Name: Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit der Target ID Library einen genomweiten Screen für miRNA-Targets durchführen. Diese Methode nutzt stabile Zelllinien und Ganciclovir-Selektion zur Identifizierung spezifischer microRNA-Ziele.

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Wir danken der gesamten Sigma Life Science Mission Ziel-ID-Bibliothek Entwickler-Team, vor allem Kevin Gutshall für das Finden der Technologie und Verhandlung von Lizenz-und Vertragsbedingungen und Heather Holemon für ihre Unterstützung und Teilnahme an fruchtbaren Diskussionen zur Fehlerbehebung. Wir danken auch Dr. Joop Gäken von King &#39;s College London für den Austausch frei unveröffentlichte Ergebnisse und Anregungen, und Qazi Hamid von RxBiosciences zur Herstellung einer großen Charge von cDNA und seine Beharrlichkeit in immer es geklont. Wir möchten Nan Lin und Scott Bahr aus SAFC anerkennen, zur Durchführung von cDNA-Arrays und Datenanalyse. MISSION ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Autoren erklären, finanziellen Beziehungen zu Wirtschaftsunternehmen, die ein Interesse an der eingereichten Arbeit zu haben.

Mikro-RNAs sind 20-24 nt-RNAs die Genexpression regulieren posttranskriptional durch die Hemmung der mRNA-Translation und häufig, gezielte Destabilisierung der mRNA (Übersicht in [6]). Ein einzelner miRNA können regeln, mehrere hundert mRNAs einer Zelle Reaktion auf entwicklungs-und umweltpolitischen Signale steuern. Ermittlung und Validierung von Ziel-mRNAs ist von wesentlicher Bedeutung bei der Bestimmung einer miRNA die Rolle und Funktion in dieser Signalwege. Allerdings ist der Target-Identifizierung nicht einfach, weil, bei Tieren, miRNAs und deren Ziel-Seiten sind nicht vollständig komplementär. Der &quot;Seed&quot;-Region, Basen 2 bis 7 aus dem 5&#39;-Ende der miRNA, ist in der Regel komplementär zu seinen Zielen. Allerdings gibt es viele Ausnahmen von der Regel Saatgut, und nachgelagerten Basenpaarung kann für eine unvollkommene Samen Match auszugleichen. Eine Reihe von Computer-Algorithmen wurden entwickelt, um miRNA-Targets auf Seed-Matching-und nachgelagerten Ausgleich, Zielstruktur basiert prognostizieren eind Position, Sequenzkonservierung, und verschiedene andere Parameter, die für experimentell validierten Targets (Übersicht in [7]) beobachtet wurden. Während in silico Vorhersagen bequem sind und nicht identifizieren viele gültige miRNA-Targets, die meisten Gene vorhergesagt ausfallen experimentelle Validierung Tests und vielen tatsächlichen Ziele sind nicht vorhersehbar. Da außerdem Computer-Algorithmen auf vorher bestimmten Ziel-Funktionen basieren, erlauben sie nicht Entdeckung von Zielen, die von dem, was bereits bekannt abweichen. Eine Reihe von experimentellen Systemen wurden erfolgreich zu identifizieren oder zu entdecken funktionelle miRNA-Targets in lebenden Zellen eingesetzt. Diese globalen Screening-Methoden gehören Microarrays und RNA-Sequenzierung, RNA-Co-Immunopräzipitation (RIP) und Markierung mit stabilen Isotopen mit den Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC), eine Proteomik-Verfahren (Übersicht in [7]). Jede Methode hat Vor-und Nachteile. Da miRNA-Targeting oft destabilisiert eine mRNA und führt zu dessen Abbau, Verlust or Gewinn an mRNA-Ebene nach der Vorstellung eines miRNA imitieren oder Inhibitor bzw. identifizieren können miRNA-Targets. Dieser Verlust oder Gewinn von mRNA wird leicht durch Microarray-oder tief-Sequenzierung nachgewiesen. Während mRNA Nachweismethoden einfacher und empfindlicher als Protein Nachweismethoden sind, wird mRNA-Nachweis verpassen keine miRNA-Targets, die nicht abgebaut werden. Jüngste Berichte aus dem Labor Bartell Vergleich miRNA Ziel ergibt sich aus RNA-Detektion mit denen aus SILAC [8] oder Ribosomen-Profiling [9] zeigen, dass miRNAs Säugetieren überwiegend durch Reduzierung Ziel-mRNA-Spiegel handeln. Allerdings haben viele andere Labore arbeiten mit einzelnen miRNA Targets Änderung Protein aber keine Änderung in der mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Berichte von dem, was offenbar translationale Regulation ohne nachweisbare mRNA-Verlust sind: miR-10b auf HOXD10 [10], miR221/222 auf p27kip1 [11], miR-21 auf Pdcd4 [12], miR-126 auf p85β [13] , miR-34 auf SIRT1 [14], miR-21 auf PTEN [15], miR-302d auf Arid4b [16], miR-200c auf JAG1 [17], und miR-299, 297, 567, einemND 609 auf VEGFA [18]. Darüber