Name: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die akute Gewebeschnittpräparation des Vomeronasalorgans bei Mäusen für Calcium-Imaging. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf Pheromonliganden in lebendem Gewebe.

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Wir wollen vor allem Monique Nenniger Tosato für ihre hervorragende technische Unterstützung sowie Jean-Yves Chatton für seine wissenschaftliche Beratung und die Imaging-CIF-Plattform der UNIL für das Mikroskop Ausstattung zu danken. Die Finanzierung wurde von der Swiss National Science Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Dissection der Maus VNO <ol><li> Verwenden erwachsenen Mäusen. Als Pheromon sensing in Multimodalitäten verwickelt ist, ist eine sorgfältige Unterscheidung zwischen Stämmen, Genotypen, Geschlechts und Alters wichtig und werden Ihre Ergebnisse beeinflussen. Hier wählen wir Erwachsenen VG Mäusen 30 zuvor für die Identifizierung einer Pheromon-Rezeptor-Paar (2-Heptanon-V1rb2) 31 (Abb. 1A) verwendet. </li><li> Vor Beginn der Dissektion, bereiten Sie frisches kaltes künstliche Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (ACSF; NaCl 118 mm, NaHCO 3 25 mM, D-Glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) mit oxycarbon (95% O 2 gesättigt: 5% CO 2). Dafür mischen alle ACSF Komponenten außer CaCl 2. Tränken Sie die Lösung direkt durch das Sprudeln es mit oxycarbon. Am Ende fügen Sie die CaCl 2 und stellen Sie mit ddH 2 0 bis die gewünschte Lautstärke. Halten Sie das ACSF-Lösung auf Eis, bis use. </li><li> Euthanasie der Maus sollte vorzugsweise durch Genickbruch oder durch CO 2-Inhalation werden, kurz bevor das Experiment durchgeführt. </li><li> Schneiden Sie die Maus den Kopf. Legen Sie sie unter einem Binokular in kalten ACSF kontinuierlich oxycarbonated. </li><li> Schneiden Sie den Unterkiefer und die Position des Kopfes, um den Gaumen (Abb. 1B) zu visualisieren. </li><li> Machen Sie einen Schnitt horizontal in den oberen Teil des Gaumens (Abb. 1B) mit Mikro-Schere und entfernen Sie den Gaumen Membran mit mikrofeinen Pinzette. Hydrate und reinigen ausgesetzt Hohlraum mit ACSF (Abb. 1C). </li><li> Schneiden Sie den oberen und den unteren Teil der Nasenscheidewand (Abb. 1C). Zart-Extrakt der Nasenscheidewand mit dem VNO und legen Sie es direkt in ACSF auf Eis (Abb. 1D). </li><li> Separate vertikal die beiden Teile des VNO mit Mikro Pinzette und zart entfernen Knorpelkapsel der VNO (Abb.. 1E). Stellen Sie sicher, dass alle die knorpeligen Stücke entfernt werden. </li></ol> 2. VNO Gewebeschnitt Vorbereitung Der VNO Gewebeschnitt Vorbereitung in diesem Abschnitt 2) beschrieben ist vor allem für Kalzium-Imaging Untersuchungen. VNO Scheiben können auch für immunohistostainings auf schwimmenden Scheiben verwendet werden, um die strukturelle Integrität des Gewebes (siehe Abschnitt 3) des Protokolls) zu überprüfen. <ol><li> Bereiten niedrig schmelzenden Agar (3% in Standard-PBS) und Ihrem Arbeitsplatz. Sie werden ACSF, ein Mikrotom und unterstützt, Mikro Pinzette braucht, Einbettformen (22 x 22 x 20 mm), Präzisions-Reinigungstücher, Pinsel, Zellkulturplatten, Cyanacrylat Klebstoff, Eis und ein Thermometer. </li><li> Füllen Sie den Einbettform mit 3% niedrig schmelzenden Agar. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht höher als 41 ° C, bevor Sie vertikal die kurz abgewischt VNO (Abb. 2A) in der Lage sein koronalen Schichten zu erhalten. </li><li> Legen Sie die Einbettform auf Eisfür 1 min bis zur Erstarrung und dann trennen sie von der Agar-Block. Schneiden Sie die Agar-Block in Form einer Pyramide und legen Sie sie mit Kleber auf der Mikrotom-Unterstützung (Abb. 2B). </li><li> Cut koronalen VNO Scheiben mit dem Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / s, einer Amplitude von 0,7 mm und eine Dicke von 100 um in kalten ACSF und sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einer Bürste, bevor Sie sie in einer Gewebekultur Platte mit kaltem gefüllt ACSF. </li><li> Wenn Ihre Scheiben endogene Fluoreszenz wie GFP (in Gen-gezielte Neuronen) enthalten, können Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Abb. 2C) zu wählen. </li></ol> 3. Immunhistochemie auf VNO schwimmende Scheiben Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integrität des VNO Gewebeschnitten in Abschnitt 2) erhaltenen zu überprüfen. Acetyliertes-Tubulin ist ein Mikrotubuli / Zytoskelett-Marker in Dendriten und Mikrovilli der VNO sensorischen