Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der Target-ID-Bibliothek einen genomweiten Hochdurchsatz-Screening von Mikro-RNA-Zielsequenzen durchzuführen. Dies wird durch die Transfektion von Zellen mit dem Bibliotheks-Plasmid erreicht. An die Transfektion einer genomweiten Sammlung klonierter cDNAs schließt sich die Selektion stabiler Zelllinien an.

Die etablierten Bibliothekszellen werden anschließend mit dem Mikro-RNA-Expressionskonstrukt transfiziert, um eine Ko-Expression des Mikro-RNA-Ziels und der Thymidinkinase zu ermöglichen. An diesem Punkt wird Ganciclovir verwendet, um Zellen auszuwählen, die spezifische Mikro-RNA-Ziele exprimieren, indem gegen die Expression der Thymidinkinase selektiert wird. Die CD-NA, die Mikro-RNA-Bindungsstellen enthält, wird dann mittels der Target-ID-Amplifikationsprimer per PCR amplifiziert, um die Ziele der Mikro-RNA-Bibliothek zu sequenzieren und zu identifizieren.

Schließlich werden Ergebnisse erzielt, die spezifische microRNA-Ziele in Zellen basierend auf einer Tiefensequenzierungsanalyse identifizieren. Die Mission-Target-ID-Bibliothek wurde entwickelt, um bei der Entdeckung und Identifizierung von Genzielen für microRNAs zu unterstützen. Hier demonstrieren wir ihre Verwendung und Anwendung.

Vor Beginn dieses Protokolls eine Zelllinie auswählen, die den gewünschten IRA nicht exprimiert oder nur geringe Mengen davon produziert, die Zellen kultivieren und vermehren, um etwa zwei mal zehn hoch sieben Zellen bei 80 % Konfluenz zu erhalten. Nach der Trypsinbehandlung die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss überführen und die trypsinierten Zellen bei 200 × g fünf Minuten lang pelletieren. Nach dem Entfernen des Mediums das Zellpellet resuspendieren, um zu waschen, die Zellen erneut zentrifugieren und die Waschung ein zweites Mal wiederholen.

Unterdessen vorbereiten ausreichend viele 0,5-Milliliter-Röhrchen für die Anzahl der Transfektionen, indem je zwei Mikrogramm der Ziel-ID-Bibliothek zu jedem Röhrchen hinzugefügt werden. Nun das Zellpellet im 15-Milliliter-Röhrchen unter Verwendung von 600 Mikrolitern einer Maxim-Nukleofektionslösung pro Transfektion resuspendieren. Jeweils eine Reaktion nach der anderen.

Geben Sie 100 Mikroliter Zellen zur Aliquotte hinzu, zwei Mikrogramm Plasmid mit der Pipettenspitze mischend. Überführen Sie jedes Gemisch in einen Nuclear-Effector-Vete. Führen Sie einen Vete in das Nuclear-Effector-Instrument ein und führen Sie ein optimiertes Programm durch, das für die Zelllinie geeignet ist.

Füllen Sie anschließend eine Transferpipette mit vorgewärmtem Medium. Saugen Sie die transfizierten Zellen mit derselben Pipette auf und überführen Sie sie in eine einzelne Vertiefung einer zuvor vorbereiteten sechswelligen Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede NU-Kernaffektion nach NU-Kernaffektion.

Bringen Sie die Zellen am nächsten Tag für eine Übernacht-Inkubation in die Wachstumskammer zurück. Ersetzen Sie das Medium und lassen Sie die Zellen drei bis fünf Tage lang regenerieren. Sobald die Zellen regeneriert sind, entfernen Sie das Medium und geben vollständiges Medium mit der geeigneten Konzentration an Eosin hinzu, um die stabile Integration und Expression des TKZO-Fusionsproteins zu selektieren.

Die Eosinkonzentration kann vorab wie im Text beschrieben bestimmt werden. Überwachen Sie die Zellen hinsichtlich der Eosinauswahl durch die Zellviabilität. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage durch frisches, Eosin enthaltendes Medium.

Wenn die Zellen in der 6-Well-Platte konfluent sind, passagieren und expandieren Sie die Zellen in größere Kolben. Eine Kill-Kurven-Analyse wird durchgeführt, um die minimale letale Dosis für die im Experiment verwendeten Selektionsreagenzien zu bestimmen. Um unerwünschte phänotypische Reaktionen zu vermeiden, sollten die Kill-Kurven zunächst durchgeführt werden, indem die Zellen am nächsten Tag in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit jeweils 120 Mikrolitern frischem Medium ausgesät werden.

