Name: Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Markierung embryonaler Blutgefäße in Mäusen durch Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in die Gesichtsvene. Diese Technik ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung der Gefäßstrukturen für Studien zur Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde von den Zuwendungs-Zahlen R01AI055001 und R01AI082127 von NIAID zur NRM und SREB Dissertation Fellowship Award JLB unterstützt.

1. Fluorescein markiertem Dextran und GSL I-isolectin B 4 V. facialis Injektionen zu embryonalen Blutgefäßen Label <ol><li> Bereiten FITC-Dextran (50ug/mL) in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) oder GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und warm bis 37 ° C. Add 100 ul auf Lager 1,25 Fast Green / PBS, die FITC-Dextran-Lösung (Gesamtvolumen 1 ml) und 180uL of stock 1,25 Fast Green / PBS auf die GSL 1 - isolectin B 4 (Gesamtvolumen 200 &amp;mgr; l), so dass die Lösung sichtlich blau. </li><li> Dissect E14.5-E18.5 Embryonen und Dottersack zusammen, so dass die Allantois Stiel (Nabel-Arterie und Vene) intakt. </li><li> -Embryonen eine neue Petrie Schüssel (60 X 15 mm) und tauche sie in PBS bei Raumtemperatur. </li><li> Position des Embryos zu einer sagittalen Ansicht des Kopf / Gesicht geben. Verwenden Sie Micro-Pinzette vorsichtig fassen den Embryo an der Spitze. </li><li> Mit einer 30G Nadel injiziert 50ul FITC-Dextran (50ug/mL) oder GSL 1 - isolectin B 4 (20ug in 200 &amp;mgr; l PBS) in die V. facialis und dabei die Nadel in Richtung der Rückseite des Kopfes. </li><li> Wenn der Farbstoff sichtbar in die Nabelvene ist, entfernen Sie die Nadel und trennen Sie die Embryos aus der Allantois-Stiel (Nabel-Arterie und Vene). </li><li> Nach Injektionen, erlauben Embryo in PBS bei Raumtemperatur bleibt für 2-3 Minuten, so dass der Farbstoff zirkuliert im gesamten Embryo. </li></ol> 2. Whole-mount Analyse der Haut Gefäßsystem <ol><li> Nach Abzug der Farbstoff im gesamten Embryo zirkulieren, zu entfernen Hautproben aus Regionen der Extremitäten, Rücken und Bauch, etc. 8,9. </li><li> Waschen Sie die Haut Probe in kaltem PBS, und fixieren in 4% PFA / PBS für 2 Stunden 8,9. 3 x waschen für jeweils 10 Minuten in 4 ml klare Flasche mit 2 ml kaltem PBS. </li><li> Legen Sie Hautprobe auf einen Objektträger und 100 ul der Montage Medien zu jeder Folie und einem Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Objektträger in einem dunklen Lagerraum trocken. </li><li> Fahren Sie mit 2 'Image Acquisition "Abschnitt Schritt. </li></ol> 3. Multi-Farb-Kennzeichnung von Thymus und Herz Gefäßsystem und perivaskulären Zellen für Gefrierschnitte (aus Abschnitt 1, Schritt 7 weiter) <ol><li> 'Flash freeze' ganze Embryo in flüssigem Stickstoff. Embryonen werden können und bei -80 ° C bis zur Analyse. </li><li> Alternativ herauspräparieren Thymus, spülen in 4 ° C PBS, und fix in 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) / PBS für 2 Stunden. 3 x je 10 Minuten in kaltem PBS, Ort Thymi in OCT und einfrieren und lagern bis zur Verwendung bei -80 ° C. </li><li> Für Kryoschneiden verbreitete ÜLG auf einen Abschnitt 'block' und montieren Sie den Embryo oder seziert Organe / Gewebe zum Schneiden. </li><li> Cut gefrorenen Gewebe in 10 pm dicke Schnitte und sammeln auf Folien. </li><li> Fix Abschnitte in Aceton für 5-10 Minuten. 3 x waschen mit kaltem TBS. </li><li> Block in 10% Esel Serum / TBS in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Abschnitte 1 Stunde Übernachtung mit 100 ul Primärantikörper in einer feuchten Kammer bei 4 ° C: in diesem Beispiel verwenden wir Ratte anti-Maus-CD31 (1:100) zu kennzeichnen Endothel und Ziege anti-Maus PDGFR-β (1:100) zu kennzeichnen perivaskulären Zellen. Es ist sinnvoll, Folien mit individuell zugeschnittenen Streifen Parafilm abdecken, um sicherzustellen, dass der Antikörper gleichmäßig über den Querschnitt verteilt. </li><li> Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper, waschen Abschnitte 3 mal in kaltem TBS. Inkubieren mit 100 ul entsprechenden Sekundärantikörper für mindestens 30 Minuten. </li><li> 3 x waschen mit kaltem TBS. 100 l der Montage Medien zu jeder Folie und einem Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Objektträger in einem dunklen Lagerraum trocken. </li><li> Proceed to 'Image Acquisition "Abschnitt. </li></ol> 4. Multi-Farb-Kennzeichnung von Thymus Gefäßsystem und perivaskulären Zellen für Vibratom Abschnitte (aus Abschnitt 1, Schritt 7 weiter) <ol><li> Dissect aus Thymus Lappen vom Embryo und spülen Sie mit kaltem PBS. </li><li> Fix Thymus in 4% PFA / PBS bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Wash in PBS-Triton X (0,15%) 3-mal, 10 Minuten und Platz Thymi in einer kleinen Kunststoff-Kartusche und tauchen in 4% niedrig schmelzende Agarose / PBS (~ 4 ° C). Der Thymus ist in Kontakt mit der Unterseite der Patrone sein. </li><li> Lassen Agarose auf Eis (3-5 Minuten) zu festigen. Verwenden einer Rasierklinge abgeschnitten überschüssige Agarose. Fügen Sie Leim auf die Vibratom Block und halten Probe, um den Block. </li><li> Add kaltem PBS zu Vibratom Wasserbad, bis die Probe und Klinge eingetaucht sind. </li><li> Set Geschwindigkeit und Amplitude (hoher Amplitude und niedriger mittlerer Geschwindigkeit ist ideal für weiche Thymus Abschnitte). Die Amplitude reduziert werden, wenn Teile zerbrechen aufgrund von zu viel Aufregung sein. </li><li> Cut 50 um Abschnitte. </li><li> Mit einem Pinsel, sammeln Abschnitte in einem 24-well Mikroplatten in kaltem PBS. </li><li> Block Abschnitte in 500 ul 10% Esel-Serum in PBS-Triton X (0,15%) für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Abschnitte für 8 Stunden bis über Nacht mit dem primären Antikörper, wie anti-CD31-und Anti-PDGFR-β, In einer überdachten 