hinaus Clancy et al [19] berichtete kürzlich, dass translationale Regulation von let-7 wurde nur erkannt, wenn einzelne mRNA-Isoformen, die die let-7-Ziel-Site enthalten, selektiv detektiert wurden. Letztere legt nahe, dass, zumindest in einigen Fällen, translationale Regulation in einem Verbundprofil übersehen werden - das heißt, wenn alle mRNA-Isoformen als eine mRNA nachgewiesen werden - wie bei vielen Mikroarray und Sequenzanalysen erhalten. Co-Immunpräzipitation von miRNA-mRNA-Komplexe über Argonaut (in der Regel Ago2) oder einem anderen assoziierten Protein (RNA Immunpräzipitation, oder RIP) wird unabhängig von miRNA-Targets Regulationsmechanismus zu isolieren. Darüber hinaus erkennt RIP endogenen und vermutlich biologisch relevante Wechselwirkungen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob alle miRNA-mRNA Interaktionen funktionsfähig sind, und würde keine RIP-mRNA-Ziele, die nur vorübergehend zu verbinden oder auch schnell abgebaut zu verpassen. Darüber hinaus müssen spezifische miRNA-mRNA-Partnern geschlossen werden bioinformatitisch, weil alle miRNA-mRNA-Paare kogefällten zusammen. Schließlich SILAC direkt identifiziert das Endprodukt der miRNA-Verordnung, das Protein selbst, ist aber unempfindlich und daher verfehlt selten Proteinen und kleinen Falte Veränderungen im Protein-Spiegel. Vor dem Hintergrund der aktuellen Einschränkungen mit miRNA Target-Identifizierung Methoden, fühlten wir uns eine zusätzliche globale Test auf funktionelle miRNA Targets durch einen alternativen Mechanismus identifizieren, benötigt wurde. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, lizenziert wir eine Technologie, die von Joop Gaken und Azim Mohamedali von King &#39;s College London erfunden. Die Erfindung ist ein Dual-Auswahl-Fusionsprotein, insbesondere ein Thymidinkinase-Zeocin-Fusion, reguliert von einem cDNA-Bibliothek potentieller miRNA-Zielsequenzen in der 3&#39;UTR. Zellen, die stabil mit und exprimieren TKzeo-cDNA transfiziert mit Zeocin ausgewählt werden, wie in 2 dargestellt. Nach dem Ausdruck einer miRNA von Interesse, kann, dass miRNA-Ziele ausgewählt werden, with Ganciclovir, wie in Abb. 3 dargestellt. Ganciclovir tötet Zellen, die Thymidinkinase, das heißt, alle Zellen wird TKzeo-cDNA exprimieren, fehlt ein Ziel für die miRNA von Interesse. Gezielte cDNA durch PCR-Amplifikation von DNA aus Zellen, die Ganciclovir unter Verwendung von Primern, die Flanke der cDNA, PCR-Produkte sequenziert und zur Identifizierung von Zielen kann überleben isoliert werden. Missionsziel ID-Bibliothek - Wir haben die King &#39;s College-Technologie in ein neues Tool für die globale Identifikation und Entdeckung der funktionellen humanen miRNA-Targets entwickelt. Mit dem Ziel-ID-Bibliothek kann der Benutzer Zieltranskripte durch eine Reihe von Säugerzellen Transfektion und Arzneimittelselektion Schritte zu isolieren. Die Bibliothek ist umfangreich und enthält 66-79% der menschlichen Gene. Erste Ergebnisse zeigen, dass beide zuvor entdeckt sowie neue Ziele können von der Mission Ziel-ID-Bibliothek isoliert werden. Obwohl das Protokoll ist von einiger Länge,Nutzung der Ziel-ID-Bibliothek erfordert Standard molekulargenetische Labor Techniken - Säugetier-Zellkultur, Transfektion, Medikamentenauswahl, PCR, Sequenzierung und - und sollte daher gut sein, im Rahmen der Möglichkeiten der meisten Biologen. Wir vermuten, dass genügend Aufmerksamkeit, um die ordnungsgemäße experimentelles Design bezahlt werden, die Optimierung der Kulturbedingungen, und am wichtigsten, Pre-Test jedes einzelnen neuen Zelltyp, um eine optimale Wirkstoffspiegel zur Auswahl Schritte (kill-Kurven), um Erfolg mit der Ziel-ID-Bibliothek gewährleisten zu bestimmen. Wie bei allen Ziel-miRNA-Identifikations-Methoden, ist es sehr empfehlenswert, dass die Ziele durch Screening der Ziel-ID identifiziert Bibliothek mit einer zweiten Methode, wie Microarray, qRT-PCR, Reporter-Assay (dh Luciferase) oder Western-Analyse bestätigt werden.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> TOPO TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute genomische Säuger-DNA-Miniprep-Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Zellspezifische Nucleofection kes </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Ziel-ID-Bibliothek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genomweiten screen für mirna-targets mit dem missionsziel id-bibliothek

