Name: Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die quantitative Messung von TGF-β-induzierter Invasion in 3D-Kollagen-Gelen mit MCF10A-Zelllinien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Invasionsregulatoren in physiologisch relevanter Umgebung.

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Wir sind dankbar, dass Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) für Reagenzien und Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Intitute, Detroit, USA) für die Zell-Linien.

1. Vorbereitung der Methocel-Lösung (500 mL) <ol><li> Autoclave 6 g Methylcellulose in einer 500 ml Flasche mit einem Magnetrührer. </li><li> Lösen Sie die Methylcellulose in 250 ml vorgewärmter DMEM/F12 ohne Serum (60 ° C) für 20 min. </li><li> Add 250 ml DMEM/F12 (RT) mit 10% Pferdeserum. Mix über Nacht (4 ° C). </li><li> Deaktivieren Sie die Lösung durch Zentrifugation (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li> Nehmen Sie die klare hochviskose Lösung in ein neues Röhrchen (etwa 90-95% der Stammlösung). </li><li> Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Spheroid Kultur <ol><li> Bereiten Sie eine 20% Methocel-Lösung (10 ml Methocel und 40 ml Wachstumsmedium). </li><li> Wash Zellen zweimal mit PBS, fügen 0,1% Trypsin und inkubieren Zellen bei 37 ° C </li><li> Die Zellen in Wachstumsmedium und zählen die Zellen. </li><li> Eine Suspension von 10 000 Zellen pro ml in 20% Methocel. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension auf die 96-Well-Rundboden sUSSETZUNG Platten (100 ul pro Well). </li><li> Am nächsten Tag, überprüfen Sie das Sphäroid Bildung in der Suspension Platten. Sphäroide werden bereit sein für den Einsatz nach 1-3 Tagen. </li></ol> 3. Herstellung von Kollagen <ol><li> Bereiten Sie auf dem Eis eine Lösung von 8 ml Kollagen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH und 3 Tropfen 0,1 N HCl. Prüfen Sie, ob pH beträgt 7,4 von Spotting einige der Lösung auf pH-Indikator-Streifen. Der pH-Wert, wenn außerhalb des Bereichs. </li><li> Add 50 ul neutralisiert Kollagenlösung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte </li><li> Bei 37 ° C, bis die Kollagen verfestigt (90 min). </li><li> Bereiten Methocel-Kollagen-Ligand-Lösungen auf Eis: für jeden Liganden Pipette 1 Teil von Kollagen-Lösung. Add 20 ng pro ml Kollagen TGF-β. Nach dem Verdünnen mit Methocel und Verbreitung über die verschiedenen Schichten wird die endgültige Konzentration von TGF-β 5 ng / ml Mix durch Vortexen werden. 1 Teil Methocel-Lösung. Mix durch Vortexen. </li></ol> 4. Spheroid einbettending <ol><li> Legen Sie eine 200 ul Spitze, die etwa 5 mm von der Spitze abgeschnitten hat, auf einem 200 ul Pipette. Saugen Sie up one Sphäroid mit der Pipette und sorgfältig zu verzichten das Medium in einen leeren Teller. Sehen Sie, wenn das Sphäroid bleibt in der Spitze. Das Sphäroid sichtbar ist als weißer Punkt. Ohne die Freigabe der Kolben, saugen 100 ul Kollagen-Methocel Mischung und verzichtet das Sphäroid in das Kollagen-Gemisch in eine Kollagen-beschichtete 96-Well. Tun Sie dies für 12 Sphäroide für jede Bedingung. </li><li> Lassen Sie Kollagen festigen mindestens 30 Minuten bei 37 ° C </li><li> Luftblasen mit einer 200 ul Spitze. </li><li> Dann werden 50 ul Medium mit 1,6% Serum und Inhibitoren in DMSO gelöst. Für SB-431542 add 4 ul Stammlösung (10 mM) zu 1 ml Medium. Nach der Diffusion wird die endgültige Konzentration des Inhibitors 10 uM werden. TGF-β und Inhibitoren bleibt der Verlauf des Experiments. Machen Sie Fotos von der Sphäroide unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung. </li><li> Nach 48h der Stimulation mit TGF-β