24-Well-Mikroplatten. </li><li> 3 x waschen mit PBS-Triton X (0,15%) auf insgesamt 8 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Block Abschnitte in 10% Esel-Serum in PBS-Triton X (0,15%) für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Abschnitte für 8 Stunden bis über Nacht bei 4 ° C mit entsprechenden Sekundärantikörper. </li><li> 3 x waschen mit PBS-Triton X (0,15%) auf insgesamt 8 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Re-fix Proben in 4% PFA / PBS für 30 Minuten auf Eis. </li><li> 3 x waschen mit PBS-Triton X (0,15%) über 30 Minuten auf Eis. </li><li> Entwässern Proben durch ein abgestuftes MeOH / PBS-Triton X-Serie: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH und 100% MeOH in 10 Minuten für jeden Schritt. Ersetzen Sie 100% MeOH mit frischem MeOH nach 10 Minuten und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> In einem Glasbehälter, mischen BABB (Benzylalkohol: Benzylbenzoat) im Verhältnis 1:2. Kombinieren Sie BABB mit MeOH für eine Endkonzentration von 50% BABB und 50% MeOH. Inkubieren Sie die Probe in BABB: MeOH für 10-15 Minuten. </li><li> Transfer-Probe auf einem Glasbehälter mit 100% BABB und Inkubation für 10-15 Minuten oder bis gelöscht, bei Raumtemperatur. </li><li> Füllen Depression slide (0.7mm Tiefe) mit frischem 100% BABB und Transfer Probe auf die Seite. Add Deckglas (Nr. 1,5) und Dichtung mit 2-3 Schichten von Nagellack. Lassen Sie Nagellack zu härten im Dunkeln bei Raumtemperatur, dann speichern Probe bei 4 ° C. Hinweis: Folien müssen absolut dicht vor dem konfokalen Bildaufnahme werden. Die Bilder sollten innerhalb von 12-24 Stunden erworben werden, als Fluoreszenzfarbstoffe in BABB verblassen kann. </li><li> Proceed to 'Image Acquisition "Abschnitt. </li></ol> 5. Bildaufnahme <ol><li> Bild 10 um Gefrierschnitten mit einem konfokalen Mikroskop mit dem Plan-Apochromat 20X/0.8 Ziel (512 x 512 Pixel) mit 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - und 633-nm-Laser-Linien. </li><li> Erwerben Sie konfokalen z-Abschnitte whole mount Haut und 50 um Agarose eingebetteten Schnitten mit der Plan-Apochromat 10X/0.4 Ziel (512 x 512 Pixel) mit 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, und 633-nm-Laser-Linien. Serielle Z-Abschnitte sollten nacheinander auf 1-Mikron gesammelt werden für den jeweiligen Kanal. </li><li> Rekonstruieren seriellen Z-Sektionen mit Zeiss AxioVision 4.6 oder andere Bild-Analyse-Software. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Effiziente Kennzeichnung des embryonalen Gefäßsystems ist entscheidend für die Beurteilung von Defekten an Blutgefässen in embryonalen Mäuse. Abbildung 1 zeigt spezifische Kennzeichnung von E16.5 Thymus Blutgefäße (1A-B) und Co-Markierung mit CD31 (1B), zusätzlich zu Verfärbung der rechten und linken Ventrikel (1E-F), bzw.. Die GSL I-isolectin B-4-Protokoll für Gefrierschnitte wie in den Abschnitten 1, 3 und 5 beschrieben wurde in diesen Experimenten verwendet. Whole-mount Kennzeichnung der Haut Blutgefäß-Netz auf E16.5 Mäusen, mit Hilfe der Protokolle in den Abschnitten 1, 2 beschrieben, und 5 ist in Abbildung 1C-D gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> Abbildung 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 V. facialis Injektionen in E16.5 Maus-Embryonen. a. Gefrier der embryonalen Thymus nach der Injektion. b. Merge von CD31 co-Kennzeichnung mit isolectin B 4. c. und d. Whole-mount der embryonalen Haut Gefäße nach der Injektion. e. und f. Gefrier von embryonalen Herzen e. (rechts Ventrikel) f. (linker Ventrikel) nach der Injektion.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Whole-mount und PECAM-1 (CD31) Flecken auf Abschnitte sind den herkömmlichen Verfahren zur Kennzeichnung der Gefäße in der embryonalen Mäuse. Diese Methoden erfordern den Einsatz von direkten und / oder indirekte Immunfluoreszenz und Reinigungsmittel zur Mäusegewebe permeabilisieren. Dies erweist sich als recht zeitnah zu verarbeiten. Hier haben wir eingesetzten FITC-Dextran oder isolectin B 4 V. facialis Injektionen direkt beschriften Sie die embryonale Gefäßsystem, wodurch die Voraussetzung für Antikörperma...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> FITC-Dextran </td><td> Sigma </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> Fluorescein GSL 1 - isolectin B 4 </td><td> Vector Laboratories </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Optimal Cutting Temperature Compound (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> JT Baker </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Jackson </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> Ratte anti-Maus-CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus PDGFR-β </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> Esel-anti-Ratte CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> Esel anti-Ziege Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> Triton X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> Low Melt Agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> Benzylalkohol </td><td> Acros Scientific </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> Benzyl Benzoate </td><td> Acros Scientific </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> Depression rutscht </td><td> Fisher Scientific </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> Deckglas (22x22) -1,5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Micro Pinzette </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm Nr. OM992 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 und 24 Well-Mikroplatten </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / Plus Mikropräparate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL klaren Fläschchen </td><td> National Scientific </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