Neuronen exprimiert. Für Kalzium-Imaging Experimente, gehen RichtungTLY § 4) des Protokolls. Die immunhistochemischen Methode auf schwimmenden VNO Scheiben kann die Auswertung des Ausdrucks eines Proteins von Interesse angepasst werden. Zu diesem Zweck empfehlen wir Ihnen, fixieren die VNO für 1h bei 4 ° C in einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) nach dem Punkt 1.7) des Protokolls und die Nutzung von diesem Punkt PBS bei pH 7,6 statt ACSF-Lösung. <ol><li> In der Gewebekultur Platte, fixieren Sie Ihre Scheiben Interesse an einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) 1h bei 4 ° C. </li><li> Block Ihrer Gewebeschnitte über Nacht bei 4 ° C in einer PBS-Lösung mit NGS (normal Ziegenserum) 10% und Triton X-100 bei 0,5%. </li><li> Inkubieren Scheiben mit dem primären Antikörper (anti-acetylierte-Tubulin, Maus, 1:2000) für 16h bei Raumtemperatur (RT) in einer PBS-Lösung mit 5% NGS und Triton X-100 bei 0,25%. </li><li> 3 x je 5 Minuten mit einer PBS-Lösung mit NGS 2%. </li><li> Inkubieren im Dunkeln mit dem secondary Antikörper (Cy5-konjugierten Ziege anti-Maus, 1:200) in einer PBS-Lösung mit NGS 2% für 1h bei RT. </li><li> 3 x je 5 Minuten mit PBS, das NGS 2% NGS PBS 1% und PBS nur. </li><li> Befestigen Sie Ihren Scheiben in einem fluoreszierenden Eindeckmittel (enthalten oder nicht DAPI), indem Sie sie in der Mitte der hydrophoben abgegrenzten Zonen (mit einem hydrophoben Stift) und decken die Scheiben mit Deckgläsern. </li><li> Machen Sie Beobachtungen und Akquisitionen mit der konfokalen Mikroskopie und eine Software, mit 3D-Rekonstruktionen (Abb. 2D-F). </li></ol> 4. Kalzium-Imaging auf VNO Scheiben <ol><li> Die folgenden Verfahren findet im Dunkeln statt. Inkubieren VNO Scheiben für 1 Stunde bei 37 ° C in einem Laden Lösung von kalt ACSF mit Fura-2AM (7 uM; Stammlösung von 1 mM in DMSO) komponiert und Pluronic 0,1% (w / v; Stammlösung bei 20% in ddH 2 O). </li><li> Halten Sie die geladenen Scheiben auf Eis mit oxycarbonation bis zur Verwendung. Loaded Scheiben gehalten werden kann für sein3-4h. </li><li> Legen Sie die geladenen Scheiben mit einem Pinsel in einer Perfusionskammer mit ACSF und pflegen die Scheiben mit einem Gewebeschnitt Anker (Abb. 3A). </li><li> Legen Sie die Perfusionskammer auf der Bühne eines Kalzium-Imaging-Mikroskop (Abb. 3B) und kontinuierlich mit oxycarbonated ACSF perfuse bei RT. Die Temperatur kann mit der Verwendung eines bipolaren Temperaturregler angepasst werden. </li><li> Beobachtungen der geladenen VNO Scheiben (Abb. 3C-E) sind mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt, mit einem 25x-oder 63x Objektiv und einem kühlen SNAP-HQ-Kamera. Die Beleuchtung erfolgt sequentiell (340/380 nm) mit einem Polychromator Instrument gemacht und aufgezeichnet mit einer Rate von 5Hz. Gefilterte Emission bei 510 nm durchgeführt. Intrazellulären Calcium-Verhältnis ändert sich (AF = 340 nm/380 nm) werden mit einer entsprechenden Software überwacht. </li><li> Chemostimulation sollten nach Ihren eigenen experimentellen Zweck ausgewählt werden. Hier mit Infusionen von ACSF ein Pheromon mix (Isobutylamin, 2-Heptanon, 4-Heptanon, 2-Heptanol, pentylacetate, Dimethylpyrazin, α / β-Farnesen, 10 -6 M), 2-Heptanon (10 -6 M) oder frisch gesammelten männlichen und weiblichen (1: 1) Maus Urin (1:100) sind 32 durchgeführt. Perfusion von ATP (125 pM) wird als Lebensfähigkeit Test am Ende der Experimente verwendet werden (Abb. 3F) und sollte einen Anteil von etwa 80% lebensfähige Nervenzellen zeigen. Unter diesen Bedingungen können Scheiben bis zu 2 Stunden verwendet werden. </li><li> GFP-markierten Subpopulationen von sensorischen Neuronen werden durch spezielle Beleuchtung (hier die V1rb2 Ausdruck Neuronen) visualisiert und können genau analysiert werden (Abb. 3G-I). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Um einen funktionellen Assay zu etablieren, um die multi duktionswegen statt in der Maus VNO oder neue Pheromon-Rezeptor-Paare identifizieren zu untersuchen, nutzen wir die VG-Maus-Linie (Abb. 1A (Abb. 1E), bereiten wir akute VNO Scheiben (Abb. 2C). Wir fixieren ein Bruchteil von ihnen, um zu überprüfen und zu validieren Gewebs Integrität der Vorbereitung, indem immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen (Abb. 2D-F). Die andere Fraktion der Scheiben ist für Kalzium-Imaging-Experimenten verwendet. Dafür sind Scheiben mit Fura-2 Uhr morgens (Abb. 3C-E) geladen und der intrazellulären Calcium-Ebene der einzelnen