Name: Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit dem LightSwitch Luciferase Assay System microRNA-Ziele in menschlichen Zellen validieren. Diese Methode nutzt 3'UTR-Reporter-Konstrukte und microRNA-Mimics zur funktionellen Analyse von Genregulation.

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Einführung MicroRNAs wurden als wichtige Regulatoren der Genexpression, die die Aktivität von vielen wichtigen biologischen Prozessen modulieren entstanden. Mit mehr als 700 Menschen miRNAs bisher 1 identifiziert, ist es nicht verwunderlich, dass Mutationen und unsachgemäße Regulierung von miRNAs auf eine Vielzahl von physiologischen Störungen wie Krebs und Herzerkrankungen 2,3 verbunden worden sind. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Mehrheit der miRNA regulatorischen Bindungsstellen in 3'UTRs 4,5 gefunden werden, und einige Forscher haben geschätzt, dass es Hunderte von Zielen pro miRNA in der Zelle 6. Angesichts der biologischen Bedeutung von miRNAs, die große Zahl von miRNAs, die es gibt und die große Anzahl von Zielen für jeden von ihnen, ist es entscheidend, dass die Forscher in der Lage, zuverlässig zu identifizieren endogenen Ziele von miRNAs, vorzugsweise auf Plattformen zugänglich High-Throughput-Studien sind. Unter Ausnutzung Computational Tools wie miRBase, TargetScan und PicTar 1,6,7 ist eine leistungsstarke Möglichkeit, Listen von vermeintlichen mRNA Ziele für jede miRNA zu generieren, sind die Vorhersagen noch nicht genau genug, um auf allein 8 herangezogen werden. Deshalb haben die Forscher auch nutzen eine Reihe von experimentellen Ansätzen, um Ziele de novo zu identifizieren oder prognostizierten Ziele zu überprüfen. Viele Teams haben sich auf High-Throughput-Maßnahmen der steady-state mRNA oder Protein-Ebene verlassen, um Gene für die Expression ändert sich, wenn miRNA-Aktivität gestört wird 4,9,10 identifizieren. Solche Veränderungen sind zweifellos biologisch sinnvoll und stellen einen wichtigen ersten Schritt, aber die Messung von Veränderungen in insgesamt Ausdruck nicht zwischen direkten Auswirkungen einer miRNA unterscheiden auf ein Transkript und indirekte oder nachgeschalteten Signalwirkung. Weitere leistungsstarke Werkzeuge, die Beweise für unmittelbare miRNA-mRNA Interaktionen sind Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Strategien, die Cross-Link-Argonaut-Proteine ​​(und damit die RISC-Komplex), um miRNAs und mRNAs, wenn die Identifizierung der Interaktionspartner nicht sofort zeigen die funktionellen Auswirkungen eine solche Bindung bei 5,11. So haben 3'UTR-Reporter-Assays, die funktionelle Beweise für eine miRNA-Effekt auf einen bestimmten UTR bieten zu einem wichtigen Bestandteil einer gründlichen miRNA-Studie. Solche Zell-basierte Assays Daten zusammen mit Computational Ziel Vorhersagen oder Ausdruck und Proteomik-Daten übernommen bietet starke Beweise dafür, dass eine bestimmte 3'UTR direkt durch die miRNA von Interesse geregelt. In einem 3'UTR-Reporter-Assay ist der 3'UTR von einem Gen von Interesse, um das Ende eines Luciferase-Reportergen fusioniert. Wenn die 3'UTR ist ein Ziel von miRNA wird der Reporter-Transkript Stabilität und / oder ihre Übersetzung Effizienz mit einer Variation in der funktionellen miRNA-Konzentration ändern. So anders als Transkript-only basierte Assays, helfen Reporter-Assays identifizieren Wirkungen sowohl auf die steady state mRNA