ein verfahren zur markierung gefäßsystem in embryonalen mäuse

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Die Einrichtung eines funktionalen Blutgefäß-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil der Organogenese und ist für eine optimale Organfunktion erforderlich. Zum Beispiel in der Thymusdrüse richtigen Gefäße Bildung und Strukturierung ist wesentlich für Thymozyten Einstieg in die Orgel und reifen T-Zellen-Ausgang an die Peripherie. Die räumliche Anordnung der Blutgefäße in der Thymusdrüse ist abhängig von Signalen aus dem lokalen Mikroumgebung, nämlich Thymus Epithelzellen (TEC). Mehrere neuere Berichte deuten darauf hin, dass eine Störung dieser Signale führt in Thymus Blutgefäß Defekte 1,2. Frühere Studien haben Techniken verwendet, um die Neugeborenen und adulten Thymus Gefäßsystem 1,2 label beschrieben. Wir zeigen hier eine Technik zur Kennzeichnung Blutgefäße in der embryonalen Thymus. Diese Methode kombiniert die Verwendung von FITC-Dextran oder Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lektin I (GSL 1 - isolectin B 4) V. facialis Injektionen und CD31 Antikörper-Färbung zu Thymus vaskulären Strukturen und PDGFR-β zu Thymus perivaskulären Mesenchym 3-5 Etikett zu kennzeichnen. Die Möglichkeit der Verwendung Kryoschnitten oder Vibratom Abschnitte ist ebenfalls vorhanden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Thymus vaskulären Mängel, die entscheidend für die Festlegung der Rolle der TEC-basierten Molekülen in Thymus die Bildung von Blutgefäßen zu identifizieren. Da die Methode kennzeichnet die gesamte Gefäßsystem, kann es auch verwendet, um den vaskulären Netze in mehreren Organen und Geweben während der Embryo einschließlich Haut-und Herz 6-10 analysieren.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kennzeichnung embryonalen Haut und Thymus Blutgefäße.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

