Ändern der Ausrichtung und Orientierung des elektrischen Feldes während elektrische Impulse Anwendung Verbessert Plasmid Gene Transfer In-vitro-
12. September 2011
Gene Transfektion durch Elektroporation etwa zwei Mal wird verbessert, wenn Ausrichtung des elektrischen Feldes während der Puls-Anwendung geändert wird, während die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wird. Der Anstieg in Gentransfektion wird durch die Erhöhung der Membranfläche, die kompetent gemacht für die DNA-Eintritt in die Zelle verursacht wird.
Die Gentransferelektrotransfer ist eine physikalische Methode, bei der Gene durch die Anwendung kurzer und intensiver elektrischer Impulse in Zellen eingebracht werden. Bei einem erfolgreichen Gen-Elektrotransfer sind mehrere Schritte beteiligt: die Bildung eines Komplexes zwischen DNA und Zellmembran, die Translokation der DNA über die poröse Membran, der Transfer der DNA aus dem Cytoplasma in den Zellkern sowie die Genexpression für den Gentransfer mittels Elektroporation. Um eine maximale Gen-Transfektion zu erreichen, werden verschiedene elektrische Impulsprotokolle angewendet.
Eine davon ist die Änderung der Ausrichtung des elektrischen Feldes während der Impulsabgabe. In diesem Video demonstrieren wir den Unterschied in der Effizienz des Gentransfers mittels Elektroporation, wenn alle Impulse in dieselbe Richtung abgegeben werden und wenn die Impulsabgabe durch eine Änderung der Feldausrichtung erfolgt. Die Experimente zur Änderung der elektrischen Feldorientierung wurden an Zellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) durchgeführt.
Folgen Sie diesen Schritten: Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Kulturfläschchen im Inkubator. Bereiten Sie am Tag des Experiments die Zellsuspension mit Trypsin mit 0,25 % Trips in EDTA-Lösung vor, zählen Sie die Zellen, zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie die Zellpellets in ISO-OSM-Miller-Natriumphosphatpuffer auf eine Zelldichte von 5 Millionen Zellen pro Milliliter. Anschließend überführen Sie die Probe in die geeignete Schale; die Zellen werden in einer Pipettenspitze mit integrierten Elektroden, die an einen Hochspannungs-Prototyp-Generator angeschlossen sind, einem elektrischen Feld ausgesetzt.
Mit diesen Elektroden kann ein relativ homogenes elektrisches Feld in verschiedene Richtungen angelegt werden. Die Spitze und der Generator wurden im Labor der Fakultät für Biokybernetik der Fakultät für Elektrotechnik der Universität Luana entwickelt. Fügen Sie das Plasmid E-G-F-P-N1 einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.
Mischen Sie die Zellen gründlich mit der Plasmid-DNA und inkubieren Sie das Gemisch zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur, bevor elektrische Impulse appliziert werden. Aspirieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in die Pipettenspitze mit integrierten Elektroden. In diesem Experiment wird eine Serie von acht rechteckförmigen Impulsen unter Verwendung eines Hochspannungs-Prototyp-Generators angewendet, wobei unterschiedliche elektrische Feldprotokolle im ersten Protokoll verwendet werden.
Alle Pulse werden in dieselbe Richtung appliziert, während beim zweiten Protokoll die Pulse durch Wechsel der elektrischen Feldorientierung appliziert werden. Das zweite Protokoll kann nur mit einem geeigneten Pulsgeber verwendet werden, der die Applikation elektrischer Pulse in unterschiedlichen Richtungen ermöglicht. Unmittelbar nach der Pulsapplikation überführen Sie die Zellen von der Pipettenspitze in eine 6-Loch-Platte und geben fetalen Kälberserum hinzu.
25 % des Probenvolumens; inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie zur Wiederherstellung der Zellmembran zwei Milliliter HAMF 12 zu jeder Probe in einer 6-Loch-Platte hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 im Inkubator. Die Effizienz des Gentransfers durch Elektroporation wird als Prozentsatz der Zellen bestimmt, die 24 Stunden nach der Impulsapplikation GFP exprimieren.
