Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3'UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Reporterkonstrukte gemeinsam mit einem Mikro-RNA-Mimetikum zu transfizieren, um vorhergesagte Mikro-RNA-Ziele in humanen 3'-UTRs zu validieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein experimenteller Aufbau geplant wird, der die Auswahl einer Zelllinie sowie die Auswahl von Mikro-RNA-Mimetika zusammen mit experimentellen und Kontroll-3'-UTR-Go-Clone-Reporterkonstrukten umfasst. Die adhärenten Zellen werden anschließend etwa 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, jedes experimentelle oder Kontroll-3'-UTR-Go-Clone-Reporterkonstrukt gemeinsam mit einem Mikro-RNA-Mimetikum oder einem nicht-zielgerichteten Kontrollmimetikum zu transfizieren, gefolgt von einer Inkubation von 24 bis 48 Stunden. Im letzten Schritt wird das Light-Switch-Luciferase-Assay-Reagenz direkt den Zellen und der Kultur zugegeben, und das lumineszente Signal wird mit einem Plattenluminometer gemessen.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, welche menschlichen 3'-UTRs Ziele eines bestimmten microRNA sind, durch die Messung der Luciferase-Signalunterdrückung mit Reporter-Assay-Technologie. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen für microRNA-Forscher zu beantworten, da sie einen funktionellen Assay bereitstellt, um vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen microRNA und 3'-UTR-Zielsequenzen in lebenden Zellen zu validieren. Das experimentelle Design beginnt mit der Auswahl einer geeigneten, hoch transfectierbaren Zelllinie; Assays mit microRNA-Mimetika funktionieren am besten in Zelllinien mit niedrigen endogenen Expressionsspiegeln der microRNA.

Danach wählen Sie das Mikro-RNA-Mimetikum und das Paar mit dem Nicht-Ziel-Kontrollmimetikum aus; die Einbeziehung einer Nicht-Ziel-Kontrolle ist entscheidend, da die gleichzeitige Transfektion eines Plasmids und eines kleinen RNA-Oligos zu einem geringeren Signal führt als die Transfektion des Plasmids allein. Anschließend wählen Sie die vorklonierten 3'-UTR-GoClone-Reporter-Konstrukte aus der genomweiten Sammlung von Switchgear aus. Rufen Sie den Online-Katalog auf und klicken Sie auf die UTR-Suchschaltfläche.

Nach Eingabe der Liste von Gen-Namen, Gen-Symbolen oder Zugangsnummern liefert die Suche Vektor- und Sequenzinformationen zusammen mit dem Bestandsstatus. Wählen Sie nun die Kontroll-Reporter-Konstrukte aus. Wählen Sie Kontrollkonstrukte mit drei primen ur, die unwahrscheinlich durch die gewählte microRNA gezielt werden, wie beispielsweise housekeeping-urs oder zufällige Fragmente, um unspezifische Effekte der Überexpression von microRNA auf die allgemeine Zellgesundheit oder das Assaysignal auszuschließen.

Erwäge zudem die Verwendung eines synthetischen Mikro-RNA-Zielreporters als positiven Kontrollversuch für die Mimic-Aktivität an Tag eins mit niedrigem Passagegrad auf adhärenten Zellen, sodass sie 24 Stunden später zur Transfektion 80 bis 100 % konfluent sind. Die Verwendung hochkonfluenter Zellen ist entscheidend, um gute Ergebnisse zu erzielen. Säte die Zellen in einer weißen 96-Well-Zellkulturplatte in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern aus.

Gleichzeitig. Überprüfen Sie die geeignete Anzahl von Zellen in einer klaren Platte auf plötzliche Konfluenz am Tag 2, 24 Stunden nach der Zellansaat. Bereiten Sie das Auftauen für die Transfektion vor.

Reporter-Konstrukte und micro-RNAs bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen gründlich mischen und die micro-RNAs in RNA-freiem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von zwei Mikromolar verdünnen. Goplasmid-DNA wird mit 30 Nanogramm pro Mikroliter geliefert und muss nicht weiter verdünnt werden. Zur Herstellung des Transfektionsgemischs beachten, dass jede DNA-RNA-Kombination im Dreifachansatz transfiziert werden sollte; das Volumen ist entsprechend der Anzahl der durchzuführenden Assays hochzurechnen.