und / oder Inhibitoren, machen Sie Fotos von der Sphäroide unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung. </li><li> Man misst die Fläche des eindringenden Sphäroide nach 2 Tagen und subtrahieren den Startplatz. Die Vermessung der Fläche eines Sphäroid: Öffnen Sie das Bild aus dem Sphäroid in Adobe Photoshop Extended (Abbildung 2a) und wählen Sie die Schnellauswahl-Werkzeug (Abb. 2B). Der Mauszeiger verwandelt sich in einen Kreis mit einem "Plus"-Zeichen (+) (Abbildung 2C). Während des Ziehens den Cursor über das Sphäroid, wird Photoshop erkennt die Grenzen der Sphäroid. (-)-Zeichen in der Symbolleiste Wenn ein Bereich außerhalb der Sphäroid ausgewählt ist, kann diese Region von der Auswahl durch Drücken der Alt-Taste oder über die negative Selektion Werkzeug, das durch eine angegeben ist ausgeschlossen. Der Cursor verwandelt sich in einen Kreis mit einem "minus" (-)-Zeichen und durch Ziehen der Maus über die falsch gewählten Bereich, wird dieser Bereich von der Auswahl (Abbildung 2d) entfernt. Wenn nötig, mehrere Regionen können durch Drücken der Sh gewählt werdenift-Taste. Um Arbeit genauer kann die Größe des Mauszeigers, indem Sie die Bürste Durchmesser in der Symbolleiste (Abbildung 2E) eingestellt werden. Wenn die ganze Sphäroid ausgewählt ist, wird die Fläche der Auswahl über ANALYSE-Maßnahme in der Menüleiste oder durch Drücken von Strg + Shift + M (Abbildung 2f) berechnet. Die Messwerterfassung Fenster erscheint und zeigt den Dateinamen und den Bereich der Auswahl in Pixel, sowie andere Daten (Abb. 2G). Wenn Mehrfachauswahl gemessen werden, zeigt die erste Zeile die Summe aller Bereiche. Die Messungen der einzelnen Einstellungen sind in den Zeilen dargestellt. Die Daten aller Messungen können in eine Textdatei exportiert werden und in Excel geöffnet. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für das Sphäroid-Assay mit MCF10A1 (M1) normal Brustepithelzellen verwandelte H-RAS MCF10AneoT (M2)-Zellen und M2-derived MCF10CA1a (M4) ist in Abbildung 3 angegeben. M1-Zellen zeigten nur schwache Invasion ohneStimulation, sondern fielen deutlich besser nach Stimulation durch TGF-β. Im Gegensatz dazu die RAS-transformierten M1-derivative M2 überfallen bereits effizient und ohne Zusatz von Stimuli, und das war weitere 4-5 fach auf TGF-β Behandlung erhöht. M4-Zellen zeigten den stärksten Einbruch, mit und ohne TGF-β hinaus. Als nächstes untersuchten wir, ob wir mit TGF-β-induzierte Invasion in dieses Sphäroid-Modell mit Hilfe chemischer Inhibitoren stören. Zu diesem Zweck benutzten wir SB-431542, einem ATP-Analogon und selektiver Inhibitor der Kinase-Aktivität von TβRI sowie Activin Typ IB Rezeptor (ActRIB) und Aktivin-Rezeptor-ähnliche Kinase (ALK) 7 12. Wie erwartet, SB-431542 inhibiert TGF-β-induzierte Invasion von M1, M2 und M4-Zellen (Abb. 4), was darauf hinweist, dass TGF-β-induzierte Invasion TβRI-Kinase abhängig. Darüber hinaus die basale Invasion der Sphäroide wurde auch stark gehemmt, was darauf hindeutet, dass die basale Invasion ist auch dehängig von TGF-β. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm der 3D-Sphäroid-Assay. Zunächst werden die Zellen unter nicht-adhärenten Bedingungen in u-förmigen Suspensionen ausplattiert. Cells aggregrate in multcellular Sphäroide und kann in eine Kollagen-Matrix eingebettet werden. In diese Kollagen-Matrix, sind sie in der Lage, anzugreifen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Quantifizierung der Bereich der Sphäroide mit Hilfe von Adobe Photoshop Extended. (A) Das Bild des Sphäroids ist in Adobe Photoshop Extendend (B) Auswahl des Schnellauswahl-Werkzeug (C) Ziehen Sie den Mauszeiger über das Sphäroid in den Bereich der Sphäroid (D) Entfernung eines wongly enthalten Gebiet mit der Option eröffnet negativen Schnellauswahl-Werkzeug (E) Die Einstellung der Pinselgröße des Schnellauswahl-Werkzeug, um genauer den Bereich auswählen (F) Auswahl derMessung Befehl zur Aufzeichnung (G) Beispiel für ein Messprotokoll. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. TGF-β-induzierte Invasion von Sphäroiden spontan verewigt MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformierten MCF10AneoT (M2 (B) und seine Metastasen derivative MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 und M4 Sphäroide embedded in Kollagen wurden mit 5ng/ml von TGF-β für 48h behandelt wie angegeben. AC Vertreter aufgenommenen Bilder am Tag der Einbettung und zwei Tage später. D Relative Invasion wurde als Gebiet Unterschied am Tag 2 minus Tag 0 quantifiziert. Die Ergebnisse ausgedrückt werden als Mittelwert ± sd ab 13 angepasst. <img alt="Abbildung 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4a"> <img alt="Abbildung 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4b"> Abbildung 4. Basal-und TGF-β-induzierte Sphäroid Invasion gehemmt by SB-431542. M1, M2 und M4 Sphäroide wurden in Kollagen eingebettet und mit TGF-β 5ng/ml und / oder 10 uM SB-431542, wie angegeben. Vertreter Bilder nach 2 Tagen (A) übernommen. Relative Invasion wurde als Gebiet Unterschied am Tag 2 minus Tag 0 (B) quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± sd von 13 Adapted ausgedrückt.

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte.

Wir haben ein Sphäroid Modell, in dem MCF10A1 Zellen und ihre bösartigen Derivate in eine Kollagen-Matrix in einem TGF-β-abhängigen Weise zu erobern. Erstens sind Sphäroide in 96-Wells mit rundem Boden Aufhängeplatten in Gegenwart von Methylcellulose gebildet. Natürlich können auch U-förmigen Poly-HEMA beschichteten Platten für diesen Zweck verwendet werden. Methylcellulose ist absolut in dieser Schritt erforderlich, da die Zellen in Abwesenheit von Methylcellulose sterben. TGF-β ist direkt an die Kollagen-Methocel zuge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Erweiterte Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> pH-Indikatorstreifen </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Loch-Aufhängung Platten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Haftung TC Platten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

spheroid assay zur tgf-β-induzierte invasion measure

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β hat entgegengesetzte Rollen bei Brustkrebs Progression, indem sie als Tumorsuppressor in der Anfangsphase, aber anregend Invasion und Metastasierung zu einem späteren Zeitpunkt 1,2. Darüber hinaus ist TGF-β häufig bei Brustkrebs überexprimiert und seine Expression korreliert mit einer schlechten Prognose und Metastasierung 3,4. Die Mechanismen, durch die TGF-β induziert Invasion nicht gut verstanden sind. TGF-β entlockt seiner zellulären Reaktionen via TGF-β Typ II (TβRII) und Typ I (TβRI)-Rezeptoren. Bei TGF-β-induzierte heteromeren Komplexbildung, phosphoryliert TβRII die TβRI. Die aktivierte TβRI initiiert seine intrazelluläre kanonischen Signalweges durch Phosphorylierung Rezeptor Smads (R-Smads), dh Smad2 und Smad3. Diese aktivierten R-Smads Form heteromeren Komplexe mit Smad4, die im Zellkern ansammeln und regulieren die Transkription von Zielgenen 5. Zusätzlich zu den zuvor described Smad Signalweg, Rezeptor-Aktivierung führt zur Aktivierung von mehreren anderen nicht-Smad Signalwege, zB Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) Signalwege 6. Zur Untersuchung