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Die Ziel-ID-Bibliothek wurde entwickelt, um zur Entdeckung und Identifizierung von microRNA (miRNA)-Ziele zu unterstützen. Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, genomweiten cDNA-Bibliothek in der 3&#39;UTR hinter der Dual-Auswahl-Fusionsprotein, Thymidinkinase-Zeocin (TKzeo) kloniert. Die erste Runde der Wahl ist für eine stabile Transformanten, gefolgt mit Einführung einer miRNA von Interesse, und schließlich die Auswahl für die cDNAs mit der miRNA-Ziel. Ausgewählte cDNAs werden durch Sequenzierung (siehe Abbildung 1-3 für die Ziel-ID-Bibliothek und Workflow-Details) identifiziert. Um eine breite Abdeckung des menschlichen Transkriptom zu gewährleisten, wurden Ziel-ID-Bibliothek cDNAs über Oligo-dT-Priming mit einem Pool von Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben und Zelllinien hergestellt generiert. Die resultierende cDNA Bereich von 0,5 bis 4 kb, mit einer durchschnittlichen Größe von 1,2 kb, und wurden in die p3TKzeo Dual-Auswahl Plasmid kloniert (siehe 4 für Plasmid-Karte). Die Gen-Targets in der Li vertretenthek kann auf der Sigma-Aldrich Webseite. Ergebnisse von Illumina Sequenzierung (Tabelle 3) zeigen, dass die Bibliothek 16.922 der 21.518 Gene, die in einzigartiger UCSC RefGene (79%) oder 14.000 Genen, die mit 10 oder mehr liest (66%) enthält.

