Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mittels des DOT-Scan-Antikörper-Mikroarrays eine molekulare Profilierung der Oberflächenantigene in kolorektalem Krebsgewebe durchzuführen. Zusätzlich wird eine fluoreszenzbasierte Multiplextechnik eingesetzt, um Zelltypen mit spezifischen Profilen innerhalb der gemischten Population zu unterscheiden. Cluster-of-Differentiation- oder CD-Antigene wurden als potenzielle prognostische oder metastasierende Biomarker beim kolorektalen Karzinom identifiziert.

Diese Antigene eignen sich ideal als Biomarker, da sich ihre Expression häufig im Verlauf des Tumorwachstums oder durch Interaktion mit anderen Zelltypen verändert. In diesem Video verwenden wir das DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray, um lebende Zellen über exprimierte Oberflächenantigene zu erfassen. Das DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray besteht aus einem Objektträger mit einer Schicht aus Nitrocellulose.

Das DOT-Scan-Antikörper-Microray-Panel ist durch Alignierungspunkte markiert, die aus CD 29 und CD 44 bestehen. Auf jeder Seite des Arrays befinden sich zudem doppelte Arrays. Das erste Panel besteht aus den ursprünglichen 82 Antikörpern des DOT-Scan-Leukämie-Microarrays; zusätzlich wurden 40 weitere Antikörper basierend auf ihrem prognostischen Potenzial für das kolorektale Krebs-Satelliten-Microarray ausgewählt.

Und das letzte Panel besteht aus Isotyp-Kontrollantikörpern. Hier werden Gewebe von kolorektalem Karzinom und normale Darmmukosa verdaut und filtriert, um eine lebensfähige Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Suspension kann eingefroren oder später verwendet werden.

Die Zellsuspension wird für die Zellfangung auf einem DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray verwendet, wobei Antigene, die auf verschiedenen Zellsubtypen exprimiert werden, durch fluoreszenzbasierte Multiplexanalyse charakterisiert werden. Die resultierenden Expressionsprofile zeigen eine signifikante Veränderung der Antigenexpression zwischen den kolorektalen Krebszellen und der normalen Darmschleimhaut. Dieser Unterschied spiegelt sich ebenfalls in der tumorassoziierten Leukozytenpopulation wider.

Die hierarchische Clusterung mehrerer Tumorprofile zeigt eine Gruppierung der Krankheitssignaturen mit den Stadien des kolorektalen Karzinoms. Hallo, ich bin Jerry von der School of Molecular Bioscience an der University of Sydney in Australien, und heute zeige ich Ihnen ein Experiment zur Profilierung von Oberflächenantigenen im Gewebe des kolorektalen Karzinoms. Mithilfe eines Dot-Scan-Antikörper-Mikroarrays und fluoreszenzbasierter Multiplextechnik ermöglichen Dot-Scan-Mikroarrays die Profilierung von etwa 140 Oberflächenantigenen an lebenden Krebszellen zusammen mit den assoziierten entzündlichen Leukozyten.

Zellsubpopulationen, die auf Mikroarrays erfasst werden, können mithilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper unterschieden werden, die an ein stark exprimiertes markantes Antigen auf den betreffenden Zellen binden. Mithilfe geeigneter Fluoreszenzmarkierungen an Antikörpern mit drei verschiedenen Spezifitäten können bis zu drei verschiedene Zellsubpopulationen auf einem einzelnen Mikroarray charakterisiert werden. Der DOT-Scan-Mikroarray-Assay ist eine vergleichsweise einfache Methode und wurde bereits für die Oberflächenprofilerstellung mehrerer Krebsarten verwendet.

Ein wesentliches Merkmal des DOT-Scans ist seine Fähigkeit, lebende Zellen über ihre Oberflächenantigene zu erfassen, sodass das erhaltene Bindungsmuster einen Abdruck des Oberflächenprofils der Zelle darstellt. Oberflächenantigene spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung und Metastasierung sowie bei der entzündlichen Reaktion zur Bekämpfung des Krebses. Umfangreiche Oberflächenprofile oder Immunophänotypen können als Krankheitssignaturen zur Verbesserung der Krebsklassifizierung verwendet werden, was eine optimale Therapie nach der Operation ermöglicht.

Okay, beginnen wir. In dem hier gezeigten Experiment werden klinische Tumorproben des kolorektalen Karzinoms der Grade A bis D in Hank-Puffer gesammelt. Zunächst wird das Tumor gewissehaft mit zwei Skalpellen in einen Millimeter dünne Scheiben geschnitten.

Geben Sie die Schnitte in eine 2 %ige Kollagenase-Typ-vier-Lösung und eine 10 %ige DNA-Lösung zur Verdauung. Abschnitte der normalen Darmschleimhaut desselben Patienten werden 10 Zentimeter entfernt von der primären Tumorstelle gesammelt. Dies dient als Kontrolle und wird identisch mit der Tumorprobe verarbeitet.

Der Tumor wird eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius verdaut, um den Abbau des Bindegewebes zu fördern, die D ns beseitigen DNA aus beschädigten Zellen. Nach der Inkubation wird die Gewebesuspension durch ein Drahtsieb filtriert, wobei Hanks-Puffer über die Probe gegeben wird, während ein Kolben einer 10-ml-Spritze verwendet wird, um die Zellen durch das Sieb zu drücken. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt, bis die meisten Zellen das Drahtsieb passiert haben.

Der Filter trennt die Zellen von unverdautem Bindegewebe. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension erneut, indem Sie sie mit einer 10-M-Spritze aufnehmen und durch einen Filtrationsfilter mit 200 Mikrometer Porengröße und danach durch einen Filtrationsfilter mit 50 Mikrometer Porengröße leiten. Diese feineren Filter sorgen dafür, dass überschüssiger Schleim oder DNA entfernt werden und Zellaggregate aufgebrochen werden, um eine vitale Einzelzellsuspension zu erhalten.

Dieselbe Behandlung wird auch für die normale Mukosa durchgeführt. Wir stellten fest, dass die normale Mukosa tendenziell mehr Bindegewebe enthält und daher etwas mehr Waschschritte erfordert, um sie durch ein Netz zu filtrieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 410 × g für fünf Minuten bei 20 °C. Zur Vorbereitung der Kaltlagerung suspendieren wir das Zellpellet in 750 µL Fötales Rinderserum, gefolgt von äquimolaren Volumina fötalem Rinderserum mit DMS.

So-Lösung bei diesem DMS. So-Lösung tropfenweise unter ständigem Mischen zugeben, das Überstand in ein Kryoröhrchen aliquotieren und in einem Isolierbehälter aufbewahren. Diese Proben können bis zu einem Jahr bei minus 80 gelagert werden.

Die Isolierung und DMSO sollten sicherstellen, dass die Zellen langsam gefrieren, ohne zu platzen. Eine Nebenwirkung der Lagerung ist die Lyse der roten Blutkörperchenpopulation. Zum Glück benötigen wir diese nicht.

Für das Experiment die Proben aus der Lagerung nehmen und schnell entsorgen. Die Zellsuspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius in 10 ml Hank's-Puffer resuspendieren; der Puffer sollte helfen, das 10 % DMSO und das fetale Kälberserum zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 410 ×g und 20 Grad Celsius.

Anschließend das Überstand abgießen und in 500 Mikroliter Hank’s Puffer resuspendieren; einige Zellen können während des Einfrier- und Auftauvorgangs beschädigt werden, wodurch DNA in die Suspension freigesetzt wird. Um dieses Problem zu beheben, inkubieren Sie die Probe mit 0,1 % DNase bei Raumtemperatur. Währenddessen kann eine Bestimmung der Zellviabilität durchgeführt werden.

Mischen Sie gleiche Mengen Triam-Blau mit 10 Mikroliter Zellsuspension und pipettieren Sie 10 Mikroliter der Mischung in einen Zellzähler. Unter dem Mikroskop erscheinen gesunde und lebensfähige Zellen durchsichtig. Dagegen erscheinen nicht lebensfähige Zellen mit beschädigten Membranen blau.

Für die Zellaufnahme auf dem DOT-Scan-Antikörper werden mindestens 4 Millionen lebensfähige Zellen benötigt. MICRORAY fällt aus. Die DNA-Behandlung spülte die Zellen ein zweites Mal mit 10 ml Hank’s-Puffer und zentrifugierte bei 410 ×g für fünf Minuten bei 20 °C.

Wir suspendieren die endgültige Zellprobe in 200 Mikrolitern RPMI-Medium. Dieses Medium enthält im Vergleich zum Hanks-Puffer relativ mehr Nährstoffe und dient der Förderung der Zellbindung an das Antikörper-Microarray, während die Zellviabilität erhalten bleibt. Das Antikörper-Microarray für die kolorektale Krebs-Dot-Scan-Analyse besteht aus 140 verschiedenen Antikörper-Dots, die auf Nitrocellulose dupliziert sind.

Jeder Punkt auf dem Array enthält 10 Nanoliter eines monoklonalen Antikörpers gegen das Oberflächenantigen der Zelle. Zum Vorbereiten des Antikörper-Microarrays wird dieses in eine Schale mit PBS getaucht, um die Nitrocellulose anzufeuchten, und der Glasrand des Arrays wird abgewischt. Unter Verwendung von Kim-Tüchern wird darauf geachtet, den Nitrocellulose-Bereich nicht zu berühren, und das Microarray wird in eine Schale gelegt, bevor die Zellsuspension mittels Pipette auf die Nitrocellulose aufgebracht wird.

Eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension stellt sicher, dass alle Antikörper die Möglichkeit haben, Zellen zu binden. Inkubieren Sie das Mikroarray eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation sedimentieren verschiedene Zellen und kommen mit den Antikörpern auf den Array-Zellen in Kontakt.

Die Präsentation von Oberflächenantigenen, die dem Antikörper entsprechen, führt nach der Inkubation zur Bindung und Erfassung der Zelle. Waschen Sie die nicht gebundenen Zellen vorsichtig aus, indem Sie die Arrays in drei Wechseln frischer PPS eintauchen. Fixieren Sie die gebundenen Zellen in einer 10%-igen Lösung aus äußerer Höhe und PPS-Lösung.

Pipettieren Sie vorsichtig eine ausreichende Menge Fixierlösung, um den Nitrozyllulose-Abschnitt abzudecken. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Mikroarrays anschließend dreimal in frische PBS-Lösung ein.

Lassen Sie die Arrays bei jeder Wäsche 30 Sekunden in PBS einweichen, da überschüssige voner-Höhe die Fluoreszenz-Multiplexanalyse stören kann. Wir können jetzt überprüfen, ob eine Zellbindung vorliegt, indem wir ein Mikroarray unter Licht halten, um eine genauere Analyse durchzuführen. Der DOT-Scan-Scanner und die Analyse-Software ermöglichen es uns, das Bindungsmuster zu scannen und quantifizierte Ergebnisse der Antigenexpression in einer gemischten Zellpopulation zu erzeugen.

Die Software vergleicht die Intensität der Zellbindung mit dem Hintergrundrauschen anhand einer achtbitigen Graustufen-Skala. Die Intensitätseinheiten werden auf einen Maximalwert von 256 normalisiert. Zur Vereinfachung des Vergleichs zwischen einem Array wird jede positive Bindung des Eis-Kontrolltyps von Antikörpern mit den entsprechenden IG-Isoformen abgezogen.

Geben Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer auf das Microarray und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Für die Vorbereitung der Fluoreszenz-Multiplexierung geben Sie in 118 Mikroliter Blockierpuffer 10 Mikroliter feurig markiertes und konjugiertes CD drei sowie 20 Mikroliter mit Alexa konjugiertes Epam. Zusätzlich werden zwei Mikroliter hitzeinaktiviertes Serum zur Mischung gegeben, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Nach Abschluss der Blockierung wird der Blockierpuffer durch Multiplex-Lösung ersetzt und 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubation binden die mit CD3 konjugierten Antikörper an CD3-exprimierende T-Zellen, die an das Array gebunden sind, während der mit EPAM konjugierte Antikörper an epitheliale Zellen oder kolorektale Krebszellen auf dem Array bindet. Danach spülen Sie das Mikroarray dreimal mit frischer PBS, lassen es im Dunkeln trocknen und scannen es anschließend auf Fluoreszenz.

