Basophilenaktivierungstest für die Untersuchung von IgE-vermittelten Mechanismen in Drug Überempfindlichkeit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, IgE-vermittelte Arzneimittelüberempfindlichkeit mittels des Basophilaktivierungstests unter Verwendung gut charakterisierter HAP-konjugierter Arzneimittel-Trägerproteine nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Arzneimittel über eine intrinsische oder organisch-chemisch eingeführte Carboxygruppe an Lysinreste des menschlichen Serumalbumins gekoppelt wird. Zweitens werden die Konjugate physikalisch-chemisch charakterisiert, um den genauen Kupplungsgrad durch Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie oder H-P-S-E-C in Kombination mit sequentieller Brechungsindex- und Ultraviolett-Detektion zu bestimmen.

Anschließend werden die gut charakterisierten Arzneimittel-Konjugate verwendet, um Basophile von spendenden Personen mit Arzneimittelüberempfindlichkeit zu stimulieren. Letztendlich kann der Basophil-Aktivierungstest oder BAT eingesetzt werden, um IgE-vermittelte Mechanismen bei Arzneimittelüberempfindlichkeit zu bewerten. Mein Name ist Michael Steiner von der Allergieforschungsgruppe an der Universität Salzburg in Österreich.

Heute möchten wir Ihnen eine Methode vorstellen, mit der die Beteiligung drugspezifischer IgE-Antikörper an Arzneimittelüberempfindlichkeitsreaktionen gemessen werden kann. Hier zeigen wir das Verfahren anhand von zwei weit verbreiteten Vertretern nichtsteroidaler Antirheumatika, nämlich Propone und Diclofenac. Die Methode bietet jedoch das Potenzial, für die Routine-Diagnose von sofort auftretenden Arzneimittelallergien eingesetzt zu werden.

Im Allgemeinen 10 Mikroliter einer frisch zubereiteten Stammlösung von N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) zur Propafenon- oder PP-Probe hinzufügen. Die Probe eine Minute lang verwirbeln. Anschließend 16,9 Mikroliter einer Lösung von menschlichem Serumalbumin (HSA) mit einer Konzentration von 118 Milligramm pro Milliliter zur Probe geben und die Probe dann zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 300 Umdrehungen pro Minute inkubieren.

Nach Beendigung des Schüttelns dialysieren Sie die Proben dreimal gegen je zwei Liter PBS über mehrere Stunden bei vier Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 14.000 × g und sammeln das S-Supernatant, das die an HSA konjugierten NSAIDs enthält. Überprüfen Sie das Supernatant auf Proteine, indem Sie eine SDS-Gelelektrophorese mit 12 %igen Gelen durchführen.

Laden Sie etwa 12 Mikrogramm HSA-Konjugat in eine Gelelektrophorese-Kammer zur Analyse der Kopplungsrate der NSAID-Konjugate mittels Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie oder H-P-S-E-C auf. Verdünnen Sie zunächst die HSA-Standardprobe auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in demineralisiertem Wasser. Zur Detektor-Kalibrierung injizieren Sie 50 Mikroliter der HSA-Standardlösung.

Anschließend unter Verwendung einer 7,8 × 300 mm TSK-Gel-G2000-SSW-XL-Säule und eines online gekoppelten Refraktionsindex- oder RI- und UV-Detektorsystems. Berechnen Sie die RI-Konstante k_ri und die UV-Konstante k_uv für den Detektor. Unter Verwendung dieser beiden Formeln werden verdünnte PP-Derivat-Standards für die H-P-S-E-C in entionisiertem Wasser in Mengen von 5, 10 und 30 mg hergestellt, um die Injektion zu erleichtern, und anschließend die Mittelwerte für dN/dC des Wirkstoffs und dA/dC des Wirkstoffs für beide Standarde bestimmt.

Unter Verwendung dieser beiden Formeln werden nun die Wirkstoffkonjugate auf die H-P-S-E-C injiziert und die RI- sowie UV-Signalflächen ermittelt. Anschließend unter Verwendung derselben beiden Gleichungen die Konzentration der PP-Derivate und des HSA für die unbekannten Proben berechnen. Beschriften Sie zunächst sieben Durchflusszytometriegefäße entsprechend ihrem Inhalt: unbehandelte Kontrolle, negative Kontrolle, positive Kontrolle und Wirkstoffkonjugate.

Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter Basophil-Aktivierungs-Puffer in die für die unbehandelte Probe und die negative Kontrolle vorgesehenen Vials. Geben Sie 50 Mikroliter der Anti-FC-Epsilon-R-eins-Lösung aus dem Flow-zwei-Cast-Kit in das Vial der positiven Kontrolle. Fügen Sie nun dem Arzneimittel-Konjugat-Vial eine Verdünnungsreihe im Verhältnis 1:10 von 0,02 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter des PP-Konjugats hinzu und geben Sie danach je 100 Mikroliter Stimulationspuffer sowie 50 Mikroliter EDTA-Ganblut des Patienten in jedes Röhrchen.