und Protein-Ebene. Reporter-Systeme können auch verwendet werden, um die funktionalen Auswirkungen der Mutagenese einer vermeintlichen miRNA-Bindestelle in einer 3'UTR zu bestätigen, dass es erforderlich ist, für die interaction8 studieren. Und während groß angelegte Studien mit Expressions-Arrays, Proteomik Techniken und Argonaut ChIP wertvolle genomweite Daten für eine kleine Anzahl von experimentellen Bedingungen, zellbasierte Reporter-Assays liefern, sind die meisten zugänglich Scaling-up für das Studium der miRNA-3 ' UTR Interaktionen in Hunderte oder Tausende von Bedingungen, wie könnte es für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen oder andere Bibliothek-basierte Effektoren notwendig. Viele Wissenschaftler haben Reporter-Assay-Technologie, um die Untersuchung von miRNA-3'UTR Wechselwirkungen angewendet. Doch mit der Idee, dass viele miRNAs jedes Ziel Hunderte von verschiedenen Abschriften, es wurde für die Forscher schwierig, diese leistungsfähigen Ansatz auf einem High-Throughput-Skala verwenden, da das Klonen, Validierung und Optimierung Schritte zum Erstellen Tausende von verschiedenen 3'UTR- Reporter Vektoren sind oft kostspielig. In dem Bemühen, kleine und große 3'UTR-Reporter Studien zugänglich zu jedem Forscher zu machen, haben wir eine genomweite Sammlung menschlicher 3'UTRs in die hoch-optimierte LightSwitch Luciferase Assay System vor geklonten erstellt. Der Reporter-System beinhaltet auch validierten Vektoren, einen Satz von mehr als 700 synthetische miRNA Ziel-Reporter-Konstrukte für die Verwendung als positive Kontrollen, sowie eine Reihe von standardisierten experimentellen Protokolle. Mit dem folgenden Protokoll, können Sie fragen, ob ein bestimmtes menschliches 3'UTR ein Ziel Ihrer miRNA von Interesse ist. Die entscheidenden Schritte in diesem Workflow werden experimentelle Design, die Transfektion von Reporter-Konstrukte und miRNA imitiert, Luciferase-Reporter-Assays und Datenanalyse. Für die experimentelle Design, ist es wichtig, nachdenklich wählen Sie eine transfizierbare Zelllinie, Experimental-und Kontrollgruppe Reporter-Konstrukte, und miRNA imitiert und nicht-Targeting-Kontrollen. Gemeinsame hoch transfizierbare adhErent Zelllinien wie HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, und andere, oft gut mit diesem Protokoll. Wichtige Hinweise zum experimentellen Design Die LightSwitch Luciferase Assay System ist ein voll optimiertes Reporter-System, das GoClone Konstrukte unter Verwendung der RenSP Luciferase-Gen und LightSwitch Luciferase Assay Reagenzien enthält. Verwenden Sie alle Komponenten des LightSwitch System als empfohlen, um eine optimale Reporter-Assay Ergebnisse zu erhalten. Co-Transfektion von Oligos / Plasmide mit Schaltanlagen GoClone Reporter-Konstrukte reduziert insgesamt Luciferase-Signale in einem nicht-spezifischen Art und Weise. Deshalb ist es wichtig, die nach der Transfektion Kombinationen ausführen: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Unsere empty_3UTR Vektor (starken Promotor, keine UTR) bietet eine sehr hohe Luciferase-Signal und dient als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz und eine synthetische miRNA Ziel-Reporter Vektor kann als positive Kontrolle für mimische Aktivität dienen. Darüber hinaus empfehlen wir die Verwendung des GoClone 3'UTR Hauswirtschaft Kontrollen und stichprobenartige Kontrollen für die präzise Trennung von Sequenz-spezifische vs unspezifische Effekte. Study Ihr Protokoll und wann immer möglich zu machen Mastermixen, um die Variabilität in Ihrer Daten durch Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu verringern. Dieses Protokoll verwendet DharmaFect Duo Transfektionsreagenz (Dharmacon). Tag 1 Wichtiger Tipp: Wählen Sie Ihre Zelllinie mit Bedacht aus. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit einer Zelllinie, die bekanntermaßen transfizierbare ist. Wir haben auch festgestellt, dass die messbare Reaktion eines 3 'UTR-Reporter zu einem miRNA imitieren gedämpft wird in Zell-Linien mit hohen endogenen, dass insbesondere miRNA. Wenn Sie nicht wissen, wie viel Ihr Zellinie exprimiert miRNA, versuchen SGG ist synthetische microRNA Ziel, die indirekt misst die Häufigkeit eines bestimmten miRNA in einer Zelle als auch darüber informiert, wie der dynamische Bereich des Assays. 1. Seed-Zellen zu ≥ 80% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erhalten. <ol><li> Seed-Zellen in einer 96-well weißen TC Platte in 100 &amp;mgr; l Gesamtvolumen. </li><li> In parallel, Saatgut der entsprechenden Anzahl von Zellen in einer klaren 96-Well-Platte für die Beurteilung der Mündung. </li></ol> WICHTIGER TIPP 1: Confluence ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen in einer mimischen Experiment. Für eine optimale Zuschlag sollten die Zellen zu 100% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden. WICHTIGER TIPP 2: Verwenden niedrigen Durchgang Zellen für die besten Ergebnisse. Zellen, die zu oft haben passagiert eher lauten Transfektion Daten zu erhalten. Tag 2 Bereiten GoClonereporter Konstrukte und miRNAs, dann in die konfluenten Zellen zu transfizieren. 2. Bereiten Konstrukte <ol><li> Thaw GoClone Konstrukte (Plasmid-DNA) bei Raumtemperatur. Gut mischen. </li><li> Zentrifuge, um Kondensation von der Kappe entfernen. </li></ol> 3. Bereiten Micro RNAs <ol><li> Thaw microRNAs (spezifische Mimik und non-targeting-Kontrollen) bei Raumtemperatur und zentrifugieren, um Kondensation von den Kappen zu entfernen. </li><li> Verdünnen, um eine funktionierende Konzentration von 2 nM in RNase-freiem Wasser. </li></ol> Zusätzlich zu einer experimentellen miRNA imitieren immer ein non-targeting miRNA-Steuerung. Co-Transfektion ein Plasmid und ein kleines RNA-Oligo führt zu geringeren Signal als Transfektion der Plasmid allein. Fügen Sie einen oder mehrere positive Kontrollen. Erwägen Sie die Verwendung einer der Hunderten von synthetischen miRNA Ziel-Reporter-Vektoren in SGG-Katalog. Fügen Sie eine oder mehrere negative oder unspezifische Kontrollen. SGG hat eine Reihe von Kontrollen einschließlich 3 'UTRs von Housekeeping-Genen, zufällige Fragmente und / oder die leere (kein UTR insert) zu kontrollieren. Die Verwendung von einem oder mehreren dieser Kontrollen neben einem experimentellen Aufbau ermöglicht es Ihnen, für alle nicht-spezifische Effekte auf die Überexpression von Ihren spezifischen miRNA oder die Nicht-Targeting Kontrolle zu normalisieren. 