Die Etablierung eines funktionellen Blutgefäßnetzwerks ist ein wesentlicher Bestandteil der Organogenese und für eine optimale Organfunktion erforderlich. Beispielsweise in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen spezifischer genetischer Mutationen auf die Entwicklung und Struktur des Gefäßsystems zu bestimmen. Dazu werden das Embryo und die extraembryonalen Gewebe gemeinsam präpariert, um eine geeignete Probe für die Injektion zu erhalten. Anschließend wird die vordere Gesichtsvene mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert, um die intakte Gefäßstruktur zu markieren.Dann wird das Embryo zur Analyse vorbereitet. Schließlich werden Präparate mit gelabeltem Gefäßsystem oder Schnitte angefertigt und abgebildet, um anhand der Immunfluoreszenzmikroskopie die dreidimensionale Struktur des normalen Gefäßsystems darzustellen, basierend auf Ganzpräparaten oder Gewebeschnitten. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als ich daran interessiert war, den zeitlichen Entwicklungsabschnitt zu bestimmen, zu dem die periphere Gefäßversorgung über Angiogenese mit dem Thymus verbunden wird.Zunächst FXI-Dextran oder GS-L1-Selektin B4 in PBS in einem 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen vorbereiten, 100 Mikroliter der Stammlösung (1,25 Millimolar Fast Green in PBS) zum FTSE-Dextran oder 180 Mikroliter zum GS-L1-Selektin B4 hinzufügen, sodass die Lösungen sichtbar blau gefärbt sind. Anschließend das Röhrchen auf 37 Grad Celsius erwärmen.Präparieren Sie Embryonen vom Zeitpunkt E 14,5 bis E 18,5 zusammen mit den Dottersäcken, wobei der Allantoisstiel intakt bleibt. Überführen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie bei Raumtemperatur in PBS ein. Positionieren Sie anschließend einen Embryo so, dass eine sagittale Ansicht des Gesichts erhalten wird.Danach das Embryo vorsichtig mit mikrochirurgischer Pinzette am Kopf fassen. Mit einer 30-Gauge-Nadel 50 Mikroliter FXI-Dextran oder GS L ein I-Selektin B vier in die Gesichtsvene injizieren, wobei die Nadel in Richtung Hinterkopf gerichtet ist. Wenn die Farbe in der Nabelvene sichtbar ist, die Nadel entfernen und das Embryo vom Ei trennen.Toic stor. Lassen Sie das Embryo zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS, damit sich der Farbstoff im gesamten Embryo verteilen kann. Nachdem der Farbstoff sich im gesamten Embryo verteilt hat, entnehmen Sie Hautproben aus Bereichen der Gliedmaßen, des Rückens und des Bauchs.Spülen Sie die Hautproben in kaltem PBS und fixieren Sie sie zwei Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd-PBS. Anschließend waschen Sie sie dreimal je zehn Minuten in vier Milliliter fassenden klaren Gefäßen mit jeweils zwei Milliliter kaltem PBS. Legen Sie die Hautproben auf Objektträger und geben Sie je 100 Mikroliter Einbettmedium sowie einen Deckgläser auf jeden Objektträger.Lassen Sie die Objektträger vor der Bildgebung im Dunkeln trocknen, bevor die Klärung in BABB und anschließende konfokale Bildgebung durchgeführt wird, um hochauflösende Aufnahmen der Hautgefäße zu erhalten. Zum Vorbereiten der Gewebe für die Kryoschnitte, gefrieren Sie ganze Embryonen zur Kryoschnittherstellung rasch in flüssigem Stickstoff ein. Tragen Sie OCT auf einen Schnittblock auf und montieren Sie den Embryo darauf.Gefrorenes Gewebe in 10 Mikrometer dicke Schnitte schneiden und auf Objektträgern auffangen. Die Schnitte fünf bis zehn Minuten in Aceton fixieren, anschließend dreimal in kaltem TBS-Puffer mit 10 % Eselserum in TBS in einer Feuchtkammer waschen. Bei Raumtemperatur je 100 Mikroliter Primärantikörper zu jedem Schnitt geben.In diesem Beispiel verwenden wir eine Ratte-anti-US-CD31-Antikörper zur Markierung des Endothels und eine Ziege-anti-US-P-D-G-F-R-beta-Antikörper zur Markierung perivaskulärer Zellen, um sicherzustellen, dass der Antikörper gleichmäßig über den Schnitt verteilt ist. Bedecken Sie die Objektträger mit individuell zugeschnittenen Parafilmstreifen. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde bis über Nacht in einer Feuchtkammer bei vier Grad Celsius.Als Nächstes die Schnitte dreimal mit kaltem TBS waschen, dann mit 100 Mikroliter der entsprechenden sekundären Antikörper für mindestens 30 Minuten inkubieren. Schließlich dreimal mit kaltem TBS waschen, jedem Objektträger 100 Mikroliter Eindeckmedium und ein Deckglas hinzufügen.Lassen Sie die Objektträger im Dunkeln trocknen. Für die Vibram-Schnitttechnik dissezieren Sie die Thymuslappen aus Embryonen aus und spülen Sie sie mit kaltem PBS ab. Fixieren Sie das Gewebe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd in PBS.Nach dem Waschen der Proben in PBS Triton X füllen Sie eine kleine Kunststoffkassette mit 4 % Low-Melt-Agarose. Tauchen Sie die Proben in die Agarose-PBS-Lösung ein und stellen Sie sicher, dass das Gewebe den Boden der Kassette berührt. Lassen Sie die Agarose auf Eis erstarren.Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das überschüssige Agarose abzuschneiden. Tragen Sie Klebstoff auf den VIBRAM-Block auf und befestigen Sie die Probe am Block. Gießen Sie kalte PBS in das Vibram-Wasserbad, bis die Probe und die Klinge eingetaucht sind. Stellen Sie die Geschwindigkeit und Amplitude ein. Die Amplitude sollte verringert werden. Wenn die Schnitte aufgrund übermäßiger Agitation zerfallen, schneiden Sie 50 Gewebeschnitte.Dann mit einer Pinzette die Schnitte in kalte PBS-Lösung in einer 24-Well-Mikroplatte überführen. Die Schnitte in 500 Mikrolitern 10 % Essserum in PBS mit Triton X für 30 Minuten blockieren. Nach Zugabe von Primärantikörpern wie anti-CD31 und anti-P-D-G-F-R-beta für acht Stunden bis über Nacht in einer abgedeckten Mikroplatte bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend dreimal in PBS mit Triton X über insgesamt acht Stunden bei vier Grad Celsius waschen.Nachdem die Schnitte erneut blockiert und mit Sekundärantikörpern inkubiert wurden, waschen Sie die Proben dreimal in PBS Triton X über insgesamt acht Stunden bei vier Grad Celsius. Danach fixieren Sie die Proben erneut 30 Minuten lang auf Eis in 4 % Parafomaldehyd-PBS und waschen sie anschließend dreimal weitere Male in PBS Triton X jeweils 30 Minuten lang auf Eis. Dehydratisieren Sie die Proben durch eine abgestufte Methanol-PBS-Triton-X-Serie, jeweils 10 Minuten pro Schritt.Danach das 100 % Methanol durch frisches Methanol ersetzen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Probe in eine Glas-Vertiefungsobjektträger geben und mit einer 1:1-Lösung aus BABB und Methanol bedecken. Die Proben 10 bis 15 Minuten inkubieren.Als Nächstes ersetzen Sie die Lösung durch 100 % BABB und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten oder bis zur Klärung. Geben Sie ein Deckglas auf und versiegeln Sie es mit zwei bis drei Schichten Nagellack. Lassen Sie den Nagellack im Dunkeln bei Raumtemperatur aushärten.Die Probe kann bei vier Grad Celsius gelagert werden, die Aufnahmen sollten jedoch innerhalb von 12 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Bilden Sie 10-Mikrometer-gefrorene Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung des Plan-Apochromat-20×-0,8-Objektivs mit 633-, 488- und 543-Nanometer-Laserlinien ab. Erfassen Sie einkronige konfokale Z-Schnitte von 50-Mikrometer-Aros-eingebetteten Schnitten unter Verwendung des Plan-Apochromat-10×-0,4-Objektivs mit 488-, 543- und 633-Nanometer-Laserlinien. Rekonstruieren Sie serielle Z-Schnitte mithilfe der Zeiss-AIA-Vision-4.6- oder einer entsprechenden Bildanalyse-Software. Eine effiziente Markierung der embryonalen Gefäße ist entscheidend, um Defekte der Blutgefäße bei embryonalen Mäusen zu beurteilen. Diese Abbildungen zeigen eine spezifische Markierung der Blutgefäße im Thymus von E16,5-Embryonen sowie eine Doppelmarkierung von GSL-I und Selektin.B vier injizierte Embryonen mit CD31 sowie Färbung der rechten und linken Herzkammern. Das GSL1-I-Selectin-B-vier-Protokoll für Kryoschnitte wurde in diesen Experimenten verwendet. Die Hohlmontage-Färbung des Hautblutgefäßnetzwerks an E16,5-Mäusen ist hier dargestellt, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.Andere Methoden wie die gleichzeitige Markierung der Stromazellen und Blutzellen zusammen mit dem Gefäßsystem können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie interagieren Blutzellen und Stromazellen unter normalen und pathologischen Bedingungen mit dem Gefäßsystem im Mausembryo?