Die Fluoreszenz wird mit einem Typhoon FLA 9.000 Scanner erfasst. Das FICO-Ery-Profil wird mit einem 523 Nanometer Laser und einem 580 BP 30 Emissionsfilter erfasst. Alexa 647 wird mit einem 633 Nanometer Laser und einem 670 BP 30 Emissionsfilter erfasst. Die resultierenden Fluoreszenzbilder werden für die Analyse in das TIF-Format konvertiert.

Mithilfe einer DOT-Scan-Software. Die fluoreszenzbasierte Multiplexierung ermöglicht es uns, die Antigenprofile verschiedener Zellpopulationen innerhalb derselben Gewebeprobe zu unterscheiden. Die hier gezeigten Bilder stammen von einer Probe eines kolorektalen Karzinoms.

Diese drei Bilder zeigen einen optischen Scan, einen fluoreszierenden Scan für CD3-exprimierende Zellen und einen fluoreszierenden Scan für EPAM-exprimierende Zellen. Die Ergebnisse aus dem DOT-Scan-Microray sollten konsistente Zellbindungs­muster zwischen den beiden duplizierten Objektträgern aufweisen. Starke Bindung an den Ausrichtungspunkten entlang der Kante des Objektträgers weist darauf hin, dass ausreichende Mengen an Zellen erfasst wurden.

Ein PDF-Bericht kann erstellt werden, um quantitative Werte für die Zellbindung anzugeben. Die Balkengrafik-Darstellung der Zellbindung zeigt einen Unterschied in der Antigenexpression zwischen normalem Mucosa- und Tumorprobe.

Die optischen Ergebnisse geben eine Gesamtdarstellung der Antigenexpression in allen Zelltypen innerhalb der Probe; die AAM-Multiplexergebnisse zeigen ein deutlicheres Bild der Unterschiede in der Antigenexpression zwischen normalen epithelialen Zellen und Krebszellen. Obwohl viele der unterschiedlich exprimierten Antigene als Gruppe bekannte Biomarker für Darmkrebs sind, liefern sie insgesamt eine weitaus genauere Krankheitssignatur für die Stratifikation, als es ein einzelner Biomarker jemals erreichen könnte. Die CD3-Multiplexergebnisse zeigen mehr T-Zellen in der Krebsprobe im Vergleich zur Normalprobe.

Häufig exprimieren die T-Zellen bei Krebserkrankungen Aktivierungsmarker, was die Möglichkeit nahelegt, dass es sich bei diesen T-Zellen um tumorinfiltrierende Lymphozyten oder mit Entzündungen assoziierte T-Zellen handelt. Eine umfassende Analyse kann mit dem Multi-Experiment-Viewer Version 4.4, einer Open-Source-Software für Heatmaps und Datenanalyse, durchgeführt werden. Die hierarchische Clusterung von Proben des kolorektalen Karzinoms kann genutzt werden, um Zusammenhänge mit dem Krankheitsstadium oder der Patientenprognose aufzuzeigen.

Eine umfangreiche Bibliothek von Krankheitssignaturen ist ein wertvolles Hilfsmittel bei der Prognoseeinschätzung bei Patienten mit Darmkrebs oder bei der Bestimmung des Verlaufs der postoperativen Therapie. Wir haben soeben das Verfahren zur Profilierung der Oberflächenantigenexpression in einer gemischten Zellpopulation im Darmkrebsgewebe mithilfe des DOT-Scan-Antikörper-Mikroarrays und der fluoreszenzbasierten Multiplexanalyse vorgestellt. Ein wichtiger Aspekt dieses Experiments, an den man denken sollte, ist, stets frisches Gewebe zu verwenden und mindestens 4 Millionen vitale Zellen für die Durchführung dieses Experiments bereitzustellen. Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.