4. Bereiten Transfektionen <ol><li> Für jede Transfektion kombinieren die folgenden Reagenzien für einen einzigen Test: </li></ol> Mischung 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuelle GoClone Reporter: </td><td> 3,33 ul </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Variiert * </td></tr><tr><td> Serum-freien Medien: </td><td> bis 10 ul </td></tr></tbody></table> * Effektive Konzentration der miRNA kann von 10 nM-100 nM variieren. Consult miRNA Hersteller für entsprechende Konzentration. Wichtiger Tipp: Fügen Sie nicht zu viel zu imitieren. Ein vernünftiger Bereich für imitieren Konzentrationen 10-50 nm in den letzten 100 ul Reaktion. Führen Sie mindestens drei Replikate Transfektionen für jede Behandlung / UTR Kombination und zusätzliche Volumen für das Pipettieren Fehler erlauben. Zum Beispiel, multiplizieren Sie die einzelnen Reaktionsvolumina von 3,5 bis genug Transfektion Mix für 3 replizieren Transfektion Brunnen inklusive Verlängerung zum Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu bekommen. Für jeden Reporter, Einrichten Wiederholungen für die folgenden: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Set up Transfektionen für das Targeting microRNA zur gleichen Zeit wie die für eine nicht-Targeting zu kontrollieren. <ol start="2"><li> Make up der DharmaFECT DUO (Dharmacon)-Gemisch wie folgt für jede Transfektion: </li></ol> Mischung 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 ul </td></tr><tr><td> Serum freie Medien: </td><td> 9,85 ul </td></tr></tbody></table> Die Höhe der DharmaFECT Duo hinzugefügt werden kann Zelllinie abhängig sein. Die oben angegebenen Mengen sind für HT1080-Zellen. Wenden Sie sich an die Dokumentation des Herstellers, um den entsprechenden Betrag für Ihre Zelllinie zu bestimmen. Tipp: Machen Sie einen großen Transfektion Mischung durch Multiplikation der Mengen von mehr als durch die Zahl der Journalisten, repliziert die Anzahl und die Anzahl der miRNAs getestet werden. Bei der Berechnung der Höhe der Transfektion Mix zu erstellen, sollten Sie eine kleine Menge extra für Pipettierfehler und Verdunstung Konto gehören. <ol start="3"><li> Lassen Sie die DharmaFECT Duo Mischung bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. </li><li> Nach 5 Minuten, fügen Sie 10 &amp;mgr; l der DharmaFECT Duo-Gemisch (Gemisch 2) für jeden vorbereitet Rohr 10uL Plasmid-und / oder miRNA (Gemisch 1). Jedes Rohr sollte dann enthalten ein Volumen von 20 &amp;mgr; l pro Wiederholung Transfektion. </li><li> Inkubieren jeder Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 20 Minuten, fügen Sie 80 ul vorgewärmtes (37 ° C), Antibiotika-freien, vollständigen Medien je Wiederholung in jedes Röhrchen für eine Gesamtmenge von 100 &amp;mgr; l pro Wiederholung Transfektion. Ein Deep-Well-Block kann für die Herstellung von vielen Wiederholungen und Proben gleichzeitig verwendet werden. Mischen Sie die Lösung durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie die gesetzte Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Zellen mindestens 80% konfluent sind. </li><li> Sorgfältig Pipette aus den Medien von jeder Vertiefung. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der Transfektion Gemisch (20 ul DNA / Reagenzienmix + 80uL Medien) in jede Vertiefung. </li><li> Legen Sie Platte in Inkubator über Nacht. </li></ol> Nicht zu bebrüten. Die meisten imitiert wird zu signifikanten Ergebnisse auf bona fide Ziele innerhalb von 24 Stunden. Das Niveau der Repression messbare nach 48 Stunden kann größer sein, aber so wird das auch gut Variabilität. Mimic Experimente sind einfacher als Inhibitor Experimente. Während die meisten imitiert deutlich unterdrücken wird wahr Ziele innerhalb von 24 Stunden, erhebliche de-Repression auf die Inhibitor kann 48 Stunden messbar sein und wird fast immer weniger ausgeprägt als die Wirkung des zu imitieren. Tag 3 Hinweis: Luciferase-Assays können sofort durchgeführt werden oder die Platten können bei -80 ° C eingefroren werden (Einfrieren der Regel erhöht Zelllyse und Luciferase-Signal). Einfrieren und Auftauen Ihre Zellen vor Testbeginn für beste Ergebnisse. REMEMBER auf gefrorenen Zellen auftauen auf Raumtemperatur lassen, bevor Sie LightSwitch Assay Reagent. 