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

Die Target ID Library wurde entwickelt, um die Entdeckung und Identifizierung von microRNA- (miRNA)-Targets zu unterstützen. Die Target ID Library ist eine plasmidbasierte, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der Target-ID-Bibliothek einen genomweiten Hochdurchsatz-Screening von Mikro-RNA-Zielsequenzen durchzuführen. Dies wird durch die Transfektion von Zellen mit dem Bibliotheks-Plasmid erreicht. An die Transfektion einer genomweiten Sammlung klonierter cDNAs schließt sich die Selektion stabiler Zelllinien an.Die etablierten Bibliothekszellen werden anschließend mit dem Mikro-RNA-Expressionskonstrukt transfiziert, um eine Ko-Expression des Mikro-RNA-Ziels und der Thymidinkinase zu ermöglichen. An diesem Punkt wird Ganciclovir verwendet, um Zellen auszuwählen, die spezifische Mikro-RNA-Ziele exprimieren, indem gegen die Expression der Thymidinkinase selektiert wird. Die CD-NA, die Mikro-RNA-Bindungsstellen enthält, wird dann mittels der Target-ID-Amplifikationsprimer per PCR amplifiziert, um die Ziele der Mikro-RNA-Bibliothek zu sequenzieren und zu identifizieren.Schließlich werden Ergebnisse erzielt, die spezifische microRNA-Ziele in Zellen basierend auf einer Tiefensequenzierungsanalyse identifizieren. Die Mission-Target-ID-Bibliothek wurde entwickelt, um bei der Entdeckung und Identifizierung von Genzielen für microRNAs zu unterstützen. Hier demonstrieren wir ihre Verwendung und Anwendung.Vor Beginn dieses Protokolls eine Zelllinie auswählen, die den gewünschten IRA nicht exprimiert oder nur geringe Mengen davon produziert, die Zellen kultivieren und vermehren, um etwa zwei mal zehn hoch sieben Zellen bei 80 % Konfluenz zu erhalten. Nach der Trypsinbehandlung die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss überführen und die trypsinierten Zellen bei 200 × g fünf Minuten lang pelletieren. Nach dem Entfernen des Mediums das Zellpellet resuspendieren, um zu waschen, die Zellen erneut zentrifugieren und die Waschung ein zweites Mal wiederholen.Unterdessen vorbereiten ausreichend viele 0,5-Milliliter-Röhrchen für die Anzahl der Transfektionen, indem je zwei Mikrogramm der Ziel-ID-Bibliothek zu jedem Röhrchen hinzugefügt werden. Nun das Zellpellet im 15-Milliliter-Röhrchen unter Verwendung von 600 Mikrolitern einer Maxim-Nukleofektionslösung pro Transfektion resuspendieren. Jeweils eine Reaktion nach der anderen.Geben Sie 100 Mikroliter Zellen zur Aliquotte hinzu, zwei Mikrogramm Plasmid mit der Pipettenspitze mischend. Überführen Sie jedes Gemisch in einen Nuclear-Effector-Vete. Führen Sie einen Vete in das Nuclear-Effector-Instrument ein und führen Sie ein optimiertes Programm durch, das für die Zelllinie geeignet ist.Füllen Sie anschließend eine Transferpipette mit vorgewärmtem Medium. Saugen Sie die transfizierten Zellen mit derselben Pipette auf und überführen Sie sie in eine einzelne Vertiefung einer zuvor vorbereiteten sechswelligen Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede NU-Kernaffektion nach NU-Kernaffektion.Bringen Sie die Zellen am nächsten Tag für eine Übernacht-Inkubation in die Wachstumskammer zurück. Ersetzen Sie das Medium und lassen Sie die Zellen drei bis fünf Tage lang regenerieren. Sobald die Zellen regeneriert sind, entfernen Sie das Medium und geben vollständiges Medium mit der geeigneten Konzentration an Eosin hinzu, um die stabile Integration und Expression des TKZO-Fusionsproteins zu selektieren.Die Eosinkonzentration kann vorab wie im Text beschrieben bestimmt werden. Überwachen Sie die Zellen hinsichtlich der Eosinauswahl durch die Zellviabilität. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage durch frisches, Eosin enthaltendes Medium.Wenn die Zellen in der 6-Well-Platte konfluent sind, passagieren und expandieren Sie die Zellen in größere Kolben. Eine Kill-Kurven-Analyse wird durchgeführt, um die minimale letale Dosis für die im Experiment verwendeten Selektionsreagenzien zu bestimmen. Um unerwünschte phänotypische Reaktionen zu vermeiden, sollten die Kill-Kurven zunächst durchgeführt werden, indem die Zellen am nächsten Tag in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit jeweils 120 Mikrolitern frischem Medium ausgesät werden.Fügen Sie das Medikament den ausgewählten Vertiefungen hinzu. Antibiotika wie G418 oder Puromycin werden verwendet, um die Integration des miRNA-Expressionskonstrukts auszuwählen, oder Aciclovir wird verwendet, um gegen die Expression von Thymidinkinase auszuwählen. Während der Inkubation überprüfen Sie alle zwei Tage die Zellviabilität für jede Medikamentenkonzentration. Ersetzen Sie das Medium, das das Selektionsreagenz enthält, alle drei Tage.Die minimale Konzentration des Selektionsreagenz, die nach der gewünschten Zeit einen vollständigen Zelltod verursacht, sollte für diesen Zelltyp und das jeweilige Experiment verwendet werden, nachdem die Wirkstoffkonzentrationen bestimmt wurden. Bereiten Sie für MI eine Transfektion vor, indem Sie die Ziel-ID-Bibliothek-Zellen vermehren und expandieren, um zwei mal 10 hoch 7 Zellen zu erhalten. Versetzen Sie die Zellen mit Trypsin, wenn sie eine Konfluenz von mehr als 80 % erreicht haben.