transwell Kulturen von menschlichen Zellen, die nicht fähig sind, unterstützen bakterielle Infektionen über längere Perioden 3. Zum Beispiel, wenn ein Organismus in der darüber liegenden Medien replizieren kann, kann dies zu nicht akzeptablen Niveau der Zytotoxizität und der Verlust der Wirtszellen durch, verhaftete das Experiment. Die EpiAirway Modell ermöglicht die Charakterisierung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Ferner kann, da die Quelle für die EpiAirway ist normale menschliche tracheobronchialen Zellen anstatt einer immortalisierten Linie ist jeder eine ausgezeichnete Darstellung der tatsächlichen menschlichen oberen Atemwege Gewebe, sowohl in Struktur und in Funktion 4. Bei dieser Methode werden die EpiAirway Gewebe entwöhnt von anti-mikrobiellen und Anti-Pilz-Verbindungen für 2 Tage vor der Auslieferung, und alle Verfahren sind unter Antibiotika-freien Bedingungen durchgeführt. Dies erfordert besondere Überlegungen, da beide Bakterien und primären humanen Geweben in der gleichen Biosicherheitswerkbank verwendet werden und sind Co-Kultivierung über einen längeren Zeitraum.

Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae (NTHi) sind an den Menschen angepasste gramnegative Bakterien, die rezidivierende und chronische Infektionen der Atemwege verursachen können ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Langzeit-Kokultur von nicht typisierbarem Haemophilus influenzae oder NTHI mit primären humanen Atemepithelgeweben unter Verwendung des Epi-Airway-Modells durchzuführen. Dies wird erreicht, indem die apikale Oberfläche mit NTHI infiziert wird, um den Bakterien im zweiten Schritt die Adhäsion an und das Eindringen in das Gewebe zu ermöglichen. Die Inserts werden alle 24 Stunden mit vorgewärmtem DPBS gewaschen, um den normalen Schleimfluss nachzuahmen und Mukin-Abbauprodukte sowie zellulären Abfall zu entfernen.Anschließend werden die Gewebe zum gewünschten Zeitpunkt entnommen und die Überlebensfähigkeit von entweder gesamtzellgebundenen oder internalisierten NTHI bestimmt. Schließlich können mit dieser Methode stammspezifische Eigenschaften des NTHI-Überlebens in den Geweben über die Zeit hinweg anhand von Keimzahlen bewertet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in langanhaltende Infektionen mit nontypisierbarem Haemophilus influenzae ermöglichen kann.Es kann auch bei der Untersuchung anderer menschlicher Krankheitserreger wie Moraxella Alis verwendet werden. Diese Prozedur wird von Dr. Doin ran, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Entfernen Sie die Transportplatte aus der Verpackung und bereiten Sie sich auf den Beginn des Experiments vor. Besprühen Sie die Transportplatte mit 70 % Ethanol und stellen Sie die Platte in den Sicherheitswerkbank.Geben Sie je ein Milliliter Vier-Grad-Celsius-Epi-Atemwegs-Wartungsmedium in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte. Entfernen Sie danach das Klebeband, öffnen Sie die Platte und nehmen Sie den Gazeüberzug von den Epi-Atemwegs-Inserts ab. Benutzen Sie mit einer Drehbewegung eine Pinzette, um ein Insert aus den Aros zu lösen.Platzieren Sie den Insert in eine der Vertiefungen der 6-Loch-Platte, falls erforderlich. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um vorsichtig die Aros vom Insert zu entfernen, wobei Sie die Membran nicht berühren sollten. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter den Inserts befinden.Und dann die sechswellige Platte in einen Inkubator stellen. Die Inserts täglich wie folgt waschen: DPBS mit Calcium und Magnesium vorwärmen und eine Pipettenspitze mit dem DPBS füllen. Anschließend mit sterilen Pinzetten vorsichtig ein Insert anheben und 200 Mikroliter des vorgewärmten DPBS auf das Gewebe pipettieren.Danach den Einsatz vorsichtig schwenken, um das DPBS gleichmäßig zu verteilen, ohne das Gewebe zu berühren. Anschließend den Einsatz schräg halten und die Spitze einer P-1000-Pipette an den Kunststoffring anlegen, der die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Dann die Pufferlösung vorsichtig abpipettieren und in ein Kryoröhrchen für spätere Untersuchungen geben.Entfernen Sie abschließend das basale Erhaltungsmedium durch Aspiration und ersetzen Sie es durch ein Milliliter frisches Medium. Erwärmen Sie zusätzliches DPBS mit Calcium und Magnesium vor. Geben Sie drei Milliliter des vorgewärmten DPBS in ein 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie anschließend einzelne Kolonien von nicht typisierbarem Influenza-Virus oder NTHI, die über Nacht auf Schokoladenagar gezüchtet wurden, in dem Röhrchen.Versetzen Sie das Röhrchen nun mindestens 10 Sekunden lang kräftig im Vortex, und messen Sie anschließend die optische Dichte. Fügen Sie weiterhin einzelne Kolonien des NTHI hinzu, bis die Bakterienkonzentration einen OD von etwa 0,7 bei 600 Nanometern erreicht. Waschen Sie danach jeden EPI-Atemwegsinsert erneut mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie anschließend 28 Mikroliter der bakteriellen Suspension auf die apikale Oberfläche jedes Inserts.Vermeiden Sie, das basale Pflegemedium zu beimpfen. Danach kehren Sie die Platte in den Inkubator zurück, um zunächst vorgewärmte und anschließend oberflächentrockene Schokoladen-Agar-Platten mit NTHI zu quantifizieren. Verdünnen Sie anschließend den NTHI-Inokulum seriell mithilfe von steriler PBS mit 0,1 % Gelatine oder PBSG. Geben Sie Aliquote von jeweils 10&nbsp;Mikroliter Inokulum auf die Platten und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37&nbsp;Grad Celsius in 5&nbsp;% Kohlendioxid. Am nächsten Tag ermitteln Sie die Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter, indem Sie die Verdünnung zählen, die 15 bis 30 deutliche Kolonien pro Tropfen aufweist, und rechnen anschließend zurück auf Ihr tatsächliches lebensfähiges Inokulum von NTHI, um die Gesamtzahl der zellgebundenen Bakterien zu ermitteln. Spülen Sie die apikale Oberfläche der Epi-Airways dreimal mit jeweils 200&nbsp;Mikroliter DPBS ohne Calcium oder Magnesium. Danach kippen Sie den Einsatz und spülen Sie das restliche Pflegemedium von der basalen Membran ab. Legen Sie den gewaschenen Einsatz in eine neue sechswellige Platte und geben Sie 250 Mikroliter sterile 1%-Saponin-Lösung auf die apikale Oberfläche jedes Gewebes. Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in den Inkubator, während die Platte inkubiert wird.Richten Sie Röhrchen für die serielle Verdünnung ein, indem Sie jedes Verdünnungsröhrchen mit 900 Mikrolitern PBSG füllen. Danach bürsten Sie das Gewebe mit einer P-1000-Pipettenspitze mithilfe einer vorwärts-rückwärts-Bewegung von der Membran ab, gefolgt von einer kreisförmigen Bewegung, um das Gewebe von den Rändern des Inserts zu lösen. Anschließend geben Sie mit einer sterilen, großgebohrigen P-1000-Pipettenspitze die Suspension in ein leeres 1,5-Milliliter-Einmalkunststoffröhrchen.Geben Sie nun 250 Mikroliter DPBS auf die apikale Oberfläche des Inserts und untersuchen Sie das Insert unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob noch Gewebe zur Gewinnung vorhanden ist. Fügen Sie die Suspension dem Einor-Röhrchen hinzu und überlagern Sie sie kräftig mit 500 Mikrolitern DPBS. Vortexen Sie die Zellsuspension eine Minute lang.Dann unter Verwendung einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel die Suspension durch die Nadel in die Spritze aufziehen. Die Suspension langsam dreimal durch die Nadel leiten, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen zu erzeugen.Anschließend die Suspension erneut kräftig eine Minute lang verwirbeln. Danach 100 Mikroliter der Suspension mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser in das erste Verdünnungsrohr überführen. Das Rohr fünf Sekunden lang kräftig verwirbeln und anschließend eine serielle Verdünnung im Verhältnis 1:10 herstellen, indem man Tropfen der Verdünnung auf Schokoladen-Agar-Platten aufträgt.Anschließend die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren, um lebensfähige Bakterienzahlen zur Gewinnung internalisierter Bakterien zu erhalten. Jeden Insert nur dreimal mit 200 Mikrolitern DPBS waschen. Das basale Erhaltungsmedium durch Medium ersetzen, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicinsulfat enthält, und dann 300 Mikroliter des Gentamicin-haltigen Erhaltungsmediums auf die apikale Oberfläche geben.Bringen Sie die Inserts für eine Stunde in den Inkubator zurück und erwärmen Sie währenddessen etwas DPBS vor. Entfernen Sie anschließend das auf der apikalen Oberfläche enthaltene Erhaltungsmedium mit Gentamycin. Waschen Sie danach die apikale Oberfläche und die basale Membran der Inserts umfassend mit dem vorgewärmten DPBS.Abschließend wiederholen Sie den zuvor gezeigten Vorgang zum Abschrubben und Sammeln, bevor serielle Verdünnungen durchgeführt und die internalisierten Bakterien in dieser Abbildung ausplattiert werden. Ein Vergleich von Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen uninfizierter Epi-Atemwegsgewebe auf der linken Seite mit fünf Tage lang mit NTHI infizierten Epi-Atemwegsgeweben auf der rechten Seite zeigt, dass eine Langzeit-Kokultur mit NTHI keine signifikanten Schäden an den apikalen Geweben verursacht und unterstreicht damit die Nützlichkeit des Epi-Atemwegsmodells.Hier ist ein Diagramm dargestellt, das die Anzahl der über die Zeit internalisierten NTHI-Bakterien während einer epi- Atemwegs-Kokultur zeigt. Der Stamm R 2 8 6 6 wurde mit etwa einem Mal 10 hoch 7 CFU pro Insert inoculiert. Anschließend wurden die internalisierten Bakterien zu den jeweils angegebenen Zeitpunkten gewonnen und gezählt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Langzeit-Kokultur von NTHI mit primären, hormonbehandelten Atemwegsgeweben unter Verwendung eines PRE-Modells durchführt.

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

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