Name: A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie eine Vollblut-Assay-Methode zur Messung der mykobakteriellen Stoffwechselaktivität mit Reportergen-markierten Bakterien. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von Wirt-Pathogen-Interaktionen bei Tuberkulose.

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Diese Arbeit wurde durch persönliche Stipendien aus dem Wellcome Trust an Beate Kampmann (056.608, GRO77273) finanziert.

1. Vorbereitung der BCG lux Reporter Mykobakterien Lager <ol><li> Wachsen BCG lux (M. bovis BCG Montreal Stamm mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 umgewandelt) unter Schütteln bei 200rpm bis Mitte logarithmischen Phase in Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2% Glycerin, 0,05% zwischen 80 und 10% ADC Bereicherung. </li><li> Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &amp;mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Laden Röhrchen mit N-Decyl-Aldehyd (Luciferase Enzym-Substrat) auf der Rückseite der Maschine und gewährleistet den Deckel befestigt ist, und Röhren statt. </li><li> Prime Luminometer Injektor mit Substrat über die Prime-Programm auf 100 ucl x 3 in jeder der 3 leere Grundierung Rohre in das Luminometer platziert zu injizieren. </li><li> Legen Sie die 2 Röhren in das Luminometer und nehmen Messungen über ein Programm zur Injektion 100 ucl von Substrat in jedes Röhrchen setzen und zu lesen für 20 sec in 1 Sekunden-Intervallen. </li><li> Wenn die Aktie 1x10 8 RLU / ml zu 2x10 8 RLU / ml (dies dauert ca. 3-4 Tagen Wachstum) erreicht hat, das gleiche Volumen von sterilem 30% Glycerin, um die Kultur in einem 50ml Falcon-Röhrchen und vorsichtig mischen. </li><li> Aliquot 1,5 ml Volumen in beschriftete 2ml Schraubverschluss Mikroröhrchen und bei -80 ° C. </li></ol> 2. Bestimmen Lager RLU / CFU Korrelation und die Inhalte der Aliquots <ol><li> Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe. </li><li> Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur (RT) in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe. </li><li> Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 4 Tage. </li><li> An jedem Tag, Make-up seriellen 10-fach Verdünnungen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 und 1:100.000) für CFU Bestimmung. </li><li> Richten Sie den gleichen Verdünnungen parallel und duplizieren, um Lumineszenz zu bestimmen (siehe Teil 1,2-1,6). </li><li> Bereiten Sie zwei 3-Fach Platten Middlebrook 7H11-Agar (1 l flüssiges Medium mit 0,5% Glycerin, 10% OADC ergänzen, 1 ml 20% Tween und 1 ml Hygromycin). </li><li> Platte aus 100 &amp;mgr; l jeder Verdünnung auf ein Segment jeder Platte mit separaten Spreizer, verteilen die Flüssigkeit gleichmäßig auf die einzelnen Kammer. </li><li> Seal jede Platte mit Parafilm, in einem sterilen Plastikbeutel, Dichtung mit Autoklav-Band, und bei 37 ° C für 2 Wochen mit Deckel nach unten. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig, bis KBE erscheinen (2-3 Wochen). </li><li> Zum Zählen Kolonien, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator nehmen und auf eine Kolonie zu begegnen. Berechnen Sie den Mittelwert für jede Verdünnung aus dem Duplikat-Platten. </li><li> Berechnen Sie die RLU / CFU-Verhältnis mit entsprechenden RLU und KBE-Zählungen für jede Verdünnung. Das Verhältnis sollte zwischen 3 und 5 RLU / CFU werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der BCG lux Kultur für die Impfung in Vollblut <ol><li> Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe. </li><li> Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei RT in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe. </li><li> Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 2 bis 4 Tagen. </li><li> Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &amp;mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Prime Luminometer mit dem Substrat (wie oben beschrieben), vorsichtig vortexen der 2 Röhren und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben). </li><li> Verwenden Sie diese Lesung zu verdünnen die Kultur in PBS zu einem Gegenwert von 7x10 6 RLU (dieser wird ein Inokulum von etwa 2x10 5 CFU / ml Blut und einem Verhältnis von BCG an Monozyten von etwa 1:1 zu geben, unter der Annahme einer Monozytenzahl des Gebens etwa 2x10 5 bis 4x10 5 Monozyten pro ml Blut). </li></ol> 4. Vorbereitung von Vollblut <ol><li> Nehmen Sie 3 bis 5 ml Venenblut in ein Röhrchen mit frei von Konservierungsmitteln Heparin. </li><li> Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Falcon-Röhrchen und verdünnt mit dem gleichen Volumen RPMI 1640 mit Glutamin und 25 mM HEPES (keine Pen / Strep). </li><li> Aliquot 900μl verdünntes Blut in dreifacher Ausfertigung in sterile bijou Rohre für jeden Zeitpunkt (6 Röhren in insgesamt:. 3 für 0HRS und 3 für 96 Stunden Einrichten zusätzlicher Röhren für zusätzliche Zeitpunkte, falls erforderlich. </li><li> Aliquot 900μl der Middlebrooks 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC ergänzen + 50μg/ml Hygromycin (dem gleichen Medium wie die Kultur der BCG lux verwendet) in die für das Wachstum steuert duplizieren. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der verdünnten BCG lux in jedes Röhrchen Blut, und die 2 WachstumskontrolleRohren. </li><li> Gut mischen und statt der 3 Bijous für die 96hr Zeit-Punkt und die 2 Wachstum steuert auf ihrer Seite in dem schaukelnden Brutschrank bei 37 ° C, 20 U / min (CO 2 nicht erforderlich). </li></ol> 5. Mess-Lumineszenz (bei 0 STUNDEN und 96 Std.) <ol><li> Centrifuge die 3 Bijous bei 2000g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 300μl Überstand, ohne das Pellet und in 2ml Schraubverschluss Röhrchen zu bei -80 ° C einzufrieren für nachfolgende Zytokin-Analyse. </li><li> Fügen Sie 300μl PBS für jeden bijou, um die Lautstärke der Überstand entfernt zu ersetzen. </li><li> Saugen Sie die Inhalte der einzelnen bijou in die entsprechenden 50ml Falcon-Röhrchen und fügen 8ml destilliertem Wasser in jedes Röhrchen. Beginnen Sie einen Timer für 10 min. Nb: Dies ist eine Zeit-und Kleinschreibung Schritt, und dieser Inkubation darf nicht länger als 10 min, beginnend ab, wenn die Zellen zum ersten Mal in Kontakt mit Wasser. </li><li> Spülen Sie jede bijou mit 2 ml destilliertem Wasser und Vortex für 5 Sekunden, bevor Kippen in die entsprechenden Falcon-Röhrchen. </li><li> Am Ende der 10 Minuten Inkubation Zentrifuge der Falcon-Röhrchen bei 2000g für 10 Minuten. </li><li> Dekantieren Überstand in Surfanios Desinfektionsmittel. </li><li> Fügen Sie ein paar Glasperlen zu jedem Pellet und vortexen. </li><li> Add 1 ml sterilem PBS in jedes Röhrchen und vortexen. </li><li> In Luminometer Rohre, machen 1:10 Verdünnungen für jede Probe in zweifacher Ausfertigung mit PBS (900μl PBS + 100 &amp;mgr; Probe) und an der 96hr Zeitpunkt. Nehmen Sie die gleichen Verdünnungen für jeden der das Wachstum steuert. </li><li> Vorsichtig vortexen die Rohre und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben) Nb: Readings zwischen dreifach von der gleichen Probe sollte innerhalb von 15% voneinander werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Es ist wichtig, um Bakterien in der logarithmischen Phase des Wachstums für das gesamte Blut lux-Assays verwenden, dh über 48-72 Stunden angewachsen vor Inokulation der Proben, wie Stoffwechselaktivität ist suboptimal, wenn entweder direkt aus dem Gefrierschrank oder in der stationären Phase. Die vor Wachstum sollten standardisiert werden für eine Reihe von Experimenten, um entweder 48 oder 72 Stunden, um die Variabilität zu vermeiden. Abbildung 1 zeigt die Wachstumskurve einer repräsentativen Kultur des BCG lux. Die Verdoppelungszeit beträgt etwa 24 Stunden bis zur stationären Phase erreicht ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Representative Wachstumskurve BCG lux über 96 Stunden in 7H9 Medium und Korrelation von RLU und CFU. Obwohl RLU-Werte immer mit CFU korrelieren, kann die Zahl der RLU entspricht einer CFU je nach Lager, weshalb es ratsam, die gleiche eingefroren Lager in einer Reihe von Experimenten verwenden, um eine konsistente Multiplizität der Infektion zu gewährleisten ist ( MOI). Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für RAW-Datum zum Zeitpunkt der Impfung (T 0) und bei 96 Stunden. Das Wachstum Verhältnisse sind nach folgender Formel berechnet T 96 / T 0, aber auch andere Zeitintervalle können natürlich auch gemessen werden. Es ist jedoch ratsam, die Kulturen jenseits 96 Stunden zu verwenden, da erhebliche Zelltod eintritt. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Beispiel von Rohdaten zum Zeitpunkt der Impfung (T0) und bei 96 Stunden (T96) und berechnete Wachstum Verhältnisse von 3 erwachsenen Spendern. Abhängig von den verfügbaren Antigen-spezifischen Gedächtnis Reaktionen und eventuell auch der neutrophilen Granulozyten, variieren Wachstum Verhältnisse zwischen Individuen, wie hier in Abbildung 2 im Blut von Kindern mit und ohne HIV-Infektion gezeigt. Im Durchschnitt kleine Kinder haben ein höheres Wachstum Verhältnisse als Erwachsene, haben Tuberkulin-Hauttest (TST) + ve Einzelpersonen geringeres Wachstum Verhältnisse als TST-ve Individuen und HIV-infizierten Patienten haben hohes Wachstum Verhältnisse durch den Mangel an CD4 T-Zell-Population, einer der wichtigsten Vermittler der zellulären Immunantwort gegen Mykobakterien. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Inter-Donor Variabilität:. Growth-Verhältnisse von T 0 im Vergleich zu 96 Stunden für eine Reihe von Patienten, je nach zugrunde liegende HIV-Status. Reproduzierbarkeit des Wachstums Verhältnisse über einen längeren Zeitraum ist in Abbildung 3, die Ergebnisse von 64 Spendern blutete zweimal über einen Zeitraum von 12 Monaten und von einem einzigen Spender blutete immer wieder zur Kontrolle Experimente zusammengefasst dargestellt. Mögliche Ursachen der Variabilität könnten Veränderungen in mykobakterielle Sensibilisierung oder Variabilität innerhalb Ebenen der Host-Zytokine, wie in vielen Bioassays beobachtet werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. (A) Single Spender auf 12 Anlässe über 12 Monate. (B) mehrere (64) Spender auf 2 Gelegenheiten über 12 monate.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind auch in Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Die erste Generation von Menschen bakterizide Assays wurden unter Verwendung Makrophagen allein, infiziert mit M. Tuberkulose. CFU diente als Haupt-Auslesen von Mykobakter...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat No </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Verschiedene </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11-Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9-Bouillon </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC Bereicherung </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC ergänzen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-Decyl-Aldehyd </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Ethanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> Sterile PBS </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 mit L-Glutamin, 25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Sterilem destilliertem Wasser </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Ausstattung </td></tr><tr><td> Rohr Luminometer (injizierbare Port erforderlich) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 oder Einrohr-Luminometer Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer Röhren, 12 x 75mm, Pyrex randlose </td><td> Corning von VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappen, sterile Polycarbonat 250ml </td><td> Corning über Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen (frei von Konservierungsmitteln Heparin) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon-Röhrchen, konisch </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin Probe Polypropylen bijou Rohre </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin Universal-Container (30 ml) </td><td> Laboratory Analysis LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Glasperlen 2mm Durchmesser </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml Pipetten und Pipettenspitzen Jungen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl und 200 ul Pipetten-und Filterspitzen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Allgemeine Laborausstattung: </td></tr><tr><td> Class II Sicherheitsschrank Schrank </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kühlschrank (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schüttler-Plattform (180 0) zu Röhrchen mischen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker Incubator Set bei 37 ° C für den Anbau von bis Bakterienkulturen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay zur rentabilität von mykobakterien measure, mit reporter-gene bcg oder m. tb (bcg tagged lux / m. tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Funktionale Tests sind seit langem eine wichtige Rolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoff gespielt. Dies wird üblicherweise als Serum bakterizide Titer ausgedrückt. Studium der Serum bakterizide Titer in Reaktion auf Impfstoffen für Kinder haben es uns zur Entwicklung und Validierung cut-off Werte für schützende Immunantworten und wie cut-offs sind in den Routineeinsatz. Keine solche Assays wurden nach vorne in die Routine Beurteilung von Impfstoffen, die vor allem die zellvermittelte Immunität in Form von Effektor-T-Zell-Reaktionen, wie z. B. TB-Impfstoffe induzieren genommen. Im Tiermodell ist die Leistung eines bestimmten Impfstoff routinemäßig in standardisierten bakterizide Assays ausgewertet und alle aktuellen Roman TB-Impfstoff-Kandidaten haben diesen Schritt in ihrer Auswertung wurden die vor dem 1. Humanstudien Phase unterzogen. Die Beurteilung der Immunogenität und damit die Wahrscheinlichkeit der Schutzwirkung von neuartigen Anti-TB-Impfstoffe sollten im Idealfall durchlaufen eine ähnliche stufenweise Auswertung in der menschlichen Modellen nun auch eine Bestimmung in bakterizide Assays. Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind bereits gut in den Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Es wurden jedoch keine solchen Tests in klinischen Studien für neue Anti-TB-Impfstoffe bisher einbezogen. Zwar gibt es noch Ungewissheit über die genauen Mechanismen, die von Mykobakterien in humanen Makrophagen töten führen, ist die Interaktion von Makrophagen und T-Zellen mit Mykobakterien eindeutig erforderlich. Der Test in diesem Papier beschrieben stellt eine neuartige Generation von bakterizide Assays, die Untersuchungen solcher Schlüssel zellulären Komponenten ermöglicht mit allen anderen zellulären und humoralen Faktoren, die in Vollblut ohne Annahmen bezüglich ihrer relativen individuellen Beitrag. Der Test von unserer Gruppe beschrieben werden kleine Mengen von Blut und hat bereits in Studien an Erwachsenen und Kindern in TB-endemischen Einstellungen eingesetzt. Wir haben Immunogenität des BCG-Impfstoffes gezeigt, erhöhtes Wachstum von Mykobakterien bei HIV-positiven Patienten, sowie die Wirkung von anti-retroviralen Therapie und Vitamin D auf Mykobakterien Überleben in vitro. Hier fassen wir die Methodik, und präsentieren Ihnen unsere Reproduzierbarkeit Daten mit diesem relativ einfachen, kostengünstigen und Feld-freundlichen Modell. Hinweis: Definitionen / Abkürzungen BCG lux = M. bovis BCG, Montreal Belastung, mit Shuttle-Plasmid pSMT1 Durchführung der luxAB Gene von Vibrio harveyi verwandelt, die unter der Kontrolle der Mykobakterien GroEL (Hsp60)-Promotor. KBE = Kolonie bildende Einheiten (ein Maß für Mykobakterien Lebensfähigkeit).

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien<em&gt; In-vitro-</em&gt;, Die Reporter-Gen verwendet getaggt Mykobakterien statt Kolonie-bildenden Einheiten (KBE). &quot;Survival&quot; von Organismen sowie Host-Reaktion-Marker sind gleichzeitig gemessen Bereitstellung eines kostengünstigen, vielseitig und funktionsfähiges System für Untersuchungen der Wirt / Pathogen-Interaktionen im Rahmen der Tuberkulose.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Funktionelle Assays spielen seit langem eine Schlüsselrolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoffs. Dies wird herkömmlicherweise als serum-bakterizide ...

Dieser In-vitro-Assay misst die metabolische Aktivität von Mykobakterien im Vollblut, um den Effekt der Wechselwirkungen zwischen Mykobakterien und Wirtsimmunzellen zu bewerten. Zunächst werden mit einem Reportergen markierte Mykobakterien dem menschlichen Vollblut zugesetzt, um über einen definierten Zeitraum eine Echtzeit-Auslesung zu ermöglichen. Sammeln Sie die Überstände der Proben zur Zytokimmessung sowie die Zellfraktionen für RNA-Analysen, lysieren Sie die roten Blutkörperchen und messen Sie mithilfe serieller Verdünnungen und Biolumineszenz die metabolische Aktivität der Mykobakterien.Schließlich wird das Verhältnis zwischen dem endgültigen Biolumineszenzsignal, ausgedrückt in relativen Lichteinheiten, und dem Biolumineszenzsignal zum Zeitpunkt der Inokulation mit einem Taschenrechner berechnet. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Wirts, Mykobakterien einzudämmen. Dieser Gentranskript-Assay mit Vollblut kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten.Zum Beispiel: Hat das Vorhandensein bestimmter Effektor-Immunzellen in einer Blutprobe eine funktionelle Wirkung auf die betreffenden Organismen? Mikrobakterien. Der Hauptvorteil dieser Technik gege

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Vorbereitung und Quantifizierung des Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux-Inokulums mittels Biolumineszenz-Assay und die Aufzählung von koloniebildenden Einheiten.  Das vorbereitete Inokulum kann für Infektionsstudien verwendet werden.

Vorbereitung und Quantifizierung von Mycobacterium bovis BCG lux Inokulum zur Infektion

Dieses Video zeigt die in vivo Messung der bakteriellen Belastung mit Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux-infizierten Insektenlarven. Der Prozess umfasst die Homogenisierung der Larven, die Behandlung mit einem Luciferase-Substrat und die Biolumineszenzmessung, um die relativen Lichteinheiten zu bestimmen, die mit der bakteriellen Belastung korrelieren.

Messung der in vivo Belastung durch Bakterien, die Luziferase exprimieren, in einer Insektenlarve

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Wir beschreiben einen Tuberkulose-Molekular-Bakterien-Belastungstest, der nach der Hitzeinaktivierung von Sputum durchgeführt wurde. Die Wärmeinaktivierung macht Sputumproben nicht infektiös und macht die Notwendigkeit von Laboratorien der Eindämmungsstufe 3 für Tuberkulosemolekulartests überflüssig.

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Lernen Sie eine Vollblut-Assay-Methode zur Messung der mykobakteriellen Stoffwechselaktivität mit Reportergen-markierten Bakterien. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von Wirt-Pathogen-Interaktionen bei Tuberkulose.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux) (Video) | JoVE Journal

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

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