Überführen Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen und pelletieren Sie sie bei 200 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie das Zellpellet zweimal wie zuvor. Fügen Sie danach für jede Transfektion zwei Mikrogramm des MIRA-Expressionsplasmids einem 0,5-Milliliter-Röhrchen hinzu.Führen Sie die nukleäre Transfektion der mRNA in die Bibliothekszellen mit derselben Methode durch, die auch für die Transfektion der Ziel-ID-Bibliothek verwendet wurde. Nachdem sich die Zellen drei bis fünf Tage lang erholt haben, ersetzen Sie das Medium durch komplettes Medium, das die geeignete Konzentration des Antibiotikums enthält, wie durch den Kill-Kurve-Test bestimmt.Überwachen Sie die Zellen auf Antibiotikaselektion und ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage durch Medium, das das Antibiotikum enthält. Wenn die Zellen in der 6-Loch-Platte konfluent sind, passagieren und erweitern Sie die Zellen in größere Kolben. Wie zuvor ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das die geeigneten Konzentrationen von GCV und Antibiotikum enthält.Überwachen Sie die Zellen auf Thymidinkinase-Expression und mRNA-Expression mittels Zellviabilität und vermehren Sie die überlebenden Zellen in Gegenwart von GCV und Antibiotikum. Bereiten Sie anschließend genomische DNA aus den mit GCV selektierten Zellen vor. Amplifizieren Sie ausgewählte Bibliothekseinschübe mittels Kit-Primern per PCR und klonen Sie diese wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Im Anschluss können Sequenzierungsreaktionen mit Amplifikationsprimern durchgeführt werden. Als letzter Schritt identifizieren Sie die Gengiele durch Blast-Alignment der Sequenzen mit dem menschlichen Transkriptom für bekannte Transkripte und mit dem menschlichen Genom für neuartige Transkripte. Ein bloßer 3 73 exprimierender Konstrukt wurde stabil in die MC-sieben-Bibliothek transfiziert und in einem Medium mit Ganciclovir ausgewählt, um Zellen, die bloß 3 73 exprimieren, anzureichern.GCV wirkt sich nicht auf MCF-sieben-Zellen ohne Bibliothek aus, da diese keine Thymidinkinase exprimieren. Andererseits exprimieren C-sieben-Bibliothekszellen zwar Thymidinkinase, werden aber durch Ganciclovir bei acht oder 16 Mikromolar nicht vollständig abgetötet, wie lebende Zellen zeigen, die Brillantblau aufnehmen. Die Bibliothekszellen stellen jedoch ihr Wachstum in GCV ein, wie die Färbung des Phenolrot-Farbstoffs in ihrem Medium belegt.Die arrestierten Zellen saueren ihr Medium nicht an, und die Farbe bleibt rötlich. Statt dessen wurden orangefarbene, gelbe Zielsequenzen aus den überlebenden Zellen isoliert, per PCR amplifiziert und sequenziert.Es wurden nahezu 12 Millionen cDNA-Lesungen erhalten, die auf nahezu 12.000 eindeutige Gene abgebildet wurden. Von diesen eindeutigen Genen galten 234 aufgrund der Trefferhäufigkeit als zuverlässige Treffer und waren spezifisch für lediglich 3 73. Ein erster Vergleich ergab, dass 10 der mit der Ziel-ID-Bibliothek identifizierten eindeutigen Gene ebenfalls in der Liste zuvor identifizierter Zielgene von lediglich 3 73 in tar base enthalten sind.Daher sind diese 10 wahrscheinlich gültige Zielstrukturen von mere 3 73 und werden derzeit charakterisiert, um ausgewählte Hits experimentell zu validieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mission Target ID-Bibliothek verwenden, um einen hochdurchsatzfähigen, genomweiten Screen für microRNA-Genziele durchzuführen.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Lumineszierende Identifizierung von funktionellen Elementen in 3' untranslatierten Regionen (3'UTRs) (3'LIFE) ist eine Technik zur Identifizierung der funktionellen Regulation in 3'UTRs durch miRNAs oder andere regulatorische Faktoren. Dieses Protokoll verwendet Hochdurchsatzmethoden wie 96-Well-Transfektion und Luciferase-Assays, um Hunderte von mutmaßlichen Wechselwirkungen auf funktionelle Repression zu untersuchen.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

Hier stellen wir eine neue und vollautomatische miRNA-Pipeline vor, mirMachine, die 1) bekannte und neuartige miRNAs genauer identifizieren kann und 2) vollautomatisch und frei verfügbar ist. Benutzer können nun ein kurzes Einreichungsskript ausführen, um die vollautomatische mirMachine-Pipeline auszuführen.

mirMachine: Ein One-Stop-Shop für pflanzliche miRNA-Annotation

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Erfahren Sie, wie Sie mit der Target ID Library einen genomweiten Screen für miRNA-Targets durchführen. Diese Methode nutzt stabile Zelllinien und Ganciclovir-Selektion zur Identifizierung spezifischer microRNA-Ziele.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

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