Die Zellen werden mit einem Fluoreszenzmikroskop in der Aufnahmesoftware beobachtet. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer ein und wählen Sie einen geeigneten Bandpassfilter für das grüne Fluoreszenzbild, um die Zellen zu detektieren, die GFP exprimieren. Nehmen Sie mindestens fünf Bilder mit Hellfeldkontrast und grüner Fluoreszenz bei 20-facher Vergrößerung auf.
Die objektive Vergrößerung dient der Zählung der Zellen im Phasenkontrastbild und der Zellen, die GFP im grünen Fluoreszenzbild exprimieren, um den Prozentsatz der Gentransfereffizienz zu bestimmen, indem die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen durch die Gesamtanzahl aller Zellen in jedem entsprechenden Bild dividiert wird. Der Prozentsatz der Zellen, die GFP exprimieren, wenn alle Pulse in dieselbe Richtung gegeben werden, und wenn Pulse durch Wechsel der elektrischen Feldorientierung appliziert werden, wird durch die Änderung der elektrischen Feldorientierung dargestellt. Der Prozentsatz der Zellen, die GFP exprimieren, steigt signifikant an.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Gen-Transfektion mittels Elektroporation und verdeutlicht den Einfluss der Orientierung des elektrischen Feldes auf die Transfektionseffizienz. Die Ergebnisse zeigen, dass die Änderung der Richtung des elektrischen Feldes während der Impulsanwendung die Raten der Gen-Transfektion verdoppeln kann, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gentherapie
- Zellbiologie
- Elektroporationstechniken
Hintergrund
- Die Gen-Elektroden-Übertragung ist eine Methode zur Einführung von Genen in Zellen.
- Sie umfasst die Applikation kurzer, intensiver elektrischer Impulse, um den Eintritt von DNA zu erleichtern.
- Eine erfolgreiche Transfektion erfordert, dass die DNA die Zellmembran überwindet und in den Zellkern gelangt.
- Unterschiedliche Protokolle elektrischer Impulse können die Transfektionseffizienz verbessern.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Einflusses der Orientierung des elektrischen Feldes auf die Effizienz der Gen-Transfektion.
- Untersuchung, ob eine Änderung der Orientierung die Zellviabilität beeinflusst.
- Demonstration des Verfahrens unter Verwendung von CHO-Zellen (Chinese hamster ovary).
Verwendete Methoden
- Anwendung elektrischer Pulse auf CHO-Zellen.
- Vergleich der Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Ausrichtungen des elektrischen Feldes.
- Beurteilung der Zellviabilität nach der Transfektion.
- Analyse des DNA-Eintritts in die Zellen und der anschließenden Genexpression.
Hauptergebnisse
- Die Effizienz der Gen-Transfektion verbesserte sich um etwa das Zweifache durch veränderte Orientierung des elektrischen Feldes.
- Es wurde kein signifikanter Einfluss auf die Zellviabilität beobachtet.
- Ein vergrößerter Membranbereich trug zu einer verbesserten DNA-Aufnahme bei.
- Die Wirksamkeit verschiedener elektrischer Pulsprotokolle wurde nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Die Änderung der Orientierung des elektrischen Feldes während der Impulsanwendung verbessert die Gen-Transfektion erheblich.
- Diese Methode kann optimiert werden, ohne die Zellgesundheit zu beeinträchtigen.
