Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine akute Gewebeschnittpräparation des Riechorgans (RO) oder des Vomeronasalorgans (VNO) der Maus herzustellen, um an Subpopulationen oder einzelnen Neuronen in lebendem Gewebe Kalzium-Bildgebungsexperimente durchführen zu können. Dazu wird zunächst das VNO aus der Nase der Maus entnommen und anschließend unter einem Stereomikroskop in kalter aCSF von seiner knorpeligen Kapsel mikrochirurgisch freigelegt. Danach wird das isolierte VNO senkrecht in einen Agarblock eingebettet, und akute koronare Gewebeschnitte werden mit einem Mikrotom geschnitten, um die Gewebeintegrität zu überprüfen.

Einige Schnitte werden nach der Immunhistochemie unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. Andere Schnitte werden mit einem kalziumsensitiven Farbstoff beladen und anschließend mit vermuteten pheromonalen Liganden perfundiert, wobei die neuronale Aktivierung mittels Kalzium-Bildgebung beobachtet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Geruchsforschungsbereich zu klären.

Beispielsweise werden Hunderte von Pheromonrezeptoren im Riechnasenorgan exprimiert, aber nur sehr wenige von ihnen haben identifizierte Liganden. Pheromonrezeptoren sind äußerst schwierig in einem heterologen System zu exprimieren. Wir mussten einen effizienten In-vivo-Assay entwickeln, um spezifische Pheromone bestimmten Rezeptoren zuzuordnen.

Wir können Tact-Mäuse verwenden, bei denen eine spezifische Untergruppe von Neuronen unbekannte Rezeptoren exprimiert und anhand der Expression von GFP identifiziert werden kann. Wir könnten diesen Assay auch verwenden, um pharmakologisch Ionenkanäle und Enzyme zu untersuchen, die an der Fairmont-Signaltransduktionskaskade beteiligt sind, wie in der vorliegenden Prozedur gezeigt. Heute führen Julian und Fabian, zwei Forscher aus meinem Labor, den Versuch durch, bevor mit der Dissektion begonnen wird.

Bereiten Sie frische, kalte, mit Oxykarb gesättigte künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF) zu, indem Sie alle Zutaten bis auf Calciumchlorid vermengen. Sättigen Sie die Lösung, indem Sie direkt Oxykarb durchperlen lassen. Fügen Sie anschließend das Calciumchlorid hinzu und stellen Sie mit doppelt destilliertem Wasser das gewünschte Volumen ein.

Halten Sie die A-CSF-Lösung bis zur Verwendung auf Eis. Nach der Euthanasie und Enthauptung einer erwachsenen Maus bereiten Sie eine Petrischale mit kaltem und kontinuierlich mit Sauerstoff und Kohlendioxid angereichertem A-CSF vor. Nach Entfernung des Unterkiefers wird der Kopf der Maus in die Petrischale gelegt.

Positionieren Sie den Mäusekopf unter dem Stereomikroskop, um das Gaumendach sichtbar zu machen. Führen Sie anschließend mit einer Mikroschere einen horizontalen Schnitt im oberen Teil des Gaumens durch und entfernen Sie die Gaumenmembran mit einer mikrochirurgischen Pinzette. Befeuchten und reinigen Sie die freigelegte Kavität mit ACSF.

Schneiden Sie den oberen und unteren Teil des Nasenseptums ab. Entfernen Sie dann vorsichtig das Nasenseptum, das das VNO enthält, und legen Sie es direkt senkrecht in saubere A-Hirn-Rückenmarksflüssigkeit. Trennen Sie die beiden Teile des VNO mit einer mikrochirurgischen Pinzette.

Identifizieren Sie die knorpelige Kapsel des VNO und entfernen Sie diese dann vorsichtig, wobei sichergestellt werden muss, dass alle knorpeligen Stücke entfernt werden. Das isolierte VNO, die knorpeligen Stücke und das nicht dissezierte VNO sind hier im ersten Jahr angegeben, bereiten Sie zunächst 3 % Niedrigschmelz-Agar vor und richten Sie dann den Arbeitsplatz mit den notwendigen Werkzeugen ein. Füllen Sie die Einbettform mit Agar und stellen Sie sicher, dass die Temperatur unter 41 Grad Celsius liegt, bevor Sie das dissezierte VNO eintauchen. Positionieren Sie das Gewebe vertikal, um koronale Schnitte zu erhalten.

Stellen Sie die Einbettform eine Minute lang auf Eis, bis der Bohrer erstarrt. Nach einer Minute entfernen Sie den Bohrerblock, schneiden das Agar in eine parametale Form und kleben es anschließend mit dem Mikrotom auf den Mikrotomschaft. Schneiden Sie koronale VNO-Schnitte am Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Sekunde, einer Amplitude von 0,7 Millimetern und einer Dicke von 100 Mikrometern in kalter Zerebrospinalflüssigkeit (CSF).

Sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einem Pinsel und legen Sie sie in eine Gewebekulturplatte, die mit kaltem A-CSF gefüllt ist, um die strukturelle Integrität der gesammelten Gewebeschnitte zu überprüfen; diese können anschließend fixiert und für zytoskelettale Komponenten oder andere Proteine von Interesse immungefärbt werden. Hier demonstriert die Immunfärbung gegen acetyliertes Tubulin in Lila die strukturelle Integrität des Gewebeschnitts. Darüber hinaus zeigt die Beobachtung einer spezifischen neuronalen Population, in der ein bestimmter Pheromonrezeptor mit GFP markiert wurde, die erhaltene neuronale Morphologie: Neurone mit kleinen ovalen Zellkörpern und langen Dendriten, die bis zur Oberfläche des Lumens reichen und mit Mikrovilli enden, können in einem abgedunkelten Raum beobachtet werden.

Inkubieren Sie VNO-Schnitte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer Beladelösung aus kaltem A-CSF mit sieben Mikromolar URA 2:00 AM und 0,1 % Onic. Bewahren Sie die beladenen Schnitte bis zur Verwendung auf Eis unter Oxykarbonierung auf. Verwenden Sie einen Pinsel, um die beladenen Schnitte in eine Perfusionskammer mit A-CSF zu legen, und sichern Sie die Schnitte mit einem Gewebeschnittanker.

Platzieren Sie die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch einer Calcium-Imaging-Anlage und perfundieren Sie kontinuierlich mit oxykarbonatisiertem aCSF bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die beladenen VNO-Schnitte mithilfe der Fluoreszenzwellenlängen, die dem Farbstoff entsprechen, also 340 bis 380 Nanometer für 4-O-2:00 AM. Verwenden Sie geeignete Software, um intrazelluläre Calcium-Verhältnisänderungen aufzuzeichnen. Ein Perfusionsystem ist notwendig, um eine chemische Stimulation auszulösen.

Hier ist eine koronare Schnittpräparation des VNO-Gewebes einer Maus dargestellt, bei der die Teilpopulation von Neuronen, die den Pheromonrezeptor V1Rb2 exprimieren, zusätzlich GFP exprimiert und mittels Immunfärbung gegen das acetylierte Tubulin-Protein (in Lila dargestellt) nachgewiesen wurde. Aufnahmen mit höherer Vergrößerung zeigen die Erhaltung der Gewebeintegrität. Neurone mit langen Dendriten reichen bis zur Oberfläche des Lumens, und die Expression des Strukturproteins ist in den dendritischen Knöpfchen und Mikrovilli für die Kalzium-Bildgebung sichtbar.

Mit FU beladene Gewebeschnitte werden zunächst mithilfe von Hoffman-Phasenkontrast visualisiert, um das interessierende Feld ausgehend vom Blutgefäß, dem ersten weißen Pfeil, zu lokalisieren; der Beobachter bewegt sich langsam in Richtung Lumen, dem zweiten weißen Pfeil, und der neuroepithelialen Region. Der ovale Zellkörper des RO-Nasenneurons. Der dritte weiße Pfeil kann anhand seines langen und dünnen Dendrits identifiziert werden.

Der vierte weiße Pfeil reicht in das Lumen, den neuronalen dendritischen Knopf. Der fünfte weiße Pfeil zeigt Mikrovilli, die mit Pheromonen beladenen Zellen berühren; hier gezeigt bei drei 80 Nanometern, werden nacheinander bei drei 40 und drei 80 Nanometern beleuchtet, und dieses Verhältnis der Fluoreszenzwellenlängen wird als Graph dargestellt, der den intrazellulären Kalziumänderungen in den ausgewählten Neuronen entspricht, schwarze, rote und blaue Kreise. Ein TP wird verwendet, um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu bestimmen.

Beachten Sie die Bandbreite der Kalziumantworten, die über die drei ausgewählten Neuronen hinweg zu beobachten ist, sowie die Tatsache, dass Neuron Nummer zwei (roter Kreis) nicht auf einen TP reagiert und daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen wird. Anschließend erfolgt die chemische Stimulation unter Verwendung von Urin und einer Mischung aus Mauspheromonen, wobei in die Tiefe des Gewebeschnitts geschaut wird. Eine Teilpopulation von Neuronen, die sowohl GFP als auch den V1RRB2-Rezeptor exprimieren, kann lokalisiert werden.

Hier ist eine Neuron, das sowohl GFP als auch den V1RB2-Rezeptor exprimiert, zusammen mit einem Neuron ohne V1RB2-Expression dargestellt. Beide Zellen sind mit URA 2:00 AM beladen, und das V1RB2-exprimierende Neuron zeigt einen Kalziumschaub in Reaktion auf die Perfusionsgabe des Liganden des Rezeptors, 2-heptanon. Interessanterweise reagiert auch das Neuron ohne V1RB2-Expression auf 2-Heptanon, was die Komplexität der Pheromonverarbeitung im VNO demonstriert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Maus präpariert und mikrodisseziert, um das Mar-Zellorgan zu gewinnen und akute Gewebeschnitte herzustellen. Dieses Protokoll kann auch für physiologische Untersuchungen unter Verwendung alternativer Kalziumfarbstoffe und Mikroskopaufbauten angepasst werden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.