Name: Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 17 s
Description: Lernen Sie die Profilierung von Oberflächenantigenen in Darmkrebsgewebe mit dem DOT-Scan-Antikörper-Microarray und Fluoreszenz-Multiplexing. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern und Zellunterpopulationen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Mitarbeiter am Anatomischen Pathologie Laboratories des Royal Prince Alfred und Concord Rückführung Krankenhäuser zum Sammeln frischer Proben von CRC und normalen Darmschleimhaut. Die Arbeit wurde durch einen Cancer Institute New South Wales Translational-Zuschüssen finanziert.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Arbeitsablauf für die Herstellung einer Suspension von lebenden Zellen aus einem chirurgischen Stichprobe von CRC. 1. Klinische Probe Disaggregation Alle Proben wurden von der Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australien) und Concord Rückführung Hospital (Concord West, NSW, Australien) mit Einwilligung im Rahmen des Protokolls Nr. X08-164 gesammelt. <ol><li> Sammeln Sie frische Kolorektalkarzinom (CRC) oder Adenom Proben und normalen Darmschleimhaut mindestens 10 cm aus dem Tumor. Shop-Proben in balanced salt Hank-Lösung pH 7,3 (HBSS) bei 4 ° C für bis zu 12 h nach der Resektion. </li><li> Follow Sicherheitsvorschriften für den menschlichen Krankheitserreger, verarbeiten alle klinischen Proben in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II. Präparieren Sie die Proben in 2 mm Würfel in einer Petrischale mit zwei Skalpellklingen. </li><li> Inkubieren Tumor-und Normalgewebe in separaten Eppendorf-Röhrchen mit gelegentlichen vorsichtig mischen und 60 min bei 37 ° C mit dem gleichen Volumen RPMI 1640-Medium mit 2% (v / v) Kollagenase Typ 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) und 0,1 % (w / v) Desoxyribonuclease I aus Rinder-pancrease (DNAse I; Sigma-Aldrich). </li><li> Force-Gewebe durch ein feines Drahtgeflecht Sieb mit einem Kolben aus einer 10 ml-Spritze halb verdaute; waschen Sie die Zellen durch mit HBSS. </li><li> Pass resultierende Zellsuspension bis 200 um und 50 um Filcon Filter (BD Biosciences), um Zellaggregate zu entfernen. Die meisten der DNA, Schleim und Zell-Aggregate sind in dieser Reihe von Filtrationen entfernt. </li><li> Centrifuge Zellsuspensionen bei 400 xg bei 20 ° für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zellpellets in hitzeinaktiviertem FCS mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), langsam einfrieren in Kryoröhrchen und bei -80 °. Das Einfrieren Prozess neigt dazu, Schleim in der Probe zu reduzieren und Lyse roter Blutkörperchen. </li></ol> 2. Probenvorbereitung für die Zelle zu erfassen <ol><li> Auftauen Proben schnell in einem 37 ° Wasserbad und die Zellen in 10 ml HBSS zum Auswaschen der DMSO. </li><li> Centrifuge Zellsuspensionen bei 410 xg bei 20 ° für 5 min. </li><li> Den Überstand und Zellpellet in 500 ul HBSS. </li><li> Behandeln Sie die Probe mit 0,1% (w / v) DNAse I für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Mix 10 ul jeder Zellsuspension mit dem gleichen Volumen Trypanblau und Last 10 ul der Mischung in einer Zählkammer. Mit einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung, count lebensfähigen Zellen, die deutlich durch Trypanblau-Ausschluss erscheinen, während tote Zellen nehmen den Farbstoff. Ein mindestens 4 x 10 6 lebensfähige Zellen ist für die Zelle zu erfassen auf dem Mikroarray erforderlich. </li><li> Nach DNAse Behandlung, resuspendieren die Zellsuspension in 10 mL HBSS und Zentrifuge bei 410 xg bei 20 ° für 5 min. </li><li> Dekantieren der Überstände und resuspendieren Zellpellets in RPMI 1640 auf ein Volumen von 200 ul. </li></ol> 3. Antikörper Microarray-Zelle zu erfassen <ol><li> Feuchten Sie die DotScan Antikörper Microarray durch Eintauchen der Nitrozellulose Abschnitt in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für etwa 20 s. Wischen Sie die Glaskanten des Mikroarrays mit gefalteten Kimwipes, Vermeidung Berühren Sie die Nitrozellulose Abschnitt. </li><li> Wasser hinzu, bis die Microarray Inkubationswanne um eine feuchte Kammer stellen. Setzen Sie den Microarray in die Kammer und Pipette wurde die Zellsuspension in RPMI 1640 auf die feuchte Nitrocellulose Abschnitt. Pipette Tropfen an jeder Ecke der Nitrocellulose, um sicherzustellen, eine noch von Zellen verteilt. </li><li> Inkubieren Sie die Microarrays bei 37 ° C für 1 h. Die Inkubationszeit kann Zellen, sich niederzulassen und in Kontakt kommen mit Antikörpern auf dem Microarray. Zellen, die Oberflächen-Antigene entsprechend der Antikörper landen sie auf aufgenommen wird. </li><li> Nach der Inkubation, tauchen die Microarrays sanft und vertikal in drei Tröge mit mindestens 15 mL PBS abwaschen ungebundenen Zellen (20 s pro Waschgang). </li><li> Bereiten Sie 3,7% (w / v) Formaldehyd in PBS zu den Zellen und Antikörper durch Vernetzung zu beheben. Gently Pipette etwa 1 mL der Nitrozellulose Abschnitt des Microarray-Abdeckung. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Next dip-Microarrays in 3 Änderungen der PBS (15 ml, 30 s pro Stück) zum Auswaschen überschüssigen Formaldehyd. </li><li> Wischen Sie die Kanten-und Rückseite der Glasplatte mit Kimwipes und scannen Sie die Microarray mit dem DotScan Scanner Zeit wird die Nitrocellulose Abschnitt feucht. Die optische Abtastung bietet das Antigen Expressionsmuster einer gemischten Zellpopulation zB CRC-Zellen, Leukozyten und andere Stromazellen des Tumors. </li></ol> 4. Fluoreszenz-Multiplexing <ol><li> Entfernen Sie die Microarray vom Scanner und anwenden 200 ul Blocking-Puffer (2% w / v BSA, 2% hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum, PBS, pH 7,3). Inkubieren es in der Microarray-Fach bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Bereiten Sie die multiplexing Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen mit Alufolie abgedeckt: 20 ul Phycoerythrin-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australien, # IM12824; 1/7.5 Endverdünnung), 10 ul Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA; 1 / 15 Verdünnung), 2 ul der hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australien) und 118 ul Blocking-Puffer. </li><li> Ablassen über Blockierungspuffer aus dem Mikroarray und Pipette das Multiplexing-Lösung auf die Nitrozellulose Abschnitt Verbreitung gleichmäßig. Inkubieren für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li><li> Tauchen Sie den Microarray vertikal in drei Mulden von 15 ml frischem PBS; (30 s pro Stück). </li><li> Lassen Sie die Microarrays trocken im Dunkeln und bei 4 ° C in einer Diashow angezeigt. Die Microarray kann in der Dunkelheit für bis zu 3 Monaten ohne Verlust der Fluoreszenz gespeichert. </li><li> Scan der trockenen Mikroarray mit einem Typhoon FLA 9000 Scanner (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australien) mit einer Auflösung von 50 (532 nm Laser, 580 BP30 Emissionsfilter für PE. 633 nm-Laser und 670 BP30-Emission-Filter für Alexa 647). Die Mikroarrays werden mit der Nitrozellulose-Seite nach unten auf das Glas Scanner Fach gescannt. </li><li> Speichern Sie die fluoreszierende Bilder im TIFF-Dateien und mit Photoshop gesetzt Bildgröße 17 x 25 cm und eine Auflösung von 72 Pixel / cm. Importieren Sie die Grafik in das DotScan Analyse-Software, um die Intensität von Punkten zu analysieren. </li><li> Die DotReader fängt ein digitales Bild des Punktes Bindungsmuster und quantifiziert die Dichte der Zelle bindet jeder Antikörper Punkt auf einem 8-Bit Grau Skala (1-256 U). Gelegentliche unspezifische Isotyp-Kontroll-Bindung wurde die Bindung von Werten für Antikörper mit entsprechenden Immunglobulin-Isotypen abgezogen. Dot Fluoreszenzintensitäten für jeden Microarray wurden gegen den hellsten Punkt bei 100% Intensität normalisiert. Signal / spot Stärke wurde in einem. Xml-Datei (Rohdaten) aufgezeichnet oder dargestellt als Balkendiagramm in einer. Pdf-Datei (Abschlussbericht) </li><li> Microarray heatsmaps und hierarchische Clustering wurden mit MultiExperiment Viewer (MeV) Version 4.4 aus dem TM4 Microarray Software Suite ( <a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a> ). Hierarchical Clustering wurde am Hintergrund bereinigte Daten mit MeV mit komplettem Linkage-Analyse durchgeführt. Euklidische Distanz wurde für Ähnlichkeitsmaß verwendet. Die 2-tailed Student-t-Test mit gleicher Varianz wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ergebnisse aus dem DotScan Microarray soll zeigen konsistente Zelle Bindungsmuster zwischen doppelten Arrays. Starke Ausrichtung dot Bindung (CD44/CD29) ermöglicht ein Raster über das Array platziert werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine optimale Zell-Abscheidung und-Multiplexing. Abbildung 3 zeigt einige häufig auftretende Probleme während der Zellteilung erfassen und die möglichen Lösungen begegnet. Die Microarray-Zell-Bindung Ergebnisse können durch die Messung dot Intensitäten auf einem grauen Skala von 1 bis 256 ausgedrückt quantifiziert werden. Abbildung 4 zeigt numerische Daten aus 58 chirurgischen CRC-Proben, mit EpCAM-Alexa 647 Antikörper gefärbt, als Heatmap mit hierarchischen Clustering. Auch wenn die Anzahl der Proben ist beschränkt, meist CRCs der gleichen Bühne, um die Cluster in der gleichen Gruppe. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Zellbindung Muster der klinischen Darmkrebs Tumor (Australian Clinic-pathologische Staging, ACP Bühne B1). (A) DotScan Antikörper Schlüssel mit Standorten der Antikörper für die linke Hälfte der doppelten Microarray (umrissen). Der obere Abschnitt enthält den ursprünglichen 82-Antikörpern aus dem DotScan Leukämie-Mikroarray. Eine weitere 40-Antikörper, entsprechend spezifische Oberflächenantigene festgestellt, dass in der Literatur hoch reguliert, wurden als CRC "Satelliten" Microarray aufgenommen. Der untere Teil besteht aus Isotypkontrolle Antikörper (b) Optische Aufnahme CRC-Zellen die Bindung an den Microarray. (C) CD3 Abbildungsfunktion T-Zellen. (D) EpCAM Abbildungsfunktion CRC-Zellen. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Beispiele für schlechte DotScan Ergebnisse und mögliche Lösungen. (A) Niedrige Zellbindung; Lösung: Vergewissern Sie sich mindestens 4x106 lebensfähige Zellen sind auf dem Array (b) Isotypkontrolle verbindlich und unspezifische Zellbindung; Lösung: add hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum zur Probe vor der Inkubation auf Mikroarray zu minimieren Isotypkontrolle bindend. Gelegentlich tritt eine kleine Menge an nicht-spezifische Bindung von Zellen an die Nitrozellulose nicht mit CRC-Proben und keinen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse. (C) Nitrocellulose Austrocknen während der Inkubation; Lösung: Sicherstellung der Probe deckt den gesamten Bereich Nitrocellulose und Microarray wird auf eine flache Oberfläche inkubiert. (D) High Hintergrund Artefakte; Lösung: Sicherstellung derMicroarray wird gründlich nach Inkubation gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. DotScan Analyse-Software generierten Balkendiagramme darstellen Zellbindung Dichten auf einem grauen Skala von 1 bis 256. Die Zahlen auf der Achse beziehen sich auf CD-Antigene. Andere Abkürzungen werden TCR, T-Zell-Rezeptor, κ, λ, Immunglobulin leichten Ketten; sIg, Oberflächen-Immunglobulin, DCC, in der Darmkrebs-Protein gestrichen EGFR, epidermal growth factor receptor, FAP, Fibroblasten-Aktivierungs-Protein, HLA-A, B, C HLA-DR, humane Leukozyten-Antigene DR und A, B, C nicht überschreiten; MICA, MHC-Klasse-I-Kette-related protein A; MMP-14, Matrix Metallopeptidase 14; pIgR, polymere Immunglobulin Rezeptor; TSP-1, Thrombospondin-1; Mabthera, humanisierter Anti-CD20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

<ol><li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Technol.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).</li>
<li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement%3A+adjuvant+therapy+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Canc.+Inst%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979(2001).</li>
<li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22IARC+WHO+Classification+of+Tumours%22%5BJournal%5D)">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).</li>
<li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Med.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li>
<li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184(2006).</li>
<li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147(2003).</li>
<li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li>
<li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791(2006).</li>
<li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99(2000).</li>
<li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+for+cDNA+microarray+data%3A+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15(2002).</li>
<li>Al Saeed,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMA%3A+A+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video zeigen wir, wie das DotScan Antikörper Microarray in einer einfachen, semi-quantitative Weg, um Oberflächen-Antigen-Profile für Zellpopulationen aus CRC Gewebe Studie verwendet werden kann. Die Erteilung einer tragfähigen Einzel Zellsuspension aus Gewebe ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, weil die Energie-abhängige Prozesse (zB, Antigen Begrenzung und / oder Pseudopodien-Bildung), für feste Bindung von ganzen Zellen zu Antikörper Punkte während der Inkubation er...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens oder Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Hanks &#39;balanced salt solution </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Buffered mit 25 mM Hepes (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Klingen </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Packung mit 100 Stück </td></tr><tr><td> RPMI 1640 mit 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo Spritze (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> MS +10 L </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> Filcon Filter (200 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon Filter (50 um) </td><td> Filcon Filter (50 um) </td><td> Filcon Filter (50 um) Filcon Filter (50 um) 340603 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Lichtmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovial Rohre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo Einfrieren contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan Antikörper Microarray-Kit </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> DotScan Microarray Waschküvette </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Heat-inaktivierten AB-Serum 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin-konjugierten CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647-konjugierten EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm-Laser, 580 BP30 Emissionsfilter für PE. 633 nm-Laser und 670 BP30 Emissionsfilter für Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment-Viewer v4.4 </td><td> TM4 Microarray Software Suite </td><td> Open - Source-Software (Ref 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

darmkrebs zelloberflächenprotein profiling mit einem antikörper microarray und fluoreszenz multiplexing

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Die aktuelle Prognose und Klassifikation von CRC basiert auf Staging-Systeme, die histopathologischen und klinischen Befunden zu integrieren. Doch in der Mehrzahl der CRC Fällen ist Zelldysfunktion das Ergebnis zahlreicher Mutationen, die Protein-Expression und posttranslationale Modifikation 1 ändern. Eine Reihe von Zell-Oberflächen-Antigene, einschließlich Cluster der Differenzierung (CD)-Antigene wurden als potenzielle prognostische oder metastasiertem Biomarker in CRC identifiziert worden. Diese Antigene bilden ideale Biomarker als ihren Ausdruck oft ändert sich mit Tumorprogression oder Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, wie zB Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) und Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM). Die Verwendung von Immunhistochemie (IHC) für Krebs sub-Klassifikation und Prognose ist gut für einige Tumorarten 2,3 etabliert. Es wurde jedoch keine einzige &quot;Marker&quot; prognostische Signifikanz gezeigt größer als klinisch-pathologischen Staging-oder gewonnen breite Akzeptanz für den Einsatz in der Routine-Pathologie Meldung aller CRC Fällen. Ein neuerer Ansatz, um prognostische Stratifizierung Krankheitsphänotypen setzt auf Oberflächenprotein Profile mit mehreren &quot;Marker&quot;. Während Expression Profiling von Tumoren mit Proteom-Techniken wie iTRAQ ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entdeckung der biomarkers4, ist es nicht optimal für den routinemäßigen Einsatz in diagnostischen Laboratorien und kann nicht unterscheiden, verschiedene Zelltypen in eine gemischte Bevölkerung. Darüber hinaus werden große Mengen von Tumorgewebe für die Profilierung des gereinigten Plasmamembran Glykoproteine ​​durch diese Methoden erforderlich. In diesem Video haben wir beschrieben, eine einfache Methode zur Oberfläche Proteom-Profiling von lebensfähigen Zellen aus aufgeschlüsselte CRC-Proben mit einem DotScan CRC Antikörper Microarray. Die 122-Antikörper Microarray besteht aus einem Standard-82-Antikörper Region die Anerkennung einer Reihe von Lineage-spezifische Leukozyten-Marker, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren und Marker der Entzündung und Immunantwort 5, zusammen mit einem Satelliten-Region für den Nachweis von 40 potentiell prognostischer Marker für CRC . Die Zellen sind nur auf Antikörper, für die sie ausdrücken, das entsprechende Antigen erfasst. Die Zelldichte pro Punkt, durch optische Abtastung ermittelt, spiegelt der Anteil der Zellen, die das Antigen, das Niveau der Expression des Antigens und der Affinität des Antikörpers 6. Für CRC Gewebe oder normalen Darmschleimhaut, spiegeln optische Scans der Immunphänotyp von gemischten Populationen von Zellen. Fluoreszenz-Multiplexing können dann verwendet werden, um ausgewählte Sub-Populationen von Zellen von Interesse auf dem Array erfasst Profil. Zum Beispiel, Alexa 647-anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM, CD326) ist ein pan-epitheliales Differenzierungsantigen, die zur CRC-Zellen und auch Epithelzellen der normalen Darmschleimhaut erkennen war, während Phycoerythrin-anti-CD3, wurde verwendet, zu erkennen infiltrierenden T-Zellen 7. Das DotScan CRC Microarray sollte der Prototyp für eine diagnostische Alternative zu den anatomisch-basierte CRC Staging-System sein.

Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

Die aktuelle Prognose und Klassifizierung des kolorektalen Karzinoms (CRC) stützt sich auf Staging-Systeme, die histopathologische und klinische Befunde integrieren. In der Mehrheit jedoch ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mittels des DOT-Scan-Antikörper-Mikroarrays eine molekulare Profilierung der Oberflächenantigene in kolorektalem Krebsgewebe durchzuführen. Zusätzlich wird eine fluoreszenzbasierte Multiplextechnik eingesetzt, um Zelltypen mit spezifischen Profilen innerhalb der gemischten Population zu unterscheiden. Cluster-of-Differentiation- oder CD-Antigene wurden als potenzielle prognostische oder metastasierende Biomarker beim kolorektalen Karzinom identifiziert.Diese Antigene eignen sich ideal als Biomarker, da sich ihre Expression häufig im Verlauf des Tumorwachstums oder durch Interaktion mit anderen Zelltypen verändert. In diesem Video verwenden wir das DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray, um lebende Zellen über exprimierte Oberflächenantigene zu erfassen. Das DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray besteht aus einem Objektträger mit einer Schicht aus Nitrocellulose.Das DOT-Scan-Antikörper-Microray-Panel ist durch Alignierungspunkte markiert, die aus CD 29 und CD 44 bestehen. Auf jeder Seite des Arrays befinden sich zudem doppelte Arrays. Das erste Panel besteht aus den ursprünglichen 82 Antikörpern des DOT-Scan-Leukämie-Microarrays; zusätzlich wurden 40 weitere Antikörper basierend auf ihrem prognostischen Potenzial für das kolorektale Krebs-Satelliten-Microarray ausgewählt.Und das letzte Panel besteht aus Isotyp-Kontrollantikörpern. Hier werden Gewebe von kolorektalem Karzinom und normale Darmmukosa verdaut und filtriert, um eine lebensfähige Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Suspension kann eingefroren oder später verwendet werden.Die Zellsuspension wird für die Zellfangung auf einem DOT-Scan-Antikörper-Mikroarray verwendet, wobei Antigene, die auf verschiedenen Zellsubtypen exprimiert werden, durch fluoreszenzbasierte Multiplexanalyse charakterisiert werden. Die resultierenden Expressionsprofile zeigen eine signifikante Veränderung der Antigenexpression zwischen den kolorektalen Krebszellen und der normalen Darmschleimhaut. Dieser Unterschied spiegelt sich ebenfalls in der tumorassoziierten Leukozytenpopulation wider.Die hierarchische Clusterung mehrerer Tumorprofile zeigt eine Gruppierung der Krankheitssignaturen mit den Stadien des kolorektalen Karzinoms. Hallo, ich bin Jerry von der School of Molecular Bioscience an der University of Sydney in Australien, und heute zeige ich Ihnen ein Experiment zur Profilierung von Oberflächenantigenen im Gewebe des kolorektalen Karzinoms. Mithilfe eines Dot-Scan-Antikörper-Mikroarrays und fluoreszenzbasierter Multiplextechnik ermöglichen Dot-Scan-Mikroarrays die Profilierung von etwa 140 Oberflächenantigenen an lebenden Krebszellen zusammen mit den assoziierten entzündlichen Leukozyten.Zellsubpopulationen, die auf Mikroarrays erfasst werden, können mithilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper unterschieden werden, die an ein stark exprimiertes markantes Antigen auf den betreffenden Zellen binden. Mithilfe geeigneter Fluoreszenzmarkierungen an Antikörpern mit drei verschiedenen Spezifitäten können bis zu drei verschiedene Zellsubpopulationen auf einem einzelnen Mikroarray charakterisiert werden. Der DOT-Scan-Mikroarray-Assay ist eine vergleichsweise einfache Methode und wurde bereits für die Oberflächenprofilerstellung mehrerer Krebsarten verwendet.Ein wesentliches Merkmal des DOT-Scans ist seine Fähigkeit, lebende Zellen über ihre Oberflächenantigene zu erfassen, sodass das erhaltene Bindungsmuster einen Abdruck des Oberflächenprofils der Zelle darstellt. Oberflächenantigene spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung und Metastasierung sowie bei der entzündlichen Reaktion zur Bekämpfung des Krebses. Umfangreiche Oberflächenprofile oder Immunophänotypen können als Krankheitssignaturen zur Verbesserung der Krebsklassifizierung verwendet werden, was eine optimale Therapie nach der Operation ermöglicht.Okay, beginnen wir. In dem hier gezeigten Experiment werden klinische Tumorproben des kolorektalen Karzinoms der Grade A bis D in Hank-Puffer gesammelt. Zunächst wird das Tumor gewissehaft mit zwei Skalpellen in einen Millimeter dünne Scheiben geschnitten.Geben Sie die Schnitte in eine 2 %ige Kollagenase-Typ-vier-Lösung und eine 10 %ige DNA-Lösung zur Verdauung. Abschnitte der normalen Darmschleimhaut desselben Patienten werden 10 Zentimeter entfernt von der primären Tumorstelle gesammelt. Dies dient als Kontrolle und wird identisch mit der Tumorprobe verarbeitet.Der Tumor wird eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius verdaut, um den Abbau des Bindegewebes zu fördern, die D ns beseitigen DNA aus beschädigten Zellen. Nach der Inkubation wird die Gewebesuspension durch ein Drahtsieb filtriert, wobei Hanks-Puffer über die Probe gegeben wird, während ein Kolben einer 10-ml-Spritze verwendet wird, um die Zellen durch das Sieb zu drücken. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt, bis die meisten Zellen das Drahtsieb passiert haben.Der Filter trennt die Zellen von unverdautem Bindegewebe. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension erneut, indem Sie sie mit einer 10-M-Spritze aufnehmen und durch einen Filtrationsfilter mit 200 Mikrometer Porengröße und danach durch einen Filtrationsfilter mit 50 Mikrometer Porengröße leiten. Diese feineren Filter sorgen dafür, dass überschüssiger Schleim oder DNA entfernt werden und Zellaggregate aufgebrochen werden, um eine vitale Einzelzellsuspension zu erhalten.Dieselbe Behandlung wird auch für die normale Mukosa durchgeführt. Wir stellten fest, dass die normale Mukosa tendenziell mehr Bindegewebe enthält und daher etwas mehr Waschschritte erfordert, um sie durch ein Netz zu filtrieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 410 × g für fünf Minuten bei 20 °C. Zur Vorbereitung der Kaltlagerung suspendieren wir das Zellpellet in 750 µL Fötales Rinderserum, gefolgt von äquimolaren Volumina fötalem Rinderserum mit DMS.So-Lösung bei diesem DMS. So-Lösung tropfenweise unter ständigem Mischen zugeben, das Überstand in ein Kryoröhrchen aliquotieren und in einem Isolierbehälter aufbewahren. Diese Proben können bis zu einem Jahr bei minus 80 gelagert werden.Die Isolierung und DMSO sollten sicherstellen, dass die Zellen langsam gefrieren, ohne zu platzen. Eine Nebenwirkung der Lagerung ist die Lyse der roten Blutkörperchenpopulation. Zum Glück benötigen wir diese nicht.Für das Experiment die Proben aus der Lagerung nehmen und schnell entsorgen. Die Zellsuspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius in 10 ml Hank's-Puffer resuspendieren; der Puffer sollte helfen, das 10 % DMSO und das fetale Kälberserum zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 410 ×g und 20 Grad Celsius.Anschließend das Überstand abgießen und in 500 Mikroliter Hank’s Puffer resuspendieren; einige Zellen können während des Einfrier- und Auftauvorgangs beschädigt werden, wodurch DNA in die Suspension freigesetzt wird. Um dieses Problem zu beheben, inkubieren Sie die Probe mit 0,1 % DNase bei Raumtemperatur. Währenddessen kann eine Bestimmung der Zellviabilität durchgeführt werden.Mischen Sie gleiche Mengen Triam-Blau mit 10 Mikroliter Zellsuspension und pipettieren Sie 10 Mikroliter der Mischung in einen Zellzähler. Unter dem Mikroskop erscheinen gesunde und lebensfähige Zellen durchsichtig. Dagegen erscheinen nicht lebensfähige Zellen mit beschädigten Membranen blau. Für die Zellaufnahme auf dem DOT-Scan-Antikörper werden mindestens 4 Millionen lebensfähige Zellen benötigt. MICRORAY fällt aus. Die DNA-Behandlung spülte die Zellen ein zweites Mal mit 10 ml Hank’s-Puffer und zentrifugierte bei 410 ×g für fünf Minuten bei 20 °C.Wir suspendieren die endgültige Zellprobe in 200 Mikrolitern RPMI-Medium. Dieses Medium enthält im Vergleich zum Hanks-Puffer relativ mehr Nährstoffe und dient der Förderung der Zellbindung an das Antikörper-Microarray, während die Zellviabilität erhalten bleibt. Das Antikörper-Microarray für die kolorektale Krebs-Dot-Scan-Analyse besteht aus 140 verschiedenen Antikörper-Dots, die auf Nitrocellulose dupliziert sind.Jeder Punkt auf dem Array enthält 10 Nanoliter eines monoklonalen Antikörpers gegen das Oberflächenantigen der Zelle. Zum Vorbereiten des Antikörper-Microarrays wird dieses in eine Schale mit PBS getaucht, um die Nitrocellulose anzufeuchten, und der Glasrand des Arrays wird abgewischt. Unter Verwendung von Kim-Tüchern wird darauf geachtet, den Nitrocellulose-Bereich nicht zu berühren, und das Microarray wird in eine Schale gelegt, bevor die Zellsuspension mittels Pipette auf die Nitrocellulose aufgebracht wird.Eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension stellt sicher, dass alle Antikörper die Möglichkeit haben, Zellen zu binden. Inkubieren Sie das Mikroarray eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation sedimentieren verschiedene Zellen und kommen mit den Antikörpern auf den Array-Zellen in Kontakt.Die Präsentation von Oberflächenantigenen, die dem Antikörper entsprechen, führt nach der Inkubation zur Bindung und Erfassung der Zelle. Waschen Sie die nicht gebundenen Zellen vorsichtig aus, indem Sie die Arrays in drei Wechseln frischer PPS eintauchen. Fixieren Sie die gebundenen Zellen in einer 10%-igen Lösung aus äußerer Höhe und PPS-Lösung.Pipettieren Sie vorsichtig eine ausreichende Menge Fixierlösung, um den Nitrozyllulose-Abschnitt abzudecken. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Mikroarrays anschließend dreimal in frische PBS-Lösung ein.Lassen Sie die Arrays bei jeder Wäsche 30 Sekunden in PBS einweichen, da überschüssige voner-Höhe die Fluoreszenz-Multiplexanalyse stören kann. Wir können jetzt überprüfen, ob eine Zellbindung vorliegt, indem wir ein Mikroarray unter Licht halten, um eine genauere Analyse durchzuführen. Der DOT-Scan-Scanner und die Analyse-Software ermöglichen es uns, das Bindungsmuster zu scannen und quantifizierte Ergebnisse der Antigenexpression in einer gemischten Zellpopulation zu erzeugen.Die Software vergleicht die Intensität der Zellbindung mit dem Hintergrundrauschen anhand einer achtbitigen Graustufen-Skala. Die Intensitätseinheiten werden auf einen Maximalwert von 256 normalisiert. Zur Vereinfachung des Vergleichs zwischen einem Array wird jede positive Bindung des Eis-Kontrolltyps von Antikörpern mit den entsprechenden IG-Isoformen abgezogen.Geben Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer auf das Microarray und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Für die Vorbereitung der Fluoreszenz-Multiplexierung geben Sie in 118 Mikroliter Blockierpuffer 10 Mikroliter feurig markiertes und konjugiertes CD drei sowie 20 Mikroliter mit Alexa konjugiertes Epam. Zusätzlich werden zwei Mikroliter hitzeinaktiviertes Serum zur Mischung gegeben, um unspezifische Bindungen zu verhindern.Nach Abschluss der Blockierung wird der Blockierpuffer durch Multiplex-L&ouml;sung ersetzt und 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. W&auml;hrend dieser Inkubation binden die mit CD3 konjugierten Antik&ouml;rper an CD3-exprimierende T-Zellen, die an das Array gebunden sind, w&auml;hrend der mit EPAM konjugierte Antik&ouml;rper an epitheliale Zellen oder kolorektale Krebszellen auf dem Array bindet. Danach sp&uuml;len Sie das Mikroarray dreimal mit frischer PBS, lassen es im Dunkeln trocknen und scannen es anschlie&szlig;end auf Fluoreszenz.Die Fluoreszenz wird mit einem Typhoon FLA 9.000 Scanner erfasst. Das FICO-Ery-Profil wird mit einem 523 Nanometer Laser und einem 580 BP 30 Emissionsfilter erfasst. Alexa 647 wird mit einem 633 Nanometer Laser und einem 670 BP 30 Emissionsfilter erfasst. Die resultierenden Fluoreszenzbilder werden für die Analyse in das TIF-Format konvertiert.Mithilfe einer DOT-Scan-Software. Die fluoreszenzbasierte Multiplexierung ermöglicht es uns, die Antigenprofile verschiedener Zellpopulationen innerhalb derselben Gewebeprobe zu unterscheiden. Die hier gezeigten Bilder stammen von einer Probe eines kolorektalen Karzinoms.Diese drei Bilder zeigen einen optischen Scan, einen fluoreszierenden Scan für CD3-exprimierende Zellen und einen fluoreszierenden Scan für EPAM-exprimierende Zellen. Die Ergebnisse aus dem DOT-Scan-Microray sollten konsistente Zellbindungs­muster zwischen den beiden duplizierten Objektträgern aufweisen. Starke Bindung an den Ausrichtungspunkten entlang der Kante des Objektträgers weist darauf hin, dass ausreichende Mengen an Zellen erfasst wurden.Ein PDF-Bericht kann erstellt werden, um quantitative Werte für die Zellbindung anzugeben. Die Balkengrafik-Darstellung der Zellbindung zeigt einen Unterschied in der Antigenexpression zwischen normalem Mucosa- und Tumorprobe.Die optischen Ergebnisse geben eine Gesamtdarstellung der Antigenexpression in allen Zelltypen innerhalb der Probe; die AAM-Multiplexergebnisse zeigen ein deutlicheres Bild der Unterschiede in der Antigenexpression zwischen normalen epithelialen Zellen und Krebszellen. Obwohl viele der unterschiedlich exprimierten Antigene als Gruppe bekannte Biomarker für Darmkrebs sind, liefern sie insgesamt eine weitaus genauere Krankheitssignatur für die Stratifikation, als es ein einzelner Biomarker jemals erreichen könnte. Die CD3-Multiplexergebnisse zeigen mehr T-Zellen in der Krebsprobe im Vergleich zur Normalprobe.Häufig exprimieren die T-Zellen bei Krebserkrankungen Aktivierungsmarker, was die Möglichkeit nahelegt, dass es sich bei diesen T-Zellen um tumorinfiltrierende Lymphozyten oder mit Entzündungen assoziierte T-Zellen handelt. Eine umfassende Analyse kann mit dem Multi-Experiment-Viewer Version 4.4, einer Open-Source-Software für Heatmaps und Datenanalyse, durchgeführt werden. Die hierarchische Clusterung von Proben des kolorektalen Karzinoms kann genutzt werden, um Zusammenhänge mit dem Krankheitsstadium oder der Patientenprognose aufzuzeigen.Eine umfangreiche Bibliothek von Krankheitssignaturen ist ein wertvolles Hilfsmittel bei der Prognoseeinschätzung bei Patienten mit Darmkrebs oder bei der Bestimmung des Verlaufs der postoperativen Therapie. Wir haben soeben das Verfahren zur Profilierung der Oberflächenantigenexpression in einer gemischten Zellpopulation im Darmkrebsgewebe mithilfe des DOT-Scan-Antikörper-Mikroarrays und der fluoreszenzbasierten Multiplexanalyse vorgestellt. Ein wichtiger Aspekt dieses Experiments, an den man denken sollte, ist, stets frisches Gewebe zu verwenden und mindestens 4 Millionen vitale Zellen für die Durchführung dieses Experiments bereitzustellen. Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

colorectal-cancer-cell-surface-protein-profiling-using-an-antibody

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Video beschreibt die Technik zur Untersuchung der Proteinexpression in miRNA-transfizierten Lungenkrebszellen unter Verwendung von Antikörper-Microarrays zur Messung der spezifischen Genexpression. Im vorgestellten Protokoll führen wir Antikörper-Microarrays zur Identifizierung der Aktivität einer kombinatorischen miRNA-Behandlung bei der Stoppung des Zellzyklus und der Angiogenese durch.

Antikörper-Microarray: Eine Technik zur Untersuchung der Proteinexpression von miRNA-behandelten Lungenkrebszellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.

Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Die Multiplex-Barcoding-Bildanalyse hat kürzlich die Charakterisierung der Tumormikroumgebung verbessert und ermöglicht umfassende Studien der Zellzusammensetzung, des funktionellen Zustands und der Zell-Zell-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Färbe- und Bildgebungsprotokoll unter Verwendung des Barcodings von Oligonukleotid-konjugierten Antikörpern und Zyklusbildgebung, das die Verwendung einer hochdimensionalen Bildanalysetechnik ermöglicht.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur manuellen Tyramid-Signalverstärkung (TSA) Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) in Kombination mit Bildanalyse und räumlicher Analyse beschrieben. Dieses Protokoll kann mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten für die Färbung von zwei bis sechs Antigenen pro Objektträger verwendet werden, je nachdem, welcher Objektträgerscanner im Labor verfügbar ist.

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung eines Multiplex-Immunfluoreszenz-Antikörper-Panels für die DNA-Barcode-basierte Bildgebung von murinen FFPE-Melanomgeweben. Wir beschreiben auch eine Bildanalyse-Pipeline mit Open-Source-Tools zur Generierung von räumlichen Proteomik-Einblicken in die Immunmikroumgebung des Mausmelanomtumors.

DNA-Barcode-basierte Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse von FFPE-Proben von genetisch umprogrammierten murinen Melanomen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für den Multiplex-mRNA-Nachweis mit Protein-Imaging-Massenzytometrie in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten.

Dual-modale molekulare Kartographie: Integration der Multiplex-mRNA-Detektion mit der Protein-Imaging-Massenzytometrie

Lernen Sie die Profilierung von Oberflächenantigenen in Darmkrebsgewebe mit dem DOT-Scan-Antikörper-Microarray und Fluoreszenz-Multiplexing. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern und Zellunterpopulationen.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

Weitere Videos entdecken