Erstellen Sie die Transfektionsreagenz-Mischung, indem Sie 9,85 µL serumfreies Medium und 0,15 µL DharmaFECT DUO pro Transfektion kombinieren. Lassen Sie die Mischung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Erstellen Sie anschließend für jeden Assay die DNA-RNA-Mischung, indem Sie 3,33 µL des GoClone-Reporter-Konstrukts mit ausreichend microRNA-Mimetikum kombinieren, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen.

Füllen Sie das Volumen mit serumfreiem Medium auf 10 Mikroliter auf. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Transfektionsreagenz-Mischung zu 10 Mikrolitern jeder DNA-RNA-Mischung hinzu und mischen Sie gründlich. Das Endvolumen beträgt für jeden Assay 20 Mikroliter.

Gut abdecken und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 80 Mikroliter vorgewärmtes, antibiotikafreies komplettes Medium hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Einzelwell zu erreichen, was zu Endkonzentrationen der Mimetika zwischen 10 und 15 Nanomolar führt.

Als letzten Schritt entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen mit beimpften Zellen und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter der entsprechenden endgültigen Transfektionsmischung. Stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie 24 bis 48 Stunden. Die meisten Mischungen zeigen innerhalb von 24 Stunden signifikante Ergebnisse.

Eine 48-stündige Inkubationszeit führt zu einer höheren Variation von Signal zwischen den einzelnen Vertiefungen. Am Tag 3, 24 Stunden nach der Transfektion, führen Sie Luciferase-Assays mit Light-Switch-Luciferase-Assay-Reagenzien durch. Die Zellen können sofort oder nach Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden. Durch den Einfrier- und Auftauzyklus wird die Zelllyse verstärkt und das Reporter-Signal erhöht. Bringen Sie die Platte mit den transfizierten Zellen auf Raumtemperatur.

Dann bereiten Sie die Light-Switch-Luciferase-Assay-Lösung gemäß den Anweisungen des Kits vor und geben Sie sie in ein steriles Reservoir. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette jeweils 100 Mikroliter der Light-Switch-Assay-Lösung direkt zu jeder Probe. Gut in die weiße 96-Loch-Platte geben, die Platte vor Licht schützen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation fortfahren.

Lesen Sie jeden Wells für zwei Sekunden mit einem Platten-Luminometer aus. Die Hemmung der Luciferase-Reportergenaktivität im dreifachen UTR durch let-7a wurde in HT-1080-Zellen mittels Cotransfektion jeder Reporterkonstruktion mit einem let-7a-Mimetikum oder einem nicht-zielgerichteten Kontrollmittel gemessen. Zur Analyse der Ergebnisse wurde das Signal der nicht-zielgerichteten Kontrolle für jeden Konstrukt als 100 % angenommen.

Berechnen Sie die prozentuale Reduktion, indem Sie das Signal des spezifischen Mikro-RNA-Mimetikums durch das Signal der Nicht-Zielkontrolle teilen. Ein bestimmtes Mikro-RNA-Mimetikum kann unspezifische Effekte auf die allgemeine Zellviabilität oder das Assaysignal haben; berücksichtigen Sie daher mögliche unspezifische Effekte. Vergleichen Sie die Reduktion, die mit einem experimentellen UTR-Ziel beobachtet wurde, mit der Reduktion, die mit einer Housekeeping- oder zufälligen Kontrollsequenz T beobachtet wurde, wie hier dargestellt.

Die PONC- und arid three B-human-three-prime-URS-Elemente sind Zielstrukturen des let-7a-Mikro-RNAsignals. Signale aus humanen three-prime-UTR-Reportern für die PUNC- und arid three B-Gene werden in Gegenwart des let-7a-Mikro-RNA-Mimetikums signifikant herunterreguliert, während Signale für Housekeeping- und zufällige Sequenz-URS dies nicht tun. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine erfolgreiche Cotransfektion von Mikro-RNA-Mimetika und three-prime-UTR-Reporter-Konstrukten in lebenden Zellen durchführt und das Signal mittels Luminometer misst, um die Signalunterdrückung zu bestimmen.