Neuron ist als AF-Verhältnis (Abb. 3F) überwacht. Die Lebensfähigkeit der Neuronen wird durch Perfusion von ATP (125 pM), bewertet nach dem schnellen und vorübergehenden Anstieg der AF-Verhältnis zu erwarten ist (Abb. 3F). Urin wird eine wichtige Quelle von Pheromonen, Perfusion von frischenly gesammelt Maus Urin (1:100) wird als eine endogene Kontrolle verwendet. Es löst Kalzium Transienten in etwa 50% der aufgenommenen Neuronen (Zelle 1 und 2, Abb.. 3F). Unter GFP Beleuchtung, sind V1Rb2 positive Neuronen zu beobachten, und die Durchblutung seiner bekannten Pheromone Liganden, 2-Heptanon, initiiert zelluläre Aktivierung (Zelle 1, Abb.. 3I). Interessanterweise sind neuronale Aktivierungen auch in einem Bruchteil der Neuronen, die nicht exprimieren die V1Rb2 Rezeptor (GFP negativen Neuronen) (Zelle 2, Abb.. 3I), was die Komplexität der Pheromon-Codierung im VNO zu beobachten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Dissection der Maus Vomeronasalorgan. (A) Eine Maus aus der VG Linie. (B) Nach der Euthanasie der Maus, ist die vollständige Kopf unter einem Binokular gelegt und der Unterkiefer ist entfernt, um den Gaumen zu visualisieren. Ein kleiner horizontaler Schnitt ist getan(Schwarz gestrichelte Linie). (C) Nach der Entfernung der Gaumen ist der Nasenscheidewand mit dem VNO gesäumt in der oberen geschnitten und der untere Teil (weiß gestrichelte Linien) zu VNO-Extraktion zu erleichtern. (D) Das VNO ist in ACSF-Lösung positioniert und voneinander getrennt (insert: höhere Leistung angesichts der beiden Teile). (E) Die knorpeligen Kapsel des VNO ist fein entfernt, und das VNO ohne Knorpelkapsel ist für den Rest der Experimente verwendet. Scale-Bars sind: BE, 1 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Maus vomeronasalen akuten Scheibe Vorbereitung und Gewebs Integrität. (A) Die Maus VNO ist vertikal in einem Agar-3%-Lösung eingebettet. Die Temperatur des Agar muss kleiner sein als 41 ° C. (B) Die Agar-Block wird in Form einer Pyramide geschnitten und 100 um VNO Abschnitte (schwarz gestrichelte Linie) sind in ACSF generiert. (C) VNO Scheiben können unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop ausgewählt werden, um eine spezifische visualisierenBevölkerung von markierten sensorischen Neuronen. (DF) Gewebs Integrität kann durch immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen, einer höheren Macht angesichts der V1rb2 Gen gezielte Neuronen zeigen die perfekte Konservierung des Präparates ausgewertet werden. Neuronen mit ihren langen Dendriten Erreichen der Oberfläche des Lumens (E) sowie der Ausdruck der strukturellen Protein in den dendritischen Knöpfen und Mikrovilli zu beobachten (F) sein. Scale-Bars sind: B, 5 mm; C, 60 pm, D, 40 um; EF, 20 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Calcium Imaging und Pheromonwahrnehmung in vomeronasalen akuten Gewebeschnitten. (A) Nach einer Fura-2AM Ladephase sind VNO Scheiben in eine Perfusionskammer platziert und mit einer angepassten Anker (high power view) erhalten. (B) Die Experimente werden in den dunklen und VNO Scheiben durchgeführt werden kontinuierlich mit ACSF bei RT perfundierten mit einem Vakuum-System. Die Temperatur kann chos werdenen mit einer Temperatur-Controller-System durch eine bipolare Pelletier-Element und einer thermischen Sonde zusammen. Diese speziellen Experiment wurde bei RT durchgeführt. (CE) VNO Scheiben werden unter Hoffman Phasenkontrast (C, Hv) oder Fura 380 nm Beleuchtung vor (D) und während der neuronalen Aktivierung (E, hier mit ATP) zu beobachten. (F) Neuronale Lebensfähigkeit ist mit Perfusion von ATP (125 pM) ausgewertet. Hier ist chemostimulation mit Urin (Urin, 1:100) oder mit einer Mischung aus Maus Pheromone (mix ph., 10 -6 M) auf einem konstanten Volumenstrom von 165 ml / h. getan Intrazelluläre Calcium-Spiegel (AF) kann individuell für jede Zelle aufgenommen werden (Cell 1 bis 3). (G) A V1Rb2 Neuron visualisiert unter GFP-Beleuchtung (1). (H) Die Belastung dieses Neurons (1) sowie ein nicht-V1rb2 Ausdruck Neuron (2) angezeigt wird. (I) Die V1rb2 Neuron ist in der Lage, auf 2-Heptanon mit einem intrazellulären Calcium-Anstieg reagieren. Dies insbesondere nicht V1rb2 Ausdruck Neuron reagiert auch auf 2-Heptanon (Zelle 2). Scale-Bars sind: CE, 20 mm; GH,15 mu m; AF = 340 nm / 380 nm. (F und I) Dauer des Reizes Anwendung wird durch Balken unter jede Spur angezeigt. Die willkürliche Farbskala repräsentiert die Intensität der Fluoreszenz.

