Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen spezifischer genetischer Mutationen auf die Entwicklung und Struktur des Gefäßsystems zu bestimmen. Dazu werden das Embryo und die extraembryonalen Gewebe gemeinsam präpariert, um eine geeignete Probe für die Injektion zu erhalten. Anschließend wird die vordere Gesichtsvene mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert, um die intakte Gefäßstruktur zu markieren.

Dann wird das Embryo zur Analyse vorbereitet. Schließlich werden Präparate mit gelabeltem Gefäßsystem oder Schnitte angefertigt und abgebildet, um anhand der Immunfluoreszenzmikroskopie die dreidimensionale Struktur des normalen Gefäßsystems darzustellen, basierend auf Ganzpräparaten oder Gewebeschnitten. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als ich daran interessiert war, den zeitlichen Entwicklungsabschnitt zu bestimmen, zu dem die periphere Gefäßversorgung über Angiogenese mit dem Thymus verbunden wird.

Zunächst FXI-Dextran oder GS-L1-Selektin B4 in PBS in einem 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen vorbereiten, 100 Mikroliter der Stammlösung (1,25 Millimolar Fast Green in PBS) zum FTSE-Dextran oder 180 Mikroliter zum GS-L1-Selektin B4 hinzufügen, sodass die Lösungen sichtbar blau gefärbt sind. Anschließend das Röhrchen auf 37 Grad Celsius erwärmen.

Präparieren Sie Embryonen vom Zeitpunkt E 14,5 bis E 18,5 zusammen mit den Dottersäcken, wobei der Allantoisstiel intakt bleibt. Überführen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie bei Raumtemperatur in PBS ein. Positionieren Sie anschließend einen Embryo so, dass eine sagittale Ansicht des Gesichts erhalten wird.

Danach das Embryo vorsichtig mit mikrochirurgischer Pinzette am Kopf fassen. Mit einer 30-Gauge-Nadel 50 Mikroliter FXI-Dextran oder GS L ein I-Selektin B vier in die Gesichtsvene injizieren, wobei die Nadel in Richtung Hinterkopf gerichtet ist. Wenn die Farbe in der Nabelvene sichtbar ist, die Nadel entfernen und das Embryo vom Ei trennen.

Toic stor. Lassen Sie das Embryo zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS, damit sich der Farbstoff im gesamten Embryo verteilen kann. Nachdem der Farbstoff sich im gesamten Embryo verteilt hat, entnehmen Sie Hautproben aus Bereichen der Gliedmaßen, des Rückens und des Bauchs.

Spülen Sie die Hautproben in kaltem PBS und fixieren Sie sie zwei Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd-PBS. Anschließend waschen Sie sie dreimal je zehn Minuten in vier Milliliter fassenden klaren Gefäßen mit jeweils zwei Milliliter kaltem PBS. Legen Sie die Hautproben auf Objektträger und geben Sie je 100 Mikroliter Einbettmedium sowie einen Deckgläser auf jeden Objektträger.

Lassen Sie die Objektträger vor der Bildgebung im Dunkeln trocknen, bevor die Klärung in BABB und anschließende konfokale Bildgebung durchgeführt wird, um hochauflösende Aufnahmen der Hautgefäße zu erhalten. Zum Vorbereiten der Gewebe für die Kryoschnitte, gefrieren Sie ganze Embryonen zur Kryoschnittherstellung rasch in flüssigem Stickstoff ein. Tragen Sie OCT auf einen Schnittblock auf und montieren Sie den Embryo darauf.

Gefrorenes Gewebe in 10 Mikrometer dicke Schnitte schneiden und auf Objektträgern auffangen. Die Schnitte fünf bis zehn Minuten in Aceton fixieren, anschließend dreimal in kaltem TBS-Puffer mit 10 % Eselserum in TBS in einer Feuchtkammer waschen. Bei Raumtemperatur je 100 Mikroliter Primärantikörper zu jedem Schnitt geben.

In diesem Beispiel verwenden wir eine Ratte-anti-US-CD31-Antikörper zur Markierung des Endothels und eine Ziege-anti-US-P-D-G-F-R-beta-Antikörper zur Markierung perivaskulärer Zellen, um sicherzustellen, dass der Antikörper gleichmäßig über den Schnitt verteilt ist. Bedecken Sie die Objektträger mit individuell zugeschnittenen Parafilmstreifen. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde bis über Nacht in einer Feuchtkammer bei vier Grad Celsius.

Als Nächstes die Schnitte dreimal mit kaltem TBS waschen, dann mit 100 Mikroliter der entsprechenden sekundären Antikörper für mindestens 30 Minuten inkubieren. Schließlich dreimal mit kaltem TBS waschen, jedem Objektträger 100 Mikroliter Eindeckmedium und ein Deckglas hinzufügen.