Mischen Sie die Proben vorsichtig. Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter der Suspension. Geben Sie je 20 µL des Färbereagenzgemisches, das mit PE markierte Anti-CCR3-Antikörper und mit ZI markierte Anti-CD63-Antikörper enthält, in jedes der Röhrchen mit Wirkstoffkonjugat sowie in die positiven und negativen Kontrollen und mischen Sie gut.

Erneut die Proben 45 Minuten lang in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Reaktion stoppen, indem die Proben fünf Minuten lang auf Eis gestellt werden. Danach die Erythrozyten lysieren, indem zwei Milliliter Fluss-2-Cast-Lysereagenz zu jedem Vial hinzugefügt werden.

Die Proben 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 500 ×g bei Raumtemperatur pelletieren. Vorsichtig den Überstand abgießen, die Zellen in 500 µL Durchflusszytometrie-Waschpuffer resuspendieren und die Proben bis zur Durchflusszytometrie auf Eis lagern.

Verwenden Sie die ungefärbte Probe, um die Spannungseinstellungen des Durchflusszytometers anzupassen. Danach werden die als Lymphozyten vorhergesagten Zellen im Seitenstreulicht-Streulicht-Vorwärtsdiagramm gezielt ausgewählt. Wie in dieser Beispielabbildung gezeigt, werden Basophile zunächst als CCR drei hoch Seitenstreuung niedrig identifiziert.

Ähnlich wie in diesem Streudiagramm. Nach der Gating der Zellen in das passende EPE-Diagramm können aktivierte Basophile weiterhin durch ihre Expression von FITC-markiertem CD63-positiv identifiziert werden. Nachdem die Schwelle so festgelegt wurde, dass maximal 2,5 % der Basophilen im Negativkontrollansatz als CD63-hoch gelten, kann eine Probe als positiv für die Basophilenaktivierung betrachtet werden, wenn mehr als 5 % der Basophilen CD63-hoch sind und der MFI der Probe dividiert durch den MFI der Negativkontrolle zwei überschreitet.

Diese Methode bewertet die Fledermaus als nützliches Werkzeug zum Nachweis von IgE-abhängiger Arzneimittel-Überempfindlichkeitsprotein. Konjugate von NSAIDs werden zur Aktivierung von Basophilen mittels H-P-S-E-C mit RI- und UV-Detektion der Aggregation verwendet. Der Kopplungsgrad und die effektive Ausbeute der Konjugate werden wie in dieser Abbildung dargestellt bestimmt.

43,5 % der DF-Konjugate blieben monomer mit einem Kopplungsgrad von 5,0 DF pro HSA für die Aggregate. Ein Kopplungsgrad von 9,5 wurde wie hier dargestellt bestimmt. Das PPP-Konjugat zeigte sich als aus 68,5 % Monomeren bestehend mit einem Kopplungsgrad von 21,2.

Der Kopplungsgrad der Aggregate betrug 27,9. Insgesamt lag der bestimmte Kopplungsgrad der DF-Konjugate bei 7,6 df und der der PPP-Konjugate bei 23,2. Die BAT, die unter optimierten Bedingungen mit Konjugaten durchgeführt wurde, ermöglicht Untersuchungen IgE-abhängiger Reaktionen bei NSAID-Überempfindlichkeit.

Wie hier gezeigt, war nur das PP-Konjugat in der Lage, die Basophilenaktivierung auszulösen, die durch eine Hochregulation sichtbar wurde. Bei der CD63-Oberflächenexpression wurden 20,6 % der Basophilen aktiviert, was durch einen Logarithmus der Fluoreszenzintensität charakterisiert ist, und die MFI stieg um den Faktor 4,9 von 386 für die negative Kontrolle auf 1893 an.

Im Gegensatz dazu wurden mit dem DF-Konjugat nur 3,1 % der Basophilen aktiviert, was unterhalb der 5 %-Grenze lag. Außerdem stieg der MFI nur um den Faktor 1,1 von 197 im negativen Kontrollansatz auf 210. Die Gültigkeit des Assays zeigt sich in einer Aktivierung von weniger als 5 % der Basophilen in der negativen Kontrolle.

Zwei, eine log-Stufen-Verschiebung der Fluoreszenzintensität einer Basophilen-Teilpopulation und drei, mehr als 50 % aktivierte Basophile für die positive Kontrolle. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aktivitätstests an Basophilen durchführt, und vor allem, wie man IgE-vermittelte von nicht IgE-vermittelten Arzneimittelüberempfindlichkeitsreaktionen unterscheidet. Darüber hinaus sollten Sie verstehen, wie die Anwendbarkeit des Basophil-Aktivierungstests bei Arzneimittelallergien über die bereits etablierte Nutzung bei Pollen-, Lebensmittel- und Insektenstich-Allergien hinaus erweitert werden kann.