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<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Kalzium-Imaging hier vorgestellte Methode ermöglicht zu erfassen, in einer akuten Scheibe Vorbereitung, die Pheromone Reaktionen der Maus VNO Neuronen. Mit diesem Ansatz ist Dissektion vom Tier auf den vomeronasalen Neuronen, mit etwas Übung leicht zu erreichen und bietet eine lange lebendes Gewebe Vorbereitung. Es ermöglicht zeitaufwendige Experimente wie pharmakologische Untersuchungen oder die Untersuchung der Pheromone Codierung. Mit dieser physiologischen Technik können große Populationen sowie präzise neuronale Subpopulationen gezielt analysiert werden. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf immunhistochemischer Ansätze oder Versuche an anderen Kalzium-Farbstoffen angepasst werden. Der Einsatz dieser kombinierten Methoden wird sicherlich ermöglichen die Identifizierung von neuen Pheromone Liganden für die vielen Waisen Chemorezeptoren in der Maus Vomeronasalorgan ausgedrückt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Adenosin-5&#39;-Triphosphat Dinatriumsalz-Lösung (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Bevorzugt für die Immunhistochemie </td></tr><tr><td> Agar (niedrigschmelzende) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Vorzugsweise für Kalzium-Imaging </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar-Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Vor Licht schützen </td></tr><tr><td> DMSO (Dimethylsulfoxid) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Einbettformen, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescent Eindeckmittel (Vectashield mit DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-2AM </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Vor Licht schützen </td></tr><tr><td> Glisseal N (Vakuum Fett, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Großes Bad Aufzeichnung Kammer (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (Software für Kalzium-Imaging; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonale Anti-Tubulin, acetylierend Maus-Antikörper </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plattform für Kammern (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (Dosierflasche, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line-Lösung Heizer / Kühler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Slice-Anker (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super-PAP PEN (hydrophobenpen) </td><td> Pelco Internationalen </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrierender Klinge Mikrotom VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome hoher Geschwindigkeit Polychromator System </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D-Datenvisualisierung (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal akute gewebeschnitt vorbereitung