5. Messen Sie die Luciferaseaktivität mit LightSwitch AssayReagents <ol><li> Entfernen Platte von Inkubator und auf Raumtemperatur bringen. </li><li> Bereiten LightSwitch Assay Reagenzien (für LS010-Kit, Protokolle von anderen Kit Größen können online gefunden werden): <ol><li> Rekonstituieren 100X Substrat durch Zugabe von 100 &amp;mgr; l des Substrats Solvent zu Tube lyophilisiert Assaysubstrat. Vor Licht und möglichst wenig Zeit bei Raumtemperatur. 100X Substrat kann bei -20 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch wiederhergestellten Substrat. </li><li> Bereiten Assay-Lösung durch Auftauen 10ml Flasche Assay-Puffer bei Raumtemperatur Wasserbad und fügen 100 &amp;mgr; rekonstituierter 100X Substrat vor dem Gebrauch. Gut mischen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein Multi-Kanal-Pipette auf 100 &amp;mgr; LightSwitch Assay-Lösung (Puffer + Substrat) direkt zu jeder Probe gut (mit 100 ul Zellen + Medien) in einem weißen 96-Well-Platte hinzufügen. Wenn Zellen wurden in einer anderen Platte oder Kolben-Format übertragen Proben gewachsen um einen weißen 96-Well-Platte in 100 &amp;mgr; l Gesamtvolumen (Medien oder PBS). </li><li> Abdeckplatte, vor Licht zu schützen, und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bei Testung mehr als eine Platte, taumeln Zugabe von Assay-Lösung, so dass jede Platte für 30 Minuten vor dem Lesen brütet. </li><li> Lesen Sie jede gut für 2 Sekunden in eine Platte lumiLuminometer (SpectraMax L oder gleichwertig). </li><li> Berechnen Sie den Zuschlag durch die Berechnung Luciferase-Signal-Verhältnis für jedes Konstrukt für spezifische miRNA über die nicht-Targeting-Steuerung (Lumineszenz = spezifische miRNA / non-targeting-Steuerung). Verwenden Sie die Daten aus Haushalt, zufällige und leere Konstrukte für Nicht-UTR spezifische Behandlung Effekte zu steuern. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse 3'UTR Ziele in der Gegenwart eines Targeting-miRNA zeigen Luciferase Zuschlag. Der Knockdown von 3'UTR-Luciferase-Reporter-Aktivität durch let-7a wurde in HT1080-Zellen durch Co-Transfektion von 100 ng von jedem Reporter gemessen Konstrukt mit 20nm let-7a imitieren oder nicht-Targeting-Kontrolle, Inkubation für 24 Stunden, dann liest der Lumineszenz-Reporter Signal mit LightSwitch Luciferase Assay-Reagenzien. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Punktiert und ARID3B menschlichen 3'UTRs sind die Ziele des let-7a microRNA. Signale von menschlichen 3'UTR-Reporter für die punktiert und ARID3B Gene sind deutlich in der Gegenwart des let-7a microRNA klopfte imitieren, während Signale für Hauswirtschaft und zufälliger Reihenfolge UTRs nicht.

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Die Autoren sind Mitarbeiter von Schaltanlagen Genomics, die Werkzeuge und Reagenzien erscheinen in diesem Artikel machen. Die Produktion dieser Artikel wurde von Schaltanlagen Genomics gesponsert.

Wir haben eine genomweite Sammlung von pre-geklonten menschlichen 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte geschaffen, um Studien von miRNA-3&#39;UTR Interaktionen in lebenden Zellen zu ermöglichen. Hier haben wir eine reproduzierbare und High-Throughput-Methode für die Co-Transfektion miRNA ahmt mit 3&#39;UTR-Reporter mit einem Luciferase-Reporter-System gezeigt. Diese Methode basiert auf Forscher mit Hilfe eines hoch transfizierbare Zelllinie und störende miRNA-Aktivität mit einer Überexpression Technik. Forscher mit schlecht transfizierbare Zelllinien können sollten Sie unser Begleiter lentiviralen 3&#39;UTR-reporter-Sammlung in Verbindung mit Sigma (Mission 3&#39;UTR Lenti GoClones) erstellt. Die Behandlung der Zellen mit miRNA imitiert führt zu einer Überexpression Typ Experiment, und mit einer solchen Studie, Forscher ist zu berücksichtigen, dass dies kann, muss aber nicht die tatsächlichen physiologischen Bedingungen. Um eine Überexpression betrifft, können die Forscher miRNA-Inhibitoren zusätzlich zur Mimik verwenden, um die Interaktion mit zwei verschiedenen Arten von Störung 14.12 studieren. Sobald wahrscheinlich miRNA Ziele identifiziert werden, können die Forscher wollen die vermeintliche miRNA Bindungsstellen mutagenisieren, um festzustellen, ob die Websites, die für die funktionelle Wechselwirkung sind. Sie können auch wollen Maßstab bis hin zur Prüfung Hunderte von verschiedenen potenziellen Ziel UTRs (Boutz). Darüber hinaus, wenn Forscher interessiert, ob die miRNA ist betroffen Transkriptstabilität oder Übersetzung Effizienz sind, kann Luciferase-Reporter-Daten an Maßnahmen der steady-state-Transkript Ebenen verglichen werden. Jede Änderung in Luciferase-Signal, das nicht mit einer proportionalen Änderung in Transkripten verbunden werden, um einen Effekt aus der Währungsumrechnung Effizienz Punkt. Schließlich können Forscher nutzen Reporter-Vektoren erzeugen eine Dosis-Wirkungs-Kurve der relativen Empfindlichkeit der verschiedenen UTRs Änderungen in miRNA-Konzentration 14 Vergleichen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Verkäufer </td><td> Catalog Number </td></tr><tr><td> Weiß-Zellkulturplatten (96-well mit festem Boden) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Klare Zellkulturplatten (96-well) mit Deckel </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch Luciferase Assay Reagent </td><td> Schaltanlagen </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfektionsreagenz (0,75 ml) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010 bis 02 </td></tr><tr><td> Foil Platte Dichtungsband </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Atmungsaktive Platte Dichtungsband </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Platte Luminometer </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifizierung von zielen für menschenrechte micrornas mit dem lightswitch luciferase assay system mit 3&#39;utr-reporter-konstrukte und eine microrna mimic in adhärenter zellen

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und spielen eine Rolle in vielen biologischen Prozessen. Mehr als 700 Menschen miRNAs wurden bisher mit jeweils bis zu Hunderte von einzigartigen Ziel-mRNAs identifiziert. Computational Tools, Meinungs-und Proteomics-Assays und Chromatin-Immunopräzipitation-basierte Techniken liefern wichtige Hinweise zur Identifizierung mRNAs, die direkten Ziele eines bestimmten miRNA sind. Darüber hinaus haben 3&#39;UTR-Reporter-Assays zu einem wichtigen Bestandteil einer gründlichen miRNA Ziel-Studien, da sie funktionelle Beweise für und bieten Quantifizierung der Auswirkungen von spezifischen miRNA-3&#39;UTR Interaktionen in einer Zelle-basiertes System. Um mehr Forscher zu nutzen 3&#39;UTR-Reporter-Assays und die Scale-up von solchen Assays mit hohem Durchsatz Ebenen zu unterstützen, haben wir eine genomweite Sammlung menschlicher 3&#39;UTR Luciferase Reporter in der hoch optimierten LightSwitch Luciferase erstellt Testsystem. Das System beinhaltet auch synthetische miRNA Ziel-Reporter-Konstrukte für die Verwendung als positive Kontrollen, verschiedene endogene 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte, und eine Reihe von standardisierten experimentellen Protokolle. Hier beschreiben wir eine Methode zur Co-Transfektion von einzelnen 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte zusammen mit einem miRNA nachahmen, ist eine effiziente, reproduzierbare und zugänglich Analyse mit hohem Durchsatz.

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Mikro-RNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und spielen eine Rolle in vielen biologischen Prozessen. Mehr als 700 menschliche miRNAs wurden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Reporterkonstrukte gemeinsam mit einem Mikro-RNA-Mimetikum zu transfizieren, um vorhergesagte Mikro-RNA-Ziele in humanen 3'-UTRs zu validieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein experimenteller Aufbau geplant wird, der die Auswahl einer Zelllinie sowie die Auswahl von Mikro-RNA-Mimetika zusammen mit experimentellen und Kontroll-3'-UTR-Go-Clone-Reporterkonstrukten umfasst. Die adhärenten Zellen werden anschließend etwa 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, jedes experimentelle oder Kontroll-3'-UTR-Go-Clone-Reporterkonstrukt gemeinsam mit einem Mikro-RNA-Mimetikum oder einem nicht-zielgerichteten Kontrollmimetikum zu transfizieren, gefolgt von einer Inkubation von 24 bis 48 Stunden. Im letzten Schritt wird das Light-Switch-Luciferase-Assay-Reagenz direkt den Zellen und der Kultur zugegeben, und das lumineszente Signal wird mit einem Plattenluminometer gemessen.Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, welche menschlichen 3'-UTRs Ziele eines bestimmten microRNA sind, durch die Messung der Luciferase-Signalunterdrückung mit Reporter-Assay-Technologie. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen für microRNA-Forscher zu beantworten, da sie einen funktionellen Assay bereitstellt, um vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen microRNA und 3'-UTR-Zielsequenzen in lebenden Zellen zu validieren. Das experimentelle Design beginnt mit der Auswahl einer geeigneten, hoch transfectierbaren Zelllinie; Assays mit microRNA-Mimetika funktionieren am besten in Zelllinien mit niedrigen endogenen Expressionsspiegeln der microRNA.Danach wählen Sie das Mikro-RNA-Mimetikum und das Paar mit dem Nicht-Ziel-Kontrollmimetikum aus; die Einbeziehung einer Nicht-Ziel-Kontrolle ist entscheidend, da die gleichzeitige Transfektion eines Plasmids und eines kleinen RNA-Oligos zu einem geringeren Signal führt als die Transfektion des Plasmids allein. Anschließend wählen Sie die vorklonierten 3'-UTR-GoClone-Reporter-Konstrukte aus der genomweiten Sammlung von Switchgear aus. Rufen Sie den Online-Katalog auf und klicken Sie auf die UTR-Suchschaltfläche.Nach Eingabe der Liste von Gen-Namen, Gen-Symbolen oder Zugangsnummern liefert die Suche Vektor- und Sequenzinformationen zusammen mit dem Bestandsstatus. Wählen Sie nun die Kontroll-Reporter-Konstrukte aus. Wählen Sie Kontrollkonstrukte mit drei primen ur, die unwahrscheinlich durch die gewählte microRNA gezielt werden, wie beispielsweise housekeeping-urs oder zufällige Fragmente, um unspezifische Effekte der Überexpression von microRNA auf die allgemeine Zellgesundheit oder das Assaysignal auszuschließen.Erwäge zudem die Verwendung eines synthetischen Mikro-RNA-Zielreporters als positiven Kontrollversuch für die Mimic-Aktivität an Tag eins mit niedrigem Passagegrad auf adhärenten Zellen, sodass sie 24 Stunden später zur Transfektion 80 bis 100 % konfluent sind. Die Verwendung hochkonfluenter Zellen ist entscheidend, um gute Ergebnisse zu erzielen. Säte die Zellen in einer weißen 96-Well-Zellkulturplatte in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern aus.Gleichzeitig. Überprüfen Sie die geeignete Anzahl von Zellen in einer klaren Platte auf plötzliche Konfluenz am Tag 2, 24 Stunden nach der Zellansaat. Bereiten Sie das Auftauen für die Transfektion vor.Reporter-Konstrukte und micro-RNAs bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen gründlich mischen und die micro-RNAs in RNA-freiem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von zwei Mikromolar verdünnen. Goplasmid-DNA wird mit 30 Nanogramm pro Mikroliter geliefert und muss nicht weiter verdünnt werden. Zur Herstellung des Transfektionsgemischs beachten, dass jede DNA-RNA-Kombination im Dreifachansatz transfiziert werden sollte; das Volumen ist entsprechend der Anzahl der durchzuführenden Assays hochzurechnen.Erstellen Sie die Transfektionsreagenz-Mischung, indem Sie 9,85 µL serumfreies Medium und 0,15 µL DharmaFECT DUO pro Transfektion kombinieren. Lassen Sie die Mischung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Erstellen Sie anschließend für jeden Assay die DNA-RNA-Mischung, indem Sie 3,33 µL des GoClone-Reporter-Konstrukts mit ausreichend microRNA-Mimetikum kombinieren, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen.Füllen Sie das Volumen mit serumfreiem Medium auf 10 Mikroliter auf. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Transfektionsreagenz-Mischung zu 10 Mikrolitern jeder DNA-RNA-Mischung hinzu und mischen Sie gründlich. Das Endvolumen beträgt für jeden Assay 20 Mikroliter.Gut abdecken und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 80 Mikroliter vorgewärmtes, antibiotikafreies komplettes Medium hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Einzelwell zu erreichen, was zu Endkonzentrationen der Mimetika zwischen 10 und 15 Nanomolar führt.Als letzten Schritt entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen mit beimpften Zellen und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter der entsprechenden endgültigen Transfektionsmischung. Stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie 24 bis 48 Stunden. Die meisten Mischungen zeigen innerhalb von 24 Stunden signifikante Ergebnisse.Eine 48-stündige Inkubationszeit führt zu einer höheren Variation von Signal zwischen den einzelnen Vertiefungen. Am Tag 3, 24 Stunden nach der Transfektion, führen Sie Luciferase-Assays mit Light-Switch-Luciferase-Assay-Reagenzien durch. Die Zellen können sofort oder nach Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden. Durch den Einfrier- und Auftauzyklus wird die Zelllyse verstärkt und das Reporter-Signal erhöht. Bringen Sie die Platte mit den transfizierten Zellen auf Raumtemperatur.Dann bereiten Sie die Light-Switch-Luciferase-Assay-Lösung gemäß den Anweisungen des Kits vor und geben Sie sie in ein steriles Reservoir. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette jeweils 100 Mikroliter der Light-Switch-Assay-Lösung direkt zu jeder Probe. Gut in die weiße 96-Loch-Platte geben, die Platte vor Licht schützen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation fortfahren.Lesen Sie jeden Wells für zwei Sekunden mit einem Platten-Luminometer aus. Die Hemmung der Luciferase-Reportergenaktivität im dreifachen UTR durch let-7a wurde in HT-1080-Zellen mittels Cotransfektion jeder Reporterkonstruktion mit einem let-7a-Mimetikum oder einem nicht-zielgerichteten Kontrollmittel gemessen. Zur Analyse der Ergebnisse wurde das Signal der nicht-zielgerichteten Kontrolle für jeden Konstrukt als 100 % angenommen.Berechnen Sie die prozentuale Reduktion, indem Sie das Signal des spezifischen Mikro-RNA-Mimetikums durch das Signal der Nicht-Zielkontrolle teilen. Ein bestimmtes Mikro-RNA-Mimetikum kann unspezifische Effekte auf die allgemeine Zellviabilität oder das Assaysignal haben; berücksichtigen Sie daher mögliche unspezifische Effekte. Vergleichen Sie die Reduktion, die mit einem experimentellen UTR-Ziel beobachtet wurde, mit der Reduktion, die mit einer Housekeeping- oder zufälligen Kontrollsequenz T beobachtet wurde, wie hier dargestellt.Die PONC- und arid three B-human-three-prime-URS-Elemente sind Zielstrukturen des let-7a-Mikro-RNAsignals. Signale aus humanen three-prime-UTR-Reportern für die PUNC- und arid three B-Gene werden in Gegenwart des let-7a-Mikro-RNA-Mimetikums signifikant herunterreguliert, während Signale für Housekeeping- und zufällige Sequenz-URS dies nicht tun. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine erfolgreiche Cotransfektion von Mikro-RNA-Mimetika und three-prime-UTR-Reporter-Konstrukten in lebenden Zellen durchführt und das Signal mittels Luminometer misst, um die Signalunterdrückung zu bestimmen.

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Biology

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