Fügen Sie das Medikament den ausgewählten Vertiefungen hinzu. Antibiotika wie G418 oder Puromycin werden verwendet, um die Integration des miRNA-Expressionskonstrukts auszuwählen, oder Aciclovir wird verwendet, um gegen die Expression von Thymidinkinase auszuwählen. Während der Inkubation überprüfen Sie alle zwei Tage die Zellviabilität für jede Medikamentenkonzentration. Ersetzen Sie das Medium, das das Selektionsreagenz enthält, alle drei Tage.

Die minimale Konzentration des Selektionsreagenz, die nach der gewünschten Zeit einen vollständigen Zelltod verursacht, sollte für diesen Zelltyp und das jeweilige Experiment verwendet werden, nachdem die Wirkstoffkonzentrationen bestimmt wurden. Bereiten Sie für MI eine Transfektion vor, indem Sie die Ziel-ID-Bibliothek-Zellen vermehren und expandieren, um zwei mal 10 hoch 7 Zellen zu erhalten. Versetzen Sie die Zellen mit Trypsin, wenn sie eine Konfluenz von mehr als 80 % erreicht haben.

Überführen Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen und pelletieren Sie sie bei 200 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie das Zellpellet zweimal wie zuvor. Fügen Sie danach für jede Transfektion zwei Mikrogramm des MIRA-Expressionsplasmids einem 0,5-Milliliter-Röhrchen hinzu.

Führen Sie die nukleäre Transfektion der mRNA in die Bibliothekszellen mit derselben Methode durch, die auch für die Transfektion der Ziel-ID-Bibliothek verwendet wurde. Nachdem sich die Zellen drei bis fünf Tage lang erholt haben, ersetzen Sie das Medium durch komplettes Medium, das die geeignete Konzentration des Antibiotikums enthält, wie durch den Kill-Kurve-Test bestimmt.

Überwachen Sie die Zellen auf Antibiotikaselektion und ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage durch Medium, das das Antibiotikum enthält. Wenn die Zellen in der 6-Loch-Platte konfluent sind, passagieren und erweitern Sie die Zellen in größere Kolben. Wie zuvor ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das die geeigneten Konzentrationen von GCV und Antibiotikum enthält.

Überwachen Sie die Zellen auf Thymidinkinase-Expression und mRNA-Expression mittels Zellviabilität und vermehren Sie die überlebenden Zellen in Gegenwart von GCV und Antibiotikum. Bereiten Sie anschließend genomische DNA aus den mit GCV selektierten Zellen vor. Amplifizieren Sie ausgewählte Bibliothekseinschübe mittels Kit-Primern per PCR und klonen Sie diese wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Im Anschluss können Sequenzierungsreaktionen mit Amplifikationsprimern durchgeführt werden. Als letzter Schritt identifizieren Sie die Gengiele durch Blast-Alignment der Sequenzen mit dem menschlichen Transkriptom für bekannte Transkripte und mit dem menschlichen Genom für neuartige Transkripte. Ein bloßer 3 73 exprimierender Konstrukt wurde stabil in die MC-sieben-Bibliothek transfiziert und in einem Medium mit Ganciclovir ausgewählt, um Zellen, die bloß 3 73 exprimieren, anzureichern.

GCV wirkt sich nicht auf MCF-sieben-Zellen ohne Bibliothek aus, da diese keine Thymidinkinase exprimieren. Andererseits exprimieren C-sieben-Bibliothekszellen zwar Thymidinkinase, werden aber durch Ganciclovir bei acht oder 16 Mikromolar nicht vollständig abgetötet, wie lebende Zellen zeigen, die Brillantblau aufnehmen. Die Bibliothekszellen stellen jedoch ihr Wachstum in GCV ein, wie die Färbung des Phenolrot-Farbstoffs in ihrem Medium belegt.

Die arrestierten Zellen saueren ihr Medium nicht an, und die Farbe bleibt rötlich. Statt dessen wurden orangefarbene, gelbe Zielsequenzen aus den überlebenden Zellen isoliert, per PCR amplifiziert und sequenziert.

Es wurden nahezu 12 Millionen cDNA-Lesungen erhalten, die auf nahezu 12.000 eindeutige Gene abgebildet wurden. Von diesen eindeutigen Genen galten 234 aufgrund der Trefferhäufigkeit als zuverlässige Treffer und waren spezifisch für lediglich 3 73. Ein erster Vergleich ergab, dass 10 der mit der Ziel-ID-Bibliothek identifizierten eindeutigen Gene ebenfalls in der Liste zuvor identifizierter Zielgene von lediglich 3 73 in tar base enthalten sind.

Daher sind diese 10 wahrscheinlich gültige Zielstrukturen von mere 3 73 und werden derzeit charakterisiert, um ausgewählte Hits experimentell zu validieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mission Target ID-Bibliothek verwenden, um einen hochdurchsatzfähigen, genomweiten Screen für microRNA-Genziele durchzuführen.