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson und Martin Lüscher den Begriff Pheromon zum ersten Mal in 1959 1 gegen Chemikalien für den Intra-Spezies-Kommunikation verwendet zu beschreiben. Pheromone sind flüchtige oder nichtflüchtige kurzlebige Moleküle 2 sezerniert und / oder enthalten in biologischen Flüssigkeiten 3,4, wie Urin, einer Flüssigkeit bekannt, dass eine Hauptquelle der Pheromone 3 sein. Pheromone Kommunikation ist in einer Vielzahl von wichtigen Tier-Modalitäten wie kin Interaktionen 5,6, hierarchischen Organisationen 3 und sexuelle Interaktionen 7,8 verwickelt und sind somit direkt mit dem Überleben einer bestimmten Art 9,10,11 korreliert. Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) 10,12, einem gekoppelten Struktur an der Basis der Nasenhöhle befindet vermittelt, und in eine knorpelige Kapsel. Jeder VNO hat eine Röhrenform mit einem Lumen 13,14 sodass der Kontakt mit den externenchemischen Welt. Die sensorische Neuroepithel besteht im Wesentlichen aus vomeronasalen bipolaren sensorischen Neuronen (VSNs) 15 zusammen. Jeder VSN erstreckt sich eine einzelne Dendriten zum Lumen, in eine große dendritische Knopf trägt bis zu 100 Mikrovilli in chemischen Nachweis 16 verwickelt. Zahlreiche Subpopulationen von VSNs vorhanden sind. Sie werden von den Chemorezeptoren sie ausdrücken, und damit möglicherweise durch den Liganden (n) sie erkennen, 17,18 differenziert. Zwei wesentliche vomeronasalen Rezeptor Familien, V1Rs und V2Rs 19,20,21,22 sind jeweils um 240 23 und 120 24 Mitgliedern zusammen und werden in getrennten Schichten der Neuroepithel ausgedrückt. Olfaktorische Rezeptoren (OR) 25 und formyl Peptid-Rezeptoren (FPRs) 26,27 sind auch in VSNs ausgedrückt. Ob diese neuronalen Subpopulationen verwenden die gleiche Downstream-Signalweg zur Erfassung Pheromone, ist unbekannt. Trotz einer bedeutenden Rolle, die ein Kalzium-permeable Kanal gespielt werden (TrpC2) in den Mikrovilli der reifen Neuronen 28 trpC2 unabhängige Transduktion Kanäle wurden 6,29 vorgeschlagen. Aufgrund der hohen Anzahl von neuronalen Subpopulationen und die besondere Morphologie der Orgel, sind pharmakologische und physiologische Untersuchungen der Signalelemente in der VNO-Komplex. Hier präsentieren wir eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der Maus VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging Untersuchungen. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen in der Natur eines lebenden Gewebes, der allgemeine oder individuelle Subpopulationen von VSNs zuvor mit Fura-2 Uhr, ein Calcium-Farbstoff beladen. Diese Methode wird auch für das Studium keine GFP-markierten Pheromonrezeptor bequem und eignet sich sowohl für die Verwendung von anderen fluoreszierenden Kalzium-Sonden. Als Beispiel verwenden wir hier eine VG Maus line 30, in der die Übersetzung der Pheromon V1rb2 Rezeptor zur Expression von GFP durch eine polycistronischen Strategie verknüpft ist. </p&gt;

Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) vermittelt. Hier ist eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging beschrieben. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen von Subpopulationen und / oder einzelner Neuronen in einem lebenden Gewebe und ist für Rezeptor-Ligand-Identifikation bequem.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson und Martin Lüscher verwendeten den Begriff Pheromon erstmals im Jahr 1959, um Chemikalien zu beschreiben, die für die Kommunikation innerhalb einer Art verwendet werden. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine akute Gewebeschnittpräparation des Riechorgans oder des VNO der Maus herzustellen, um Calcium-Bildgebungsexperimente an Subpopulationen und/oder einzelnen Neuronen in lebendem Gewebe durchführen zu können. Dazu wird zunächst das VNO aus der Nase der Maus entnommen und anschließend unter einem Stereomikroskop in kalter aCSF aus seiner knorpeligen Kapsel mikrochirurgisch freigelegt. Danach wird das isolierte VNO senkrecht in einen Agarblock eingebracht, und akute koronare Gewebeschnitte werden mit einem Mikrotom geschnitten, um die Gewebeintegrität zu überprüfen.Einige Schnitte werden nach der Immunhistochemie unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. Andere Schnitte werden mit einem kalziumsensitiven Farbstoff beladen und anschließend mit vermuteten pheromonalen Liganden perfundiert, wobei die neuronale Aktivierung mittels Kalzium-Bildgebung beobachtet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Geruchsfor­schungsbereich zu klären.Beispielsweise werden Hunderte von Pheromonrezeptoren im Riechnasenorgan exprimiert, aber nur sehr wenige von ihnen haben identifizierte Liganden. Pheromonrezeptoren sind äußerst schwierig in einem heterologen System zu exprimieren. Wir mussten einen effizienten In-vivo-Assay entwickeln, um spezifische Pheromone bestimmten Rezeptoren zuzuordnen.Wir können Tact-Mäuse verwenden, bei denen eine bestimmte Untergruppe von Neuronen unbekannte Rezeptoren exprimiert und anhand der Expression von GFP identifiziert werden kann. Wir könnten diesen Assay auch verwenden, um pharmakologisch Ionenkanäle und Enzyme zu untersuchen, die an der Fairmont-Signaltransduktionskaskade beteiligt sind, wie in der vorliegenden Prozedur gezeigt. Heute führen Julian und Fabian, zwei Forscher aus meinem Labor, den Versuch durch, bevor mit der Dissektion begonnen wird.Bereiten Sie frische, kalte, mit Oxykarb gesättigte künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF) zu, indem Sie alle Zutaten bis auf Calciumchlorid vermengen. Sättigen Sie die Lösung, indem Sie direkt Oxykarb durchperlen lassen. Fügen Sie danach das Calciumchlorid hinzu und stellen Sie mit doppelt destilliertem Wasser das gewünschte Volumen ein.Halten Sie die A-CSF-Lösung bis zur Verwendung auf Eis. Nach der Euthanasie und Enthauptung einer erwachsenen Maus bereiten Sie eine Petrischale mit kaltem und kontinuierlich mit Sauerstoff und Kohlendioxid angereichertem A-CSF vor. Nach Entfernung des Unterkiefers wird der Kopf der Maus in die Petrischale gelegt.Positionieren Sie den Mäusekopf unter dem Stereomikroskop, um das Gaumendach sichtbar zu machen. Führen Sie anschließend mit einer Mikroschere einen horizontalen Schnitt im oberen Teil des Gaumens durch und entfernen Sie die Gaumenmembran mit einer mikrochirurgischen Pinzette. Befeuchten und reinigen Sie die freigelegte Kavität mit ACSF.Schneiden Sie den oberen und unteren Teil des Nasenseptums ab. Entnehmen Sie dann vorsichtig das Nasenseptum, das das VNO enthält, und geben Sie es direkt vertikal in saubere A-CSF. Trennen Sie die beiden Teile des VNO mit feinen Präparationspinzetten. Identifizieren Sie die knorpelige Kapsel des VNO und entfernen Sie diese dann vorsichtig, wobei sichergestellt werden muss, dass alle knorpeligen Stücke entfernt werden. Das isolierte VNO, die knorpeligen Stücke und das nicht dissezierte VNO sind hier zuerst im Jahr angegeben, bereiten Sie 3 % Niedrigschmelz-Agar vor und richten Sie anschließend den Arbeitsplatz mit den notwendigen Werkzeugen ein. Füllen Sie die Einbettform mit Agar und stellen Sie sicher, dass die Temperatur unter 41 Grad Celsius liegt, bevor Sie das dissezierte VNO eintauchen. Positionieren Sie das Gewebe vertikal, um koronare Schnitte zu erhalten.Stellen Sie die Einbettform eine Minute lang auf Eis, bis der Bohrer erstarrt. Nach einer Minute entfernen Sie den Bohrerblock, schneiden das Agar in eine parametale Form und kleben es anschließend mit dem Mikrotom an den Mikrotomschaft. Schneiden Sie koronare VNO-Schnitte am Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Sekunde, einer Amplitude von 0,7 Millimetern und einer Dicke von 100 Mikrometern in kalter Zerebrospinalflüssigkeit (CSF).Sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einem Pinsel und geben Sie sie in eine Gewebekulturplatte, die mit kaltem A-CSF gefüllt ist, um die strukturelle Integrität der gesammelten Gewebeschnitte zu überprüfen. Anschließend können die Schnitte fixiert und für zytoskelettale Komponenten oder andere Proteine von Interesse immungefärbt werden. Hier demonstriert die Immunfärbung gegen acetyliertes Tubulin in Lila die strukturelle Integrität des Gewebeschnitts. Darüber hinaus zeigt die Beobachtung einer spezifischen neuronalen Population, in der ein bestimmter Pheromonrezeptor mit GFP markiert wurde, die erhaltene neuronale Morphologie: Neurone mit kleinen, ovalen Zellkörpern und langen Dendriten, die bis zur Oberfläche des Lumens reichen und mit Mikrovilli enden, können in einem abgedunkelten Raum beobachtet werden.Die VNO-Schnitte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer Beladelösung aus kaltem A-CSF mit sieben Mikromolar URA 2:00 AM und 0,1 % Onic inkubieren. Die beladenen Schnitte bis zur Verwendung auf Eis unter Oxykarbonierung aufbewahren. Mithilfe eines Pinsels die beladenen Schnitte in eine Perfusionskammer mit A-CSF überführen und mit einem Gewebeschnittanker fixieren.Platzieren Sie die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch einer Calcium-Imaging-Anlage und perfundieren Sie kontinuierlich mit oxykarbonatisiertem aCSF bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die beladenen VNO-Schnitte mithilfe der Fluoreszenzwellenlängen, die dem Farbstoff entsprechen, also 340 bis 380 Nanometer für 4O2:00 AM. Nutzen Sie die geeignete Software, um intrazelluläre Calcium-Verhältnisänderungen aufzuzeichnen. Ein Perfusionsystem ist notwendig, um eine chemische Stimulation auszulösen.Hier ist eine koronare Schnittansicht des VNO-Gewebes einer Maus, bei der die Subpopulation von Neuronen, die den Pheromonrezeptor V1Rb2 exprimieren, außerdem GFP exprimiert und gegen das acetylierte Tubulin-Protein (in Lila dargestellt) immunhistochemisch gefärbt wurde. Vergrößerte Aufnahmen des Schnitts zeigen die Erhaltung der Gewebeintegrität. Neurone mit langen Dendriten reichen bis zur Oberfläche des Lumens, und die Expression des Strukturproteins ist in den dendritischen Knöpfchen und Mikrovilli für die Kalzium-Bildgebung sichtbar.Mit FU beladene Gewebeschnitte werden zunächst mithilfe von Hoffman-Phasenkontrast visualisiert, um das interessierende Feld ausgehend vom Blutgefäß, dem ersten weißen Pfeil, zu lokalisieren; der Beobachter bewegt sich langsam in Richtung des Lumens, des zweiten weißen Pfeils, und der neuroepithelialen Region. Der ovale Zellkörper des RO-Nasenneurons. Der dritte weiße Pfeil ist an seinem langen, dünnen Dendrit erkennbar.Der vierte weiße Pfeil reicht in das Lumen, den neuronalen dendritischen Knopf. Der fünfte weiße Pfeil zeigt Mikrovilli, die mit Pheromonen beladenen Zellen berühren; hier gezeigt bei drei 80 Nanometern, anschließend nacheinander bei drei 40 und drei 80 Nanometern beleuchtet, und dieses Verhältnis der fluoreszierenden Wellenlängen wird als Graph dargestellt, der den intrazellulären Kalziumänderungen in den ausgewählten Neuronen entspricht, schwarze, rote und blaue Kreise. Ein TP wird verwendet, um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu bestimmen.Beachten Sie die Bandbreite der Kalziumantworten, die über die drei ausgewählten Neuronen hinweg zu beobachten ist, sowie die Tatsache, dass Neuron Nummer zwei (roter Kreis) nicht auf einen TP reagiert und daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen wird. Die chemische Stimulation wird anschließend unter Verwendung von Urin und einer Mischung aus Mauspheromonen in der Tiefe des Gewebeschnitts durchgeführt. Eine Teilpopulation von Neuronen, die sowohl GFP als auch den V1RRB2-Rezeptor exprimieren, kann lokalisiert werden.Hier ist eine Neuron, das sowohl GFP als auch den V1RB2-Rezeptor exprimiert, zusammen mit einem Neuron, das V1RB2 nicht exprimiert, dargestellt. Beide Zellen sind mit URA 2:00 AM beladen, und das V1RB2-exprimierende Neuron zeigt einen Kalzium-Spitzenanstieg als Reaktion auf die Perfusion des Liganden des Rezeptors, 2-Heptanon. Interessanterweise reagiert auch das Neuron, das V1RB2 nicht exprimiert, auf 2-Heptanon, was die Komplexität der Pheromonverarbeitung im VNO verdeutlicht.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Maus präpariert und das mar-Zellorgan mikrodisziert, um die Vorbereitung akuter Gewebeschnitte durchzuführen. Dieses Protokoll kann auch für physiologische Untersuchungen unter Verwendung alternativer Kalziumfarbstoffe und Mikroskopaufbauten angepasst werden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Multielektroden Array (MEA)-Aufnahmen stellen eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Aktivität des großen Populationen von Neuronen. Hier präsentieren wir die Details eines MEA Vorbereitung auf die von der Maus vomeronasalen Epithel aufzeichnen, während gleichzeitig die Förderung der Gewebe.

Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt Intraspezies chemischen Signalen, die sozialen und reproduktiven Informationen zu vermitteln. Wir haben Ca2 +-Imaging durchgeführt Experimente mit transgenen Mäusen, die G-camp2 in VNO Gewebe. Dieser Ansatz erlaubt es uns, die komplizierten Reaktionsmuster des vomeronasalen Neuronen eine große Anzahl von Pheromon-Stimuli zu analysieren.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

Dieses Video zeigt die Isolierung eines vomeronasalen Organs (VNO) der Maus und die Gewebevorbereitung für den Vibratogrammschnitt. Sektionen werden verwendet, um die biophysikalischen und physiologischen Eigenschaften einer bestimmten Gruppe von sensorischen Neuronen zu charakterisieren.

Vorbereitung des Vomeronasalorgans der Maus für die Vibratom-Schnittung

Dieses Video zeigt die elektrophysiologische Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs) bei Mäusen mit einer perforierten Patch-Clamp-Technik. Das olfaktorische Epithel, das OSNs mit Fluorophor-markierten Geruchsrezeptoren enthält, wird von einer Maus isoliert und in einer Aufzeichnungskammer gesichert. Eine Aufzeichnungspipette wird an den dendritischen Knopf eines OSN geklemmt, und Nystatin in der Pipette perforiert die Membran, um eine elektrische Verbindung mit der Zelle...

Perforierte Patch-Clamp-Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen bei Mäusen

Das Protokollvideo beschreibt die Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von den sensorischen Neuronen des vomeronasalen Organs (VNO) in Mäusen. Ein koronaler VNO-Schnitt mit fluoreszenzmarkierten sensorischen Neuronen wird in einem Aufnahmeaufbau platziert. Ein markiertes Neuron wird mit einer Aufzeichnungspipette in einer Ganzzellkonfiguration gepflastert, um die elektrophysiologische Aufzeichnung als Reaktion auf chemische Reize zu ermöglichen.

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von vomeronasalen sensorischen Neuronen

Eine effektive Methode, um Manuelle Zerlege Intact Maus Nasengewebe mit erhaltener Anatomische Organisation vorbereiten

Die Maus akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) ist schwierig gewesen, im Rahmen der sensorischen Kodierung zu studieren. Hier zeigen wir eine Dissektion, die eine Ex-vivo-Vorbereitung, in der AOB Neuronen funktionell bleiben, um ihre angeschlossenen Peripherieeingänge, die Erleichterung der Forschung in der Informationsverarbeitung von Maus Pheromone und Kairomonen produziert.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Hier beschreiben wir einen physiologischen Ansatz, der die Identifizierung und eingehende Analyse einer definierten Population von sensorischen Neuronen in akuten koronalen Gewebeschnitten des vomeronasalen Organs der Maus unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ermöglicht.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

Dieser Artikel bietet ein optimiertes Protokoll für die Dissektion und Dissoziation von murinem Geruchsepithel zum Zwecke der Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Schnelle Dissektion und Dissoziation des olfaktorischen Epithels der Maus für Einzelkernsuspensionen

Lernen Sie die akute Gewebeschnittpräparation des Vomeronasalorgans bei Mäusen für Calcium-Imaging. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf Pheromonliganden in lebendem Gewebe.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

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