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung von Veränderungen im mütterlichen Gefäßsystem während der Schwangerschaft bei Mäusen. Mit stereologischen Methoden wird der Umbau der dezidualen Spiralarterien quantitativ beurteilt und die Ergebnisse immunhistochemisch qualitativ bestätigt.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Echokardiographische Untersuchung wird häufig bei Mäusen verwendet. Teure hochauflösende Ultraschall-Geräte wurden für diesen Zweck entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt eine erschwingliche echokardiographische Verfahren kombiniert mit histologischen morphometrische Analysen kardiale Morphologie zu bestimmen.

Echokardiographische und histologische Untersuchung der kardiale Morphologie in der Maus

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll für die Beschriftung von Blutgefäßen in einem teleost Fisch durch Herzvermischung von DiI verdünnt in Fixierung, mit medaka(Oryziaslatipes) als Modell und die Konzentration auf Gehirn und Hypophyse Gewebe.

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Wir zeigen die chemische Induktion großer Blutgefäßerweiterungen bei Mäusen als Modell für die Untersuchung zerebrovaskulärer Dysfunktion, das für die Modellierung von vaskulärer Demenz und Alzheimer verwendet werden kann. Wir demonstrieren auch die Visualisierung des Gefäßsystems durch Injektion von Silikonkautschukmischung und eine klare visuelle Anleitung zur Messung von Veränderungen der Blutgefäßgröße.

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion

Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Erfahren Sie eine Methode zur Markierung embryonaler Blutgefäße in Mäusen durch Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in die Gesichtsvene. Diese Technik ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung der Gefäßstrukturen für Studien zur Entwicklungsbiologie.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

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