Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3'UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Reporterkonstrukte mit einer Mikro-RNA-Nachahmung zu transfizieren, um vorhergesagte microRNA-Ziele in menschlichen drei Prime-Ts zu validieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein experimentelles Design festgelegt wird, einschließlich der Auswahl einer Zelllinie und der Auswahl von Mikro-RNA-Nachahmungen sowie experimentellen und kontrollierten drei Prime-UTR-Go-Klon-Reporterkonstrukten. Die Adhärenzzellen werden dann etwa 24 Stunden vor der Transfektion platziert. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, jedes experimentelle oder Kontrollkonstrukt mit drei Prime-UTR-Go-Klon-Reportern mit einer micro-RNA-Nachahmung oder Nicht-Ziel- und Kontroll-Konstrukt zu transfizieren, gefolgt von einer 24- bis 48-stündigen Inkubation. Als letzter Schritt wird das Reagenz des Lichtschalter-Luziferase-Assays direkt in die Zellen und die Kultur gegeben und das Lumin-Duftsignal auf einem Plattenluminometer abgelesen.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, welche drei menschlichen Urs Ziele einer gegebenen Mikro-RNA sind, indem der Luciferase-Signal-Knockdown mit der Reporter-Assay-Technologie gemessen wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen für Mikro-RNA-Forscher zu beantworten, da sie einen funktionellen Assay zur Validierung der vorhergesagten Wechselwirkungen der drei wichtigsten UTR-Zielinteraktionen von Mikro-RNA in lebenden Zellen bietet. Das Versuchsdesign beginnt mit der Auswahl eines geeigneten, hochgradig transfikten Adhärenz-Zelllinien-basierten Mikro-RNA-Imic-basierten Assays, die am besten in Zelllinien mit niedrigen endogenen Expressionsniveaus der Mikro-RNA funktionieren.

Wählen Sie dann das Mikro-RNA-Mimik- und das Nicht-Ziel-Kontrollpaar aus, einschließlich einer Nicht-Ziel-Kontrolle, da die Durchtrennung eines Plasmids und eines kleinen RNA-Oligos zu einem geringeren Signal führt als die Durchtrennung des Plasmids allein. Wählen Sie als Nächstes die drei Prime UTR Go Klon-Reporter-Konstrukte vor dem Klon aus der genomweiten Sammlung von Switchgears aus. Gehen Sie zum Online-Katalog und klicken Sie auf die Schaltfläche UTR-Suche.

Nach Eingabe der Liste der Gennamen, Gensymbole oder Zugangsnummern enthält das Suchergebnis Vektor- und Sequenzinformationen sowie den Inventarstatus. Wählen Sie nun die Konstrukte des Steuerelementreporters aus. Wählen Sie Kontrollkonstrukte mit drei Primzahlen, die wahrscheinlich nicht von der ausgewählten Mikro-RNA angegriffen werden, wie z. B. Housekeeping, Urs oder zufällige Fragmente, um unspezifische Auswirkungen einer Mikro-RNA-Überexpression auf die allgemeine Zellgesundheit oder das Assay-Signal zu kontrollieren.

Erwägen Sie auch die Verwendung eines synthetischen Mikro-RNA-Zielreporters als Positivkontrolle für die mimische Aktivität von Zellen mit geringer Adhärenz am ersten Tag des Samens, so dass sie 24 Stunden später für die Transfektion zu 80 bis 100 % konfluent sind. Die Verwendung von hochkonfluenten Zellen ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen. Aussäen Sie die Zellen in einer weißen 96-Well-Gewebekulturplatte mit 100 Mikrolitern Gesamtvolumen.

Parallel dazu. Sehen Sie sich die entsprechende Anzahl von Zellen in einer durchsichtigen Platte für eine plötzliche Konfluenz an Tag 2 24 Stunden nach dem Zellsitz an. Bereiten Sie sich auf das Auftauen der Transfektion vor.

Klonen Sie Reporterkonstrukte und Mikro-RNAs bei Raumtemperatur. Nach dem Auftauen, gut vermischt, verdünnen Sie die microRNAs auf eine Arbeitskonzentration von zwei Mikromolaren in RNAs, freies Wasser, Goon-Plasma-DNA wird mit 30 Nanogramm pro Mikroliter abgegeben und erfordert keine weitere Verdünnung. Bei der Herstellung der Transfektionsmischung ist zu berücksichtigen, dass jede D-N-A-R-N-A-Kombination in dreifacher Ausführung transfiziert werden sollte, das Volumen sollte skaliert werden, um die Anzahl der durchgeführten Assays zu berücksichtigen.

Stellen Sie die Transfektionsreagenzmischung her, indem Sie 9,85 Mikroliter serumfreies Medium und 0,15 Mikroliter Dharma-Effekt-DUO pro Transfektion kombinieren. Lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Erstellen Sie dann die D-N-A-R-N-A-Mischung für jeden Assay, indem Sie 3,33 Mikroliter des go-Klon-Reporterkonstrukts mit genügend Mikro-RNA-Nachahmung kombinieren, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen.

Bringen Sie das Volumen mit serumfreien Medien auf 10 Mikroliter. Kombinieren Sie anschließend 10 Mikroliter der Transfektionsreagenzmischung mit 10 Mikrolitern jeder D-N-A-R-N-A-Mischung und mischen Sie sie gut. Für jeden Assay ergibt sich ein Endvolumen von 20 Mikrolitern.

Gut abdecken und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 80 Mikroliter vorwärmte antibiotikafreie Flüssigkeit hinzufügen. Vollständige Medien für