Lassen Sie die Objektträger im Dunkeln trocknen. Für die Vibram-Schnitttechnik dissezieren Sie die Thymuslappen aus Embryonen aus und spülen Sie sie mit kaltem PBS ab. Fixieren Sie das Gewebe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd in PBS.

Nach dem Waschen der Proben in PBS Triton X füllen Sie eine kleine Kunststoffkassette mit 4 % Low-Melt-Agarose. Tauchen Sie die Proben in die Agarose-PBS-Lösung ein und stellen Sie sicher, dass das Gewebe den Boden der Kassette berührt. Lassen Sie die Agarose auf Eis erstarren.

Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das überschüssige Agarose abzuschneiden. Tragen Sie Klebstoff auf den VIBRAM-Block auf und befestigen Sie die Probe am Block. Gießen Sie kalte PBS in das Vibram-Wasserbad, bis die Probe und die Klinge eingetaucht sind.

Stellen Sie die Geschwindigkeit und Amplitude ein. Die Amplitude sollte verringert werden. Wenn die Schnitte aufgrund übermäßiger Agitation zerfallen, schneiden Sie 50 Gewebeschnitte.

Dann mit einer Pinzette die Schnitte in kalte PBS-Lösung in einer 24-Well-Mikroplatte überführen. Die Schnitte in 500 Mikrolitern 10 % Essserum in PBS mit Triton X für 30 Minuten blockieren. Nach Zugabe von Primärantikörpern wie anti-CD31 und anti-P-D-G-F-R-beta für acht Stunden bis über Nacht in einer abgedeckten Mikroplatte bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend dreimal in PBS mit Triton X über insgesamt acht Stunden bei vier Grad Celsius waschen.

Nachdem die Schnitte erneut blockiert und mit Sekundärantikörpern inkubiert wurden, waschen Sie die Proben dreimal in PBS Triton X über insgesamt acht Stunden bei vier Grad Celsius. Danach fixieren Sie die Proben erneut 30 Minuten lang auf Eis in 4 % Parafomaldehyd-PBS und waschen sie anschließend dreimal weitere Male in PBS Triton X jeweils 30 Minuten lang auf Eis. Dehydratisieren Sie die Proben durch eine abgestufte Methanol-PBS-Triton-X-Serie, jeweils 10 Minuten pro Schritt.

Danach das 100 % Methanol durch frisches Methanol ersetzen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Probe in eine Glas-Vertiefungsobjektträger geben und mit einer 1:1-Lösung aus BABB und Methanol bedecken. Die Proben 10 bis 15 Minuten inkubieren.

Als Nächstes ersetzen Sie die Lösung durch 100 % BABB und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten oder bis zur Klärung. Geben Sie ein Deckglas auf und versiegeln Sie es mit zwei bis drei Schichten Nagellack. Lassen Sie den Nagellack im Dunkeln bei Raumtemperatur aushärten.

Die Probe kann bei vier Grad Celsius gelagert werden, die Aufnahmen sollten jedoch innerhalb von 12 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Bilden Sie 10-Mikrometer-gefrorene Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung des Plan-Apochromat-20×-0,8-Objektivs mit 633-, 488- und 543-Nanometer-Laserlinien ab. Erfassen Sie einkronige konfokale Z-Schnitte von 50-Mikrometer-Aros-eingebetteten Schnitten unter Verwendung des Plan-Apochromat-10×-0,4-Objektivs mit 488-, 543- und 633-Nanometer-Laserlinien. Rekonstruieren Sie serielle Z-Schnitte mithilfe der Zeiss-AIA-Vision-4.6- oder einer entsprechenden Bildanalyse-Software. Eine effiziente Markierung der embryonalen Gefäße ist entscheidend, um Defekte der Blutgefäße bei embryonalen Mäusen zu beurteilen. Diese Abbildungen zeigen eine spezifische Markierung der Blutgefäße im Thymus von E16,5-Embryonen sowie eine Doppelmarkierung von GSL-I und Selektin.

B vier injizierte Embryonen mit CD31 sowie Färbung der rechten und linken Herzkammern. Das GSL1-I-Selectin-B-vier-Protokoll für Kryoschnitte wurde in diesen Experimenten verwendet. Die Hohlmontage-Färbung des Hautblutgefäßnetzwerks an E16,5-Mäusen ist hier dargestellt, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.

Andere Methoden wie die gleichzeitige Markierung der Stromazellen und Blutzellen zusammen mit dem Gefäßsystem können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie interagieren Blutzellen und Stromazellen unter normalen und pathologischen Bedingungen mit dem Gefäßsystem im Mausembryo?