Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, geruchsevozierte Aktivitäten an der Oberfläche des Riechkolbens von Mäusen mit Hilfe von intrinsischen optischen Signalen und Flavoprotein-Autofluoreszenzsignalen oder FAS-Bildgebung zu kartieren, nachdem die Maus anästhesiert und der Schädel freigelegt wurde. Der Knochen über dem Riechkolben ist ausgedünnt. Mit der Spitze einer Skalpellklinge wird ein Knochenlappen gezogen und dann entfernt, eine Kammer besteht aus Zahnzement und umgibt die freiliegende Oberfläche des Riechkolbens.

Es wird mit Aros gefüllt und ein Deckglas auf dieses Präparat gelegt. Olfaktorische Karten werden sequentiell in derselben Maus unter Verwendung intrinsischer optischer Signale und FAS-Bildgebung erfasst. Die Abbildung anderer evozierter Aktivitäten im Riechkolben der Maus unter Verwendung von optischem Reflexions- und Autofluoreszenzsignalen kann helfen, Schlüsselfragen bezüglich der speziellen Beschichtung von Ordnungen im Riechkolben zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie z.B. der Zwei-Doxy-Glukose-Bildgebung oder FMRI besteht darin, dass es möglich ist, ordnungsevokative Aktivitäten mit einer speziellen Auflösung einer einzigen Glamourliste aufzuzeichnen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesen Methoden noch nicht vertraut sind, zu Beginn ihrer Arbeit Schwierigkeiten haben, da sowohl chirurgische als auch instrumentelle Fähigkeiten nur langsam erworben werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Aufmerksamkeit auf die entscheidenden Schritte der chirurgischen und bildgebenden Verfahren zu lenken. Kneifen Sie die Hinterpfote der Maus zusammen, um die Anästhesie zu bestätigen, und entfernen Sie die Haare mit einer Haarschneidemaschine von der Kopfhaut.

Wischen Sie alle Resthaare mit sterilen Mullpads von der Haut ab, die in destilliertem Wasser getränkt sind. Platzieren Sie die Maus so im stereotaktischen Rahmen, dass sich die Schnauze in der gleichen Ebene wie der Hinterkopf befindet. Um den Riechkolben waagerecht zu positionieren, fixieren Sie die Ohr- und Nasenbügel fest, um ein Verrutschen zu verhindern.

Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen während der Bildgebung zu verhindern, und desinfizieren Sie dann den Kopfhautbereich mit Betadine mit einer sterilen Schere. Machen Sie einen Schnitt am Hinterkopf zwischen den Ohren, dann schneiden Sie an beiden Seiten zum Ohransatz und in vorderer hinterer Richtung zur Stirn entlang der Augenlider. Beenden Sie die Entfernung der Kopfhaut, indem Sie die Haut an der Schnauze abschneiden.

Anhand der Nasenstange als Richtlinie. Positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop und lösen Sie mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen vorsichtig das Periost an der Oberseite des Schädels. Verwenden Sie eine Pinzette, um das restliche Gewebe zu entfernen, und kratzen Sie die Oberfläche des Schädels mit einem Skalpell ab, um eine saubere Vorbereitung zu gewährleisten und den Bereich des Riechkolbens während des gesamten Experiments feucht zu halten.

Legen Sie ein Stück resorbierbare Gelatine, einen mit destilliertem Wasser getränkten Schwamm, auf den Knochen über dem Riechkolben zwischen den Augen. Entfernen Sie den Gelatineschwamm und beginnen Sie damit, den Knochen vorsichtig mit einer Skalpellklinge Nummer 10 abzukratzen. Halten Sie einen konstanten Winkel von 45 Grad zwischen der Klinge und dem Knochen und bewegen Sie die Klinge von den Augenlidern zur sagittalen Seite des Bulbusbereichs.

Achten Sie darauf, während des Ausdünnungsprozesses keinen vertikalen Druck auf den Knochen auszuüben oder den Knochen über der Venenhöhle zu zerkratzen. Halten Sie alle fünf Minuten an und legen Sie einen hydratisierten Gelatineschwamm auf den Knochen, um die Zubereitung abzukühlen. Tupfen Sie den Schädel mit dem Schwamm ab, um Knochen und Staub zu entfernen, und wischen Sie die Spitze des Skalpells regelmäßig ab, um es sauber und scharf zu halten.

Fahre fort, bis die schwammige Knochenschicht oder Trabekel sichtbar ist. Wenn das feine Gefäßsystem des Riechkolbens sichtbar ist, hören Sie auf, den Knochen zu kratzen, und zeichnen Sie mit der Spitze eines Skalpells mit der Nummer 11 eine rechteckige Fläche und schließen Sie den Riechkolben. Wenn Sie das Fenster innerhalb der Begrenzung der venösen Nebenhöhlen halten, wird der Knochen innerhalb des rechteckigen Bereichs weiter zerkratzt.

Seien Sie besonders vorsichtig mit der Tiefe der Skalpellspitze, um zu vermeiden, dass Sie die Dura-Oberfläche berühren. Um ein Gefühl für die Dicke des verbleibenden Knochens zu bekommen, drücken Sie ihn vorsichtig mit der Spitze einer Pinzette. Wenn sich der Knochen unter dem Druck faltet, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.

Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung hinzu und heben Sie den Knochenlappen mit der horizontal ausgerichteten Spitze des Skalpells an. Entfernen Sie den Lappen vorsichtig mit einer Pinzette, um ein Abreißen des restlichen Knochens zu vermeiden. Sobald die Oberfläche des Riechkolbens freigelegt ist, überprüfen Sie, ob keine Blutungen oder Blutgefäße vorhanden sind. Anastomose.

Wischen Sie die Stelle mit einem in Kochsalzlösung getränkten Gelatineschwamm ab. Um den Riechkolben feucht zu halten, tragen Sie Polyacrylat-Zahnzement mit einer 29-Gauge-Spritze auf, um eine Vertiefung auf dem Knochen um das Schädelfenster herum zu bilden. Geben Sie einen Tropfen Arous mit niedrigem Schmelzpunkt auf die Dura und legen Sie ein steriles Deckglas über das Schädelfenster für die Bildgebung.

Platzieren Sie den stereotaktischen Rahmen unter dem Stereomikroskop, wobei das Schädelfenster im Gesichtsfeldfokus zentriert ist, um die Kapillaren in den Blick zu bringen. Schalten Sie auf 580 Nanometer grünes Licht um und nehmen Sie ein anatomisches Kontrollbild auf, um den Zustand der Präparation während der Bildgebung zu überprüfen. Fahren Sie dann mit der Aufzeichnung der Stimulationsversuche fort, indem Sie entweder eine intrinsische optische Signalbildgebung unter einer Beleuchtung von 630 Nanometern oder eine Autofluoreszenz-Signalbildgebung mit Flavoproteinen verwenden. Unter 480 Nanometern Beleuchtung, Eine Standard-Bildgebungssitzung umfasst eine Basislinie von fünf bis 10 Sekunden, in der nur Luft zugeführt wird, gefolgt von der Geruchsstimulation für drei bis 10 Sekunden, abhängig von der gewählten Geruchskonzentration.

Und schließlich werden 70 bis 82 Sekunden Luftzufuhr für die Wiederherstellung der Ausgangswerte aufgezeichnet. Hier wird das Gefäßsystem des Riechkolbens durch das Schädelfenster abgebildet, gefolgt von den Ergebnissen eines Stimulationsversuchs mit h sinal als Geruchsstoff, der sowohl mit iOS- als auch mit FAS-Bildgebung erfasst wurde. Mit Hilfe der iOS-Bildgebung wird die geruchsevozierte Aktivität gezeigt, da dunkle Bereiche von Absorptionsbereichen, die durch AL aktiviert werden, durch die weißen Pfeile gekennzeichnet sind, und aktive Bereiche sind sowohl in einzelnen als auch in gemittelten Mehrfachversuchen zu sehen.

Der Wechsel zur FAS-Bildgebung bei derselben Maus-OD-evozierten Aktivität wird nun als weiße Bereiche der Autofluoreszenzemission angezeigt, die durch die schwarzen Pfeile angezeigt werden, und kann auch sowohl in einzelnen als auch in gemittelten Mehrfachversuchen gesehen werden. Beachten Sie, dass sich sowohl die schwarzen Absorptionszonen, die mit der iOS-Bildgebung zu sehen sind, als auch die weißen Bereiche der Autofluoreszenzemission, die mit der FAS-Bildgebung zu sehen sind, überlappen. Diese räumliche Übereinstimmung bestätigt, dass die beiden Techniken die Visualisierung der gleichen olfaktorischen Glomeruli ermöglichen: Sobald die Bildgebungsordnung die evozierten Aktivitäten mit optischen Reflexions- und Autofluoreszenzsignalen beherrscht, können sie in einer Stunde für die Operation und einigen Stunden für die Bildaufnahme durchgeführt werden.

Der Hauptnachteil dieser optischen Bildgebungsverfahren ist die Tatsache, dass sie nicht angewendet werden können, um olfaktorische Karten in gewisser Weise frei bewegende Mäuse zu visualisieren. Und aufgrund des begrenzten Eindringens von Photonen in das biologische Gewebe ermöglichen sie nach ihrer Entwicklung in den späten neunziger Jahren keinen Zugang zu den ventralen olfaktorischen Glomeruli und zeichnen intrinsische Signale im olfaktorischen System auf. Vielleicht eine Möglichkeit für Forscher auf dem Gebiet der optischen Bildgebung, die Eigenschaften der speziellen Beschichtung von od zu erforschen.

Im Riechkolben ist die Flavoprotein-Autofluoreszenzbildgebung eine vielversprechende Technik, um neue Einblicke in die Spezialbeschichtung von OD unter Verwendung endogener optischer Signale zu gewinnen.