der Rolle der TGF-β in verschiedenen Stadien des Brustkrebses, benutzten wir die MCF10A Zellsystem. Dieses System besteht aus spontan immortalisierte MCF10A1 (M1) Brustepithelzellen 7, verwandelte die H-RAS M1-derivative MCF10AneoT (M2), die Präkanzerosen produziert in Mäusen 8 und die M2-Derivat MCF10CA1a (M4), die von gegründete M2 Xenotransplantate und Formen hochgradige Karzinome mit der Fähigkeit, die Lunge 9 metastasieren. Diese MCF10A Serie bietet die Möglichkeit, die Reaktionen der Zellen mit verschiedenen Graden der Bösartigkeit, die nicht durch einen anderen genetischen Hintergrund sind voreingenommen zu studieren. Für die Analyse der TGF-β-induzierte Invasion, generierten wir homotypische MCF10A Sphäroid Zellkulturen embedded in einer 3D-Kollagen-Matrix in vitro (Abb. 1). Solche Modelle ähneln menschlichen Tumoren in vivo durch die Errichtung eines Gradienten von Sauerstoff und Nährstoffen, was aktive und invasive Zellen auf der Außenseite und Ruhe oder auch abgestorbene Zellen in das Innere des Sphäroids 10. Spheroid basierte Assays haben auch gezeigt, dass bessere rekapitulieren drug resistance als Monolayer-Kulturen 11. Diese MCF10 3D-Modell-System erlaubt es uns, die Auswirkungen von TGF-β-Signalisierung auf der invasiven Eigenschaften von Brust-Zellen zu untersuchen in verschiedenen Stadien der Bösartigkeit.

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; nimmt gegensätzliche Rollen bei der Progression von Brustkrebs ein, indem es in der Initialphase als Tumorsuppressor wirkt, jedoch die Invasion und Metastasierung stimuliert ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Effekt potenzieller Regulatoren der TGF-beta-induzierten Invasion in einem dreidimensionalen Umfeld zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Sphäroide der Zellen hergestellt werden. Anschließend werden die PHE in Kollagen eingebettet, das ein 3D-Umfeld bereitstellt.Anschließend wird der invasive Bereich quantifiziert. Um den Einfluss einer Behandlung auf die TGF-beta-induzierte Invasion zu bestimmen, zeigen die Ergebnisse, dass Modulatoren des TGF-beta-Signalwegs die invasive Eigenschaft der Steroide in einer 3D-Kollagenmatrix beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie dem Scratch-Assay besteht darin, dass sie die 3D-Umgebung besser nachbildet.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den T-Meter-Feldern zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung neuartiger Gene, die an der von TGF-Beta induzierten Invasion beteiligt sind. Um die Methylzellulose-Lösung für den TGF-Beta-induzierten Invasionsassay vorzubereiten, sterilisieren Sie zunächst sechs Gramm Methylzellulose in einer 500-Milliliter-Flasche mit einem magnetischen Rührstab im Autoklaven. Lösen Sie die Methylzellulose 20 Minuten lang in 250 Milliliter vorgewärmtem D-MEM-F12 ohne Serum auf, geben Sie anschließend 250 Milliliter D-MEM-F12 mit 10 % Pferdeserum bei Raumtemperatur hinzu und mischen Sie die Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Klären Sie die Lösung am nächsten Tag durch Zentrifugation bei 5.000 ×g zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.Überführen Sie die klare, hochviskose Lösung in ein neues Gefäß und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie zur Kultivierung von Phe verwendet wird. Bereiten Sie eine 20 %ige Methylzell-Lösung unter Verwendung von 10 Milliliter der hergestellten Methylzell-Stammlösung und 40 Milliliter Wachstumsmedium vor. Waschen Sie MCF-10-A-Zellen zweimal mit PBS.Fügen Sie 0,1 % Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis alle Zellen abgelöst sind. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Zellzählgeräts. Bereiten Sie eine Suspension mit 10.000 Zellen pro Milliliter in 20 % Methylzelle vor.Fügen Sie für jede Testbedingung 100 Mikroliter der Zellsuspension in 12 Vertiefungen einer 96-Loch-Rundboden-Suspensionsplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Bildung von Sphäroiden.Sphäroide sind innerhalb von ein bis drei Tagen gebrauchsfertig. Bereiten Sie auf Eis eine Lösung aus acht Milliliter Kollagen, einem Milliliter 10× PBS, einem Milliliter 0,1 normaler Natriumhydroxid und drei Tropfen 0,1 normaler Salzsäure vor. Überprüfen Sie, dass der pH-Wert der Lösung 7,4 beträgt, indem Sie sie auf pH-Indikatorstreifen auftragen.Stellen Sie den pH-Wert ein, falls er außerhalb des Bereichs liegt. Geben Sie 50 µL neutrale Kollagenlösung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für etwa 90 Minuten oder bis das Kollagen erstarrt ist. Für jeden zu testenden Liganden bereiten Sie eine Methylzell-Kollagen-Ligandenlösung auf Eis vor.Beginnen Sie mit einem Milliliter Kollagenlösung pro Behandlung und geben Sie 20 Nanogramm TGF-beta hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Nanogramm pro Milliliter zu erreichen, die durch Vortexen gemischt wird. Anschließend fügen Sie einen Milliliter Methylzellulose-Lösung hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten, und vortexen erneut. Um erneut ein Steroid einzubetten, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, an der fünf Millimeter oder mehr der Spitze abgeschnitten wurden, auf einer 200-Mikroliter-Pipette.Nehmen Sie dann einen S-Sphäroiden mit der Pipette auf. Geben Sie das Medium vorsichtig in eine leere Platte ab, wobei sichergestellt werden muss, dass der S-Sphäroid in der Spitze verbleibt. Lassen Sie den Kolben nicht los.Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Kollagen-Methyl-Zell-Mischung und geben Sie die S-Sphäroid-Kollagen-Mischung in ein mit Kollagen beschichtetes Well einer 96-Well-Platte; füllen Sie 12 Wells für jede Bedingung. Lassen Sie das Kollagen mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius erstarren und entfernen Sie die Luftblasen mit einer 200-Mikroliter-Spitze.Stellen Sie eine 40 µM-Lösung des TGF-beta-Inhibitors SB 4 31 542 her, indem Sie vier µL der SB 4 31 542-Stocklösung zu einem Milliliter D-M-E-M-F 12 mit 1,6 % Pferdeserum hinzufügen. Geben Sie nach der Diffusion 50 µL Medium mit Inhibitor in jedes Well. Die Endkonzentration des Inhibitors beträgt dann 10 µM.Machen Sie Bilder des Steroids unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung und inkubieren Sie anschließend in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach einer zweitägigen Inkubation machen Sie erneut Aufnahmen und messen die Fläche des eindringenden Steroids, indem Sie ein Sphäroid-Bild in Adobe Photoshop öffnen. Erweitern Sie die Ansicht und wählen Sie das Schnellauswahlwerkzeug aus.Der Mauszeiger verändert sich beim Ziehen des Cursors über das Sphäroid hinweg in einen Kreis mit einem Pluszeichen. Die Software erkennt die Grenzen des Sphäroids. Falls ein Bereich außerhalb des Sphäroids ausgewählt wird, schließen Sie den Bereich aus, indem Sie die Alt-Taste drücken oder das Werkzeug für die negative Auswahl verwenden, das in der Symbolleiste als Minuszeichen dargestellt ist.Ziehen Sie den Cursor über den falsch ausgewählten Bereich, und die Software entfernt diesen Bereich aus der Auswahl. Wenn ein Bereich innerhalb des Sphäroids abgewählt wurde, kann er erneut einbezogen werden, indem man bei gedrückter Umschalttaste zieht. Um genauer zu arbeiten, passen Sie die Größe des Mauszeigers an, indem Sie den Pinseldurchmesser in der