Name: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit der MISSION LentiPlex shRNA-Bibliothek ein positives Selektionsscreening in Säugerzellen durchführen. Diese Methode identifiziert Genziele, die das Zellüberleben fördern, und validiert Ergebnisse durch Sequenzierung.

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MISSION ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP LentiPlex ist ein Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

LentiPlex Pooled Screen Setup Zur Identifizierung shRNA-Sequenzen von Interesse ist es wichtig, die Einrichtung des Bildschirms, so dass die Mehrzahl der Zellen erhalten nur eine shRNA konstruieren. Durch die Verwendung einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion), ist die Wahrscheinlichkeit, mehrere Integranten pro Zelle deutlich verringert worden. Allerdings hängen Transduktion Effizienz und damit gewünschte MOIs, stark auf der Zielzelle aus. Daher ist es unerlässlich, dass die Bestimmung der optimalen MOI aus ist, bevor der Bildschirm in einer neuen Zelltyp durchgeführt. 1. Transduktion von Zielzellen mit der Mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek <ol><li> Die tatsächliche MOI verwendet werden für verschiedene Zelltypen variieren. Wenn Wiederholungen sind erwünscht dann die Anzahl der Platten müssen entsprechend erhöht werden. Darüber hinaus, in der Regel ist es nicht vorteilhaft, die verschiedenen Unterpools kombinieren. Keeping the Unterpools separaten wird in der Entfaltung zu unterstützen. Stellen Sie sicher, proper Kennzeichnung jedes Gewebe Kulturschale mit dem Teilpool Zahl, die während der Transduktion angewendet wird. Eine niedrige MOI wird empfohlen, die Wahrscheinlichkeit einer multiplen Integranten pro Zelle zu reduzieren. </li><li> Tag 1 - Seed die entsprechende Anzahl von 60-mm-Platten mit genügend Zellen zu ~ 70% Konfluenz am folgenden Tag (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausfertigung = 30 Gerichte insgesamt durchgeführt) erhalten. Für unsere Studie wurden 60 mm Platten mit 6 x 105 A549-Zellen ausgesät zu einer Konfluenz von 70% vor der Transduktion zu erreichen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen noch in der exponentiellen Wachstumsphase. Die Wachstumsraten werden von Zelltyp variieren und müssen vor dem Start des Bildschirms bestimmt werden. </li><li> Lassen Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO 2 zu halten. </li><li> (Optional) Fügen Sie zwei zusätzliche 60-mm-Platten für die Transduktion mit Negativ-Kontrolle shRNAs. Beschriften Sie die Gerichte "Control A" für SHC001H und "Control B" für SHC002H. </li><li> Tag 2 - transduzieren the-Zellen mit dem LentiPlex Viruspartikel. Am Tag der Transduktion, tauen die lentiviralen Partikeln auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die aufgetauten Partikel zu einer Laminar-Flow-Haube und halten auf dem Eis, wenn nicht sofort verwendet wird. </li><li> Berechnen Sie, wie viel von jedem einzelnen viralen sub-Pool, um die Zellen hinzufügen, um den MOI von 1 in allen Zellkulturschalen zu bekommen. <ol><li> Beispiel: 1 x 10 6 Zellen / Schale; virale Titer = 5 x 10 8 TU / ml; eine gewünschte MOI von 1. i.) 1 x 10 6 Zellen / Schale x (MOI von 1) = 1 x 10 6 transduzierende Einheiten (TU) benötigt ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) aus der C erhalten A = 2 ul des lentiviralen Stammlösung sollte an die entsprechende Gericht hinzugefügt werden. Verdünnen Sie die berechnete Menge des Virus in 100-300 ul kompletter Medien, um eine bessere Verteilung des Virus, wenn die Zelle Kulturschale gegeben gewährleisten. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Medium aus der Vor-ausgesäten Zellen. Add komplette Medien-containing Hexadimethrinbromid Lösung zu jedem Gericht. Die empfohlene Endkonzentration von Hexadimethrinbromid in Medien liegt bei 8 pg / ml. Verwenden Sie weniger Hexadimethrinbromid, wenn Sie es als toxisch für Ihre Zielzellen zu finden. </li><li> Add shRNA Lentivirale Partikel geeignete Gerichte in Übereinstimmung mit den vorgegebenen experimentellen Design. Vorsichtig schwenken die Platten gleichmäßig zu verteilen das Virus in den Zellen. </li><li> Inkubieren 18-20 Stunden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> (Optional) Wiederholen Sie 3-8 an der gleichen MOI mit SHC001H (Leervektor shRNA Control) in der Systemsteuerung Dish A und SHC002H (Rührei shRNA control) in Control Dish B. Behandeln Sie diese Gerichte identisch mit dem experimentellen Speisen während des ganzen Experiments. </li><li> Tag 3 - Ändern Sie die Medien. Saugen Sie Virus-haltigen Medien und fügen frische komplette Medien (ohne Hexadimethrinbromid). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Gönnen vernickeltZellen mit therapeutischen Komponente / Reagenz <ol><li> Tag 4 - absaugen Medien aus Brunnen und fügen neue Medien mit therapeutische Komponente in der optimalen Konzentration. Wie bei Kulturbedingungen wird Behandlungen variieren und richtige Konzentration und Dauer sollte vorher bestimmt werden. In unserer Studie haben wir 100 ng / ml TRAIL und 1 uM Paclitaxel. Die Zellen wurden für 48 Stunden behandelt. </li><li> Die überlebenden Zellen sollten in T75 Flaschen erneut ausgesät werden und dürfen bis fast 100% konfluent zu erweitern. </li><li> (Optional) Am Ende der Auswahl, inspizieren Steuerung Dish A and Control Dish B. Dish A und B Dish sollte jeder haben weniger Kolonien als mindestens einer der zusammengefassten Bibliothek Gerichte. Wenn es eine unerwartet hohe Anzahl von Kolonien in Dish sind A, als entweder die Transduktion Prozess hat einen Weg im Zusammenhang mit dem gewünschten Phänotyp oder den selektiven Druck beeinflusst nicht intensiv genug ist und re-Optimierung des Assays kann erforderlich sein. Wenn Dish B enthält zu viele Kolonien, Dann Expression von shRNA und das Engagement der RNAi-Weg kann einen Einfluss auf den Phänotyp des Interesses. Wenn dies der Fall wiederholen mit SHC001H, um sicherzustellen, dass die Wirkung nicht spezifisch für SHC002H. </li></ol> 3. Dekonvolution von einer polyklonalen Zellpopulation <ol><li> Ernten Sie die heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA. In unserer Studie wurden die Zellen kurz in PBS gewaschen und trypsiniert vor genomische DNA wurde unter Verwendung der GenElute Mammalian Genomic Miniprep Kit und versorgt Protokoll (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativ kann auch jede andere genomische Aufreinigungskits, die derzeit auf dem Markt für DNA-Isolierung verwendet werden. Es ist wichtig zu Protokoll Empfehlungen für den Grundbetrag von kultivierten Zellen folgen. </li><li> PCR-Amplifikation von Zielen. Die shRNA Vorlage Recovery-Prozedur ermöglicht Amplifikation des gesamten Pool von shRNA-Einsätze von der ausgewählten Zelle Bevölkerung oder das Abrufen von indiviDual shRNA Vorlagen aus Kolonien, die einzeln aufgenommen und erweitert worden. Nach der Verstärkung der shRNA Einsätze aus Kontrolle und ausgewählte Zielzellen kann die PCR-Produkte sequenziert werden. </li><li> Das PCR-Amplifikation Schritt wurde optimiert mit Sigma ReadyMix, Katalog-Nr P2893. Andere Reagenzien können zur Verstärkung eingesetzt werden, aber das Radfahren Bedingungen und / oder Magnesium-Konzentration Möglicherweise müssen Sie für eine erfolgreiche Amplifikation geändert werden. Amplifikationsprimer in der Konzentration 20 mM mit dem LentiPlex Kit enthalten. </li><li> Richten Sie die PCR-Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben. Fügen Sie die Komponenten in der aufgeführten Reihenfolge. Die beschriebenen Mengen sind für einen 50 &amp;mgr; Reaktion. Weitere Reaktionen, Maßstab der Master-Mix-Komponenten durch die gewünschte Anzahl von Reaktionen und beinhalten 10% Überschuss. Die Menge an DNA-Template wird empfohlen 50-100 ng. </li><li> Es wird dringend empfohlen, die für eine Reaktion der Vorlage der MISSION shRNA menschliche Positive Control Vector verdünnt, um die appropr bestehtiate Konzentration. Erfolgreiche Amplifikation mit dieser Vorlage zeigt, dass die PCR-Assay-Komponenten und Radfahren Bedingungen angemessen sind. Hinweis: Um zu verhindern, Verschleppung der experimentellen Proben und Reagenzien, wird vorgeschlagen, dass die positive Kontrolle in einem separaten Ort, von dem anschließenden PCR-Reaktionen sind eingerichtet verdünnt werden. </li><li> Speichern Sie die PCR-Programm in Tabelle 2 in Ihre Thermocycler aufgeführt. </li><li> Für jede Probe kombinieren 3 ul PCR-Reaktion mit 1 ul Farbstoff und Elektrophorese neben 5 ul DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Ladder, Catalog Number D3687 auf einem 1% Agarosegel auf das Vorhandensein von einem 309 bp Amplikon zu bestätigen. </li><li> Subklonierung von PCR-Produkte: PCR-Produkte wurden TOPO kloniert mit dem TOPO-TA Cloning Kit nach Protokoll des Herstellers (Invitrogen, K4575-01). Das Ergebnis ist, dass man PCR-Produkt in jedem Vektor enthalten ist. </li><li> 250 Einzel-Bakterienkolonien (jeweils eine individuelle PCR Amplikon) wurden isoliert und wachsenn in 2 mL Kulturen LB mit 100 mg / mL Ampicillin. Plasmid-DNA wurde dann extrahiert mit der GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Gereinigte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI verdaut und elektrophoretisch auf das Vorhandensein des Einsatzes zu bestätigen. </li><li> Plasmid-DNA Proben wurden dann sequenziert und die shRNA einfügen, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank mit dem LentiPlex Bibliothek zur Verfügung gestellt. </li></ol> 4. Target-Identifizierung und-Validierung <ol><li> Die shRNA-Sequenz initiiert mit 5'-GAAACACCGG-3 '. Geben Sie mindestens die nächsten 10, aber weniger als 21 Nukleotiden, wie die Abfrage-Sequenz in das Suchfeld auf der beiliegenden shRNA Sequenz Search Access-Datenbank zu bilden. </li><li> Wählen Sie die Art der gepoolten shRNA. Optional können Sie das Teilpool aus dem die Sequenz gefunden wurde. </li><li> Jetzt auf "Find Potenzielle Hits"-Taste, um die Suche durchzuführen klicken. Diese sollten die entsprechenden TRC shRNA-Sequenz (en), th Spiele-Sequenzierung Daten. Mehr Informationen über die TRC shRNA Sequenz (en) identifiziert und die entsprechenden Gen-Targets können ohne weiteres bei Sigma-Aldrich Your Favorite Gene gefunden werden: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Identified Zielgene sollte durch Wiederholung der ursprünglichen Screening-Test mit dem Original TRC Klon plus mindestens zwei weitere shRNAs, dass das gleiche Gen mit einem 1 zu 1 shRNA-Well-Format Ziel validiert werden. Echte Hits zeigt den gleichen Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine LentiPlex gebündelt Bildschirm Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt sind. Transduzierten Zellen, die in Gegenwart von TRAIL und Paclitaxel vermehrt durften expandieren, bis Kolben wurden konfluent. Genomische DNA wurde geerntet und die PCR-Amplifikation und Klonierung, wie in Abbildung 1 dargestellt A, bevor sie für die Sequenzierung und shRNA Identifizierung vorgelegt, wie in Figu beschriebenre 1 C. 250 Klone wurden sequenziert, von diesen 25 wurden durch mehrere Klone vertreten und die restlichen 225 wurden nur um 1 Klon vertreten und wurden zu dieser Zeit nicht verfolgt. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden mehrere Kandidatengene einschließlich TBX3, PPP2CA und AKT2 durch mehrere Klone vertreten. Die T-box-Transkriptionsfaktor, erschien TBX3 in insgesamt vier Klone und hat in der Tumor-Migration 5 in Verbindung gebracht. PPP2CA Herunterregulation wurde gezeigt, dass das Wachstum von LNCaP-Zellen in Androgen-Mangel Bedingungen kultiviert durch Entlastung der Androgen-Deprivation-induzierten Zellzyklusarrest und Verhinderung von Apoptose 6 zu halten. AKT2 ist ein RAC-beta Serin / Threonin-Proteinkinase und vermeintlichen Onkogen nachgewiesen, dass mehrere Rollen in der Entwicklung von Krebs 7, 8 zu spielen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> * Final Konzentration von Mg 2 + in Lösung 3 mm betragen;1,5 mm von der Taq ReadyMix und 1,5 mm von der Magnesiumchlorid-Lösung beigetragen. Tabelle 1. Lentiplex PCR-Reaktionsbedingungen <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabelle 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 2"> Tabelle 2. Lentiplex PCR Amplification Programm <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1c"> Abbildung 1. (A) LentiPlex Bildschirm gebündelt, (B) Polyklonale Dekonvolution Workflow und (C) Identifizierung von shRNA Ziele. A. LentiPlex gebündelt Bildschirm. Erstens Seed-Zellen, dann fügen Sie shRNA Unterpools, (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausführung durchgeführt, für 30 Gerichte insgesamt). Als nächstes mit therapeutischen Komponente / Reagenz (in unserem Fall, TRAIL und Pa behandelnclitaxel jeweils). Dann reseed überlebenden Zellen in Flaschen und damit zu erweitern. Ernte heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA. B. Polyklonale Entfaltung. Führen Sie die PCR, DNA, welche die shRNA einfügen zu verstärken. Das PCR-Produkt ist eine einheitliche Größe, sondern polyklonalen in Folge seit der Vorlage gDNA wurde auch polyklonal. PCR-Produkt wird in den Vektor kloniert und anschließend in kompetente Bakterien transformiert. C. Identifizierung von shRNA Ziele. Einzelne Kolonien werden isoliert und Plasmid-DNA wird extrahiert. Jeder Klon enthält den Klonierungsvektor mit einer einzelnen PCR-Fragment. Plasmid-DNA wird verdaut, um die Anwesenheit des Inserts sequenziert und zu bestätigen. Die shRNA Einsatz ist, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Identifiziert werden könnenKandidatengene. 25 Kandidatengene identifiziert, hatte mehrere Treffer. 225 Kandidaten-Gene hatte nur 1-Hit und wurden nicht weiter verfolgt. Bitte beachten Sie Ergänzende Tabelle 1 für eine Aufschlüsselung der einzelnen Klone pro Kandidatengen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Ergänzende Tabelle 1. Individuelle TRC-Bibliothek Klone aus polyklonalen Sequencing Gene ID identifizierte Hits Detected Clones.

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</ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, und John Swarthout werden von Sigma-Aldrich, welche Werkzeuge und Reagenzien in diesem Artikel verwendet wird eingesetzt.

In dieser Studie präsentieren wir eine genomweite Bildschirm, um Gene in Zytotoxizität von A549-Zellen nach Paclitaxel / TRAIL-Behandlung beteiligt sind. Die Verwendung einer gepoolten Ansatz in einer genomweiten Screen reduziert die Zeit, Kosten und Ausrüstungsinvestitionen in der Regel mit konventionellen angeordnet Bildschirmen verbunden. Entscheidend für den Erfolg des Bildschirms sind die Optimierung Experimente durchgeführt vorher. Transduction Bedingungen und MOI muss empirisch ermittelt werden. Die Auswahl-Methode sollte für robuste Auswahl von Zellen, die den gewünschten Phänotyp (zB Überleben, Oberfläche Proteinexpression, etc) zu ermöglichen. Die Optimierung dieser Parameter wird die Anzahl der Fehlalarme erkannt. Hier wurde gDNA von der Masse der Bevölkerung der ausgewählten Zellen geerntet und dann TOPO kloniert, um individuelle shRNA Einsätze zu identifizieren. Eine mögliche Verbesserung für dieses Experiment wäre es gewesen, für lebende Zellen mit FACS, um sicherzustellen, wählen Sie habendass nur lebende Zellen gesammelt werden. Die identifizierten Ziele werden durch Transduktion mit target-spezifischen shRNAs in einem Screening-Test bestätigt werden. Echte Hits zeigt den Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen. Die LentiPlex Pooled-Bibliothek ist in seiner Anwendung flexibel. Es ist kompatibel mit einer breiten Palette von Downstream-Anwendungen und kann entweder mit positiven oder negativen Selektion Strategien verwendet werden. Abhängig von der Screening-Bedingungen, Entfaltung der shRNA-Einsätze erfolgt über PCR / Klonierung, Microarray-oder Next-Generation-Sequenzierung 9, 10 erreicht. Während die Leistung und Geschwindigkeit dieser Techniken, um RNAi-Screens Dekonvolution gut etabliert ist, eine Beschäftigung mit Microarray-und Next-Generation-Sequencing-Methoden ist die Verfügbarkeit der Bioinformatik Ressourcen und Wissen benötigt, um richtig zu analysieren und zu interpretieren experimentelle Ergebnisse. Die Kosten, die mit diesen Techniken kann oftmals ein Hindernis für die Verpflichtung von genomweiten Screens werden. APCR / Klonen Ansatz, die zwar nicht so leistungsfähig wie Microarrays und der nächsten Generation Sequenzierung ist eine effektive und kostengünstige Alternative. Agilent bietet jetzt ein benutzerdefiniertes Feld auf dem TRC shRNA Bibliothek, um weiter in LentiPlex Bildschirme basieren. Diese Optionen ermöglichen es Forschern, LentiPlex verwenden, um ein breites Spektrum von zellulären Funktionen zu studieren.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Pooled Array</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = en &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq ReadyMix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute Plasmid Miniprep Kit</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Hexadimethrinbromid</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna bibliothek screening in säugerzellen

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein wesentlicher zellulärer Mechanismus für die Regulation der Genexpression. Die Nutzung der angeborenen Kraft dieses System ermöglicht es uns, Knockdown Genexpression zu einem Verlust der Genfunktion Studien. Es gibt zwei Methoden für die Durchführung von RNAi. Der erste ist der Einsatz von small interfering RNAs (siRNAs), die chemisch synthetisiert werden, und die zweite nutzt kurz-Haarnadel RNAs (shRNAs) innerhalb von Plasmiden 1 kodiert. Letztere können in Zellen transfiziert direkt oder verpackt in Replikation inkompetent lentiviralen Partikeln. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von lentiviralen shRNAs ist die einfache Einführung in eine Vielzahl von Zelltypen, ihre Fähigkeit, stabil in das Genom für die langfristige Gen Knockdown und Auswahl zu integrieren, und ihre Wirksamkeit bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Verlust der Funktion Bildschirme. Um dies zu erleichtern haben wir die LentiPlex gebündelt shRNA Bibliothek erstellt. Die MISSION LentiPlex Menschliche shRNA Pooled Library ist eine genomweite lentiviralen Pool produziert mithilfe eines firmeneigenen Verfahrens. Die Bibliothek besteht aus über 75.000 shRNA Konstrukte aus dem TRC-Sammlung Targeting 15.000 + menschlichen Gene 2. Jede Bibliothek ist für shRNA Vertretung vor Produkt-Release getestet, um robuste Bibliothek Abdeckung zu gewährleisten. Die Bibliothek ist in einem ready-to-use lentiviralen Format bei Titer von mindestens 5 x 10 8 TU / ml über p24-Test zur Verfügung gestellt und ist bereits aufgeteilt in zehn Unterpools von ca. 8.000 shRNA Konstrukte jeder. Amplifikation und Sequenzierung Primer sind auch für Downstream-Target-Identifizierung zur Verfügung gestellt. Frühere Studien wurde eine synergistische Antitumor-Aktivität von TRAIL, wenn sie mit Paclitaxel in A549 Zellen, eine humane Lungenkarzinom-Zelllinie 3, 4 kombiniert. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendung von einer gepoolten LentiPlex shRNA Bibliothek schnell führen eine positive Auswahlbildschirm für Gene in die Zytotoxizität o beteiligtf A549-Zellen, wenn sie TRAIL und Paclitaxel ausgesetzt. Eine Hürde oft mit High-Throughput-Screens angetroffen wird die Kosten und Schwierigkeiten in Dekonvolution, wir haben auch ausführlich eine kostengünstige polyklonalen Ansatz mit traditionellen Sequenzierung.

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein intrinsischer zellulärer Mechanismus zur Regulation der Genexpression. Die Nutzung der angeborenen Leistungsfähigkeit dieses Systems ermöglicht es uns, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos besteht darin, die Anwendung einer Ganzgenom-Bibliothek mit kurzen Haarnadel-RNAs oder S-H-R-N-A zur schnellen Durchführung eines positiven Selektionsscreens zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem die Zielzellen mit 10 Teilpools der Mission-Lenti-Plex-Ganzgenom-poolierten S-H-R-N-A-Bibliothek transduziert und anschließend die therapeutische Komponente hinzugefügt wird. Im zweiten Schritt wird das H-RNA-Vorlagenmaterial gewonnen, was die Entmischung des gepoolten Screenings ermöglicht.Die gewonnene S-H-R-N-A wird anschließend in den Vektor kloniert und in kompetente Bakterien transformiert. Danach werden Plasmid-DNA-Proben sequenziert, und die S-H-R-N-A-Ziele werden mithilfe der Lenti-PLX-HRNA-Sequenzsuchdatenbank identifiziert. Die Ergebnisse des in diesem Video durchgeführten Experiments zeigen die Gene auf, die an der Zytotoxizität einer epithelialen Tumorzelllinie beteiligt sind, wenn diese Zellen pharmakologischen Anti-Tumor-Wirkstoffen ausgesetzt werden, basierend auf der Anzahl der Sequenzierungs-Hits. Die Mission.Lin Duplex gepoolt. Die HRNA-Bibliothek enthält das RNAi-Konsortium oder die TRC-Sammlung in 10 Matrixröhren und kann zur schnellen Durchführung von Hochdurchsatz-Studien zum Funktionsverlust von Genen verwendet werden. In dieser Studie wird sie verwendet, um schnell einen positiven Selektionsscreen für Gene durchzuführen, die an der Zytotoxizität von 5 49 Zellen beteiligt sind, wenn diese TRAIL und Paclitaxel ausgesetzt werden, vor der Transduktion der Zielzellen.Besäen Sie die geeignete Anzahl an 60-Millimeter-Dishs mit ausreichend Zellen, um am folgenden Tag etwa 70 % Konfluenz zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C. Die Wachstumsraten variieren je nach Zelltyp und müssen vor Beginn des Screenings bestimmt werden, um die Transduktion der Zellen mit der Mission Lenti plex gepoolten shRNA-Bibliothek vorzubereiten. Tauen Sie die lentiviralen Partikel auf Eis auf, und überführen Sie die aufgetauten Partikel in eine laminare Luftströmungskabine, wobei sie auf Eis gehalten werden sollen, wenn sie nicht sofort verwendet werden.Berechnen Sie, wie viel von jedem einzelnen viralen Subpool zu den Zellen gegeben werden muss, um eine Multiplizität der Infektion oder MOI von eins über alle Zellkulturschalen hinweg zu erreichen. Eine niedrige MOI wird verwendet, um die Wahrscheinlichkeit mehrerer Integrine pro Zelle zu verringern; verdünnen Sie die berechnete Menge Virus in 100 bis 300 Mikroliter komplettem Medium, um eine bessere Verteilung des Virus beim Hinzufügen zur Zellkulturschale sicherzustellen, und entfernen Sie danach das Medium von den vorhergehenden Zellen. Geben Sie komplettes Medium, das Poly-Brain-Lösung enthält, zu jeder Schale hinzu. Fügen Sie die HRNA-Lentiviren-Partikel gemäß dem vorbestimmten experimentellen Design den entsprechenden Petrischalen hinzu. Schwenken Sie die Platten vorsichtig, um das Virus gleichmäßig über die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie 18 bis 20 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre aus 5 % Kohlendioxid.Am nächsten Tag das virushaltige Medium abziehen und frisches, komplettes Medium ohne Polybrain hinzufügen. Die Zellen am vierten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren, anschließend das Medium abziehen und frisches Medium mit der therapeutischen Komponente in einer vorbestimmten optimalen Konzentration hinzufügen. Danach die Zellen für eine vorbestimmte Dauer mit der Komponente behandeln.In dieser Studie werden die Zellen 48 Stunden lang mit 100 Nanogramm pro Milliliter TRAIL und einem Mikromolar Paclitaxel behandelt. Nach der Behandlung sollten die überlebenden Zellen in T-75-Flaschen erneut ausgesät und bis zur nahezu 100 %igen Konfluenz ausgedehnt werden, um eine polyklonale Entmischung durchzuführen. Die heterogene Zellpopulation wird aus jedem Teilpool geerntet und die genomische DNA isoliert.Beginnen Sie das Wiederherstellungsverfahren für die S-H-R-N-A-Vorlage mit der Einrichtung der PCR-Reaktion, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die Amplifikationsprimer mit einer Konzentration von 20 Millimolar sind im Lenti-Plex-Kit enthalten. Bereiten Sie eine positive Kontrolle unter Verwendung des Mission-SHRA-menschlichen-positiven-Kontrollvektors vor, der auf die geeignete Konzentration verdünnt wurde, um als Vorlage zu dienen.Eine erfolgreiche Amplifikation mit dieser Vorlage zeigt an, dass die PCR-Assay-Bestandteile und die Zyklenbedingungen geeignet sind. Speichern Sie das im schriftlichen Protokoll angegebene PCR-Programm im Thermocycler und führen Sie die Target-Amplifikation durch. Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, mischen Sie drei Mikroliter jeder PCR-Reaktion mit einem Mikroliter Farbstoff und führen Sie eine Elektrophorese neben einem 100-Basenpaar-Low-Ladder auf einem 1%-Agarosegel durch, um das Vorhandensein eines 309-Basenpaar-Amplikons zu bestätigen.An diesem Punkt werden die PCR-Amplicons mittels des TOPO-TA-Klonierungs-Kits gemäß Herstellervorschrift in Topo-Klonvektoren eingebaut. Das Ergebnis ist, dass jedes Vektor-Molekül ein einzelnes PCR-Produkt enthält. Sobald die Unterklonierung abgeschlossen ist, isolieren Sie 250 einzelne bakterielle Kolonien, von denen jede ein einzelnes PCR-Amplicon enthält.Züchten Sie die einzelnen Kolonien in zweimilliliter Kulturen, aus denen die Plasmid-DNA mit dem Gen Elute-Plasmid-Mini-Präp-Kit extrahiert werden kann. Nach Verdau der gereinigten Plasmid-DNA mit Eco RI kann das Vorhandensein des Inserts durch Elektrophorese bestätigt werden. Schließlich kann aus den sequenzierten Plasmid-DNA-Proben das S-H-R-N-A-Insert mithilfe der mit der PLX-Bibliothek bereitgestellten Plex-HRNA-Sequenzsuchdatenbank identifiziert werden. Suchen Sie das Eingabefeld auf dem beiliegenden Formular für die S-H-R-N-A-Sequenzsuchzugriffsdatenbank am Anfang der HRNA-Sequenz.Geben Sie die nächsten 10 bis 21 Nukleotide der Abfragesequenz ein. Wählen Sie dann die Art des gepoolten S-H-R-N-A aus. Optional können Sie den Teilpool auswählen, aus dem die Sequenz stammt.Klicken Sie nun auf die Schaltfläche „Potenzielle Treffer finden“, um die Suche durchzuführen. Dadurch sollten die entsprechenden T-R-C-S-H-R-N-A-Sequenzen identifiziert werden, die mit den Sequenzierungsdaten übereinstimmen. Anschließend kann die Website von Sigma-Aldrich, Ihre bevorzugte Gen-Website, verwendet werden, um weitere Informationen zu den identifizierten TR-CS-HRA-Sequenzen und den dazugehörigen Zielgenen zu erhalten. Die identifizierten Zielgene sollten validiert werden, indem der ursprüngliche Screening-Assay mit dem ursprünglichen TRC-Klon sowie mindestens zwei zusätzlichen RNAs, die dasselbe Gen ansprechen, im Verhältnis von einer HRNA pro 60-Millimeter-Schale wiederholt wird.Echte Treffer zeigen das gleiche Phänotyp in der Mehrheit der Schalen. Klone, die den Klonierungsvektor mit einem einzelnen PCR-Fragment enthielten, wurden mittels der SHRA-Vorlagen-Rückgewinnungsprozedur isoliert, und das HRNA-Insert wurde mithilfe der Lenti-Plex-SHRA-Sequenzsuchdatenbank identifiziert. Es wurden 250 Klone sequenziert.Von diesen 25 wurden durch mehrere Klone repräsentiert, während die verbleibenden 225 jeweils nur durch einen einzigen Klon vertreten waren und nicht weiter verfolgt wurden. Wie hier gezeigt, wurden mehrere Kandidatengene, darunter TBX three, PPP two, ca und AKT two, durch mehrere Klone repräsentiert. Der T-Box-Transkriptionsfaktor TBX three trat insgesamt in vier Klonen auf und ist mit Tumormigration in Verbindung gebracht worden.Es wurde gezeigt, dass die Herunterregulation von PPP zwei ca das Wachstum von in androgenfreien Bedingungen kultivierten ln cap-Zellen aufrechterhält, indem sie den durch Androgenentzug verursachten Zellzyklusarrest aufhebt und Apoptose verhindert. Darüber hinaus ist AKT zwei eine Arak Beta Syrian drei Anine-Proteinkinase und ein mutmaßliches Onkogen, von dem nachgewiesen wurde, dass es mehrere Rollen bei der Krebsentwicklung spielt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Mission verwendet.Len Plex gepoolte SH-RNA-Bibliothek, um Hochdurchsatz-Studien zum Funktionsverlust von Genen schnell durchzuführen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

Wir berichten über eine kleine Hairpin RNA (ShRNA) und die nächste Generation Sequencing-basiertes Protokoll zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung in einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene verschmolzen, das Methyl CpG verbindliches Protein 2) MeCP2) gen auf dem x-Chromosom inaktiv.

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

Erfahren Sie, wie Sie mit der MISSION LentiPlex shRNA-Bibliothek ein positives Selektionsscreening in Säugerzellen durchführen. Diese Methode identifiziert Genziele, die das Zellüberleben fördern, und validiert Ergebnisse durch Sequenzierung.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

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