- Weitere Untersuchungen könnten zusätzliche Protokolle zur Verbesserung der Genübertragung erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Optimierung der Ausrichtung des elektrischen Feldes während der Elektroporation verbessert die Effizienz des Plasmid-Gentransfers und bietet eine nicht-virale Strategie zur Steigerung der Transfektionsausbeute in Workflows zur frühen Target-Validierung und Lead-Identifizierung. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er den DNA-Eintrag durch eine erweiterte Membrankompetenz erhöht, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen, wodurch die Vorhersagegenauigkeit in präklinischen Modellen verbessert wird. Die Methode ermöglicht eine reproduzierbare und skalierbare Genübertragung für die Assay-Entwicklung und phänotypische Screening-Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Membranfläche, die für den DNA-Eintrag befähigt ist, verbessert die Transfektionseffizienz und unterstützt die funktionelle Zielvalidierung in Studien zur Expression rekombinanter Proteine.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine konsistente Plasmidübertragung auf Zellpopulationen, wodurch die Variabilität bei der Hypothesenprüfung in frühen Stadien und bei der Aufklärung von Signalwegen verringert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet quantitative, fluoreszenzbasierte Messungen der Genübertragungseffizienz, die mit Plattformen für High-Content-Screenings kompatibel sind.
- Operativer Wert: Standardisiert Elektroporationsparameter mithilfe integrierter Elektrodenspitzen und programmierbarer Impulsgeneratoren und verbessert so die Reproduzierbarkeit von Assays zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die skalierbare Herstellung transfizierter Zelllinien für nachgeschaltete Target-Engagement- und Biomarker-Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Zellviabilität nach der Transfektion und ermöglicht damit Langzeitstudien zur Genexpression und phänotypischen Effekten in krankheitsrelevanten Systemen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Erzeugung stabiler oder transient transfizierter präklinischer Modelle unter Verwendung von CHO-Zellen, einem weit verbreiteten Wirtssystem für die Produktion biologischer Arzneimittel und die Analyse von Signalwegen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein, wobei eine effiziente Genübertragung erforderlich ist, um die Target-Funktion zu bewerten und Signalwege in zellulären Modellen zu modulieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie eine zuverlässige Überexpression oder Herunterregulation von Genen des Interesses in Säugetierzellen ermöglicht.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Transfektionsergebnisse, die den Vergleich genetischer Konstrukte oder regulatorischer Elemente erlauben.
- Analytik: Erzeugt prozentbasierte Effizienzkennzahlen (GFP+ Zellen/Gesamtzahl der Zellen), die statistische Vergleiche zwischen Pulsprotokollen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschlussfähigkeit an die präklinische Forschung, indem sie lebensfähige transfizierte Zellen bereitstellt, die für weitere Validierungen in 3D-Modellen oder Ko-Kultursystemen geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Elektroporationstechnologie dar, die in mehreren Projekten einsetzbar ist, die eine Plasmidabgabe in adhärente oder Suspensionzelllinien erfordern.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen hinsichtlich der Ergebnisse der Genübertragung, indem die Transfektionseffizienz durch biophysikalische Optimierung der Pulsparameter erhöht wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Genübertragungsverfahren durch definierte Pulszüge und Kontrolle der Feldorientierung.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko bei der Target-Validierung, indem eine ausreichende Transgenexpression für die phänotypische Beurteilung sichergestellt wird und falsch-negative Ergebnisse minimiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung genetischer Zielstrukturen basierend auf erreichbaren Expressionsniveaus in zellulären Assays.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Säugetierzellen, der Plasmidpräparation und der Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung der Transfektionseffizienz.
- Setzt den Zugang zu Hochspannungspulsgeneratoren voraus, die programmierbare Änderungen der elektrischen Feldorientierung ermöglichen, sowie kompatible, mit Elektroden ausgestattete Pipettenspitzen.
- Erfordert die Standardisierung der Pulsparameter (Spannung, Dauer, Anzahl) und der Zelldichte über verschiedene Experimente hinweg, um Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
- Beinhaltet die Optimierung des DNA-zu-Zell-Verhältnisses und der Inkubationszeiten, um die Transfektionseffizienz mit der zellulären Belastung in Einklang zu bringen.
- Auf adhärente oder in Suspension wachsende Zelllinien beschränkt, die für die Elektroporation geeignet sind; primäre oder empfindliche Zellen erfordern möglicherweise alternative Transfektionsmethoden.