Symbolleiste ändern.Um die Fläche aller aktiven Auswahlbereiche zu berechnen, wählen Sie in der Menüleiste die Option Analyse messen. Ein Fenster zur Messungsaufzeichnung erscheint, das den Dateinamen und die Fläche des Auswahlbereichs in Pixeln anzeigt. Werden mehrere Auswahlbereiche innerhalb eines einzigen Sphäroids gemessen, zeigt die erste Zeile die Summe aller Flächen sowie die darunterliegenden Zeilen an.Es werden die Werte der einzelnen Auswahlmöglichkeiten aufgelistet. Exportieren Sie die Daten in eine Textdatei und öffnen Sie diese in Excel. Ein Beispiel des S-Sphäroid-Assays mit MCF 10 A eins, normalen Brustepithelzellen, transformierten MCF 10 A neo T-Zellen und M zwei-abgeleiteten MCF 10 CA eins A, ist hier dargestellt.M1-Zellen zeigten nur eine schwache Invasion ohne Stimulation, drangen jedoch nach Stimulation durch TGF-beta signifikant besser ein. Im Gegensatz dazu drangen die durch RAs transformierten M1-Ableitungen M zwei effizient ohne Zugabe von Stimuli ein, und dies wurde um das Vier- bis Fünffache weiter erhöht. Nach TGF-beta-Behandlung zeigten M-vier-Zellen sowohl ohne als auch mit TGF-beta-Behandlung die stärkste Invasion.Eine grafische Darstellung der Ergebnisse dieses Experiments wurde mit Photoshop erstellt und hier beispielhaft gezeigt: SB 431542, ein ATP-Analogon und selektiver Inhibitor der Kinaseaktivität des TGF-beta-Rezeptor-eins, das außerdem aktiv im Typ-eins-B-Rezeptor und in der rezeptorähnlichen Kinase sieben ist, wurde den Zellkulturen zugesetzt. SB 431542 hemmte die TGF-beta-induzierte Invasion von M1-, M2- und M4-Zellen stark, was darauf hinweist, dass die TGF-beta-induzierte Invasion von der Kinaseaktivität des TGF-beta-Rezeptor-eins abhängig ist. Zusätzlich wurde die basale Invasion der PHE stark gehemmt. Eine grafische Darstellung der Ergebnisse dieses Experiments wurde erneut mit Photoshop erstellt und ist hier dargestellt.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Isolierung von RNA oder Proteinen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise welche Gene oder Proteine exprimiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neue Modulatoren der Tavita-induzierten Invasion finden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Guyon, J., et al. Ein 3D-Sphäroidmodell für Glioblastome. J. Vis. exp. (2020)Das Video zeigt die Erstellung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion. Sphäroide werden aus menschlichen Hirntumorzellen gebildet und in eine Kollagenmatrix eingebettet. Die Tumorzellen an der Peripherie der Sphäroiden nehmen einen invasiven Phänotyp an, sezernieren Proteasen, um das Kollagen abzubauen, und dringen vor, um in die umgebende Matrix einzudringen.

Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.

Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Die Mikroumgebung von Tumoren ist ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und-einmarsches. Um die Fortschreibung des Karzinoms zu imitieren, wird eine biologisch relevante menschliche Matrix benötigt. Dieses Protokoll führt eine Verbesserung für den in vitro dreidimensionalen spheroizider Invasionsuntergang ein, indem es eine menschliche, auf Gelotem basierende Matrix verwendet. Das Protokoll führt auch eine computergestützte Zellinvasion ein.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Lernen Sie die quantitative Messung von TGF-β-induzierter Invasion in 3D-Kollagen-Gelen mit MCF10A-Zelllinien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Invasionsregulatoren in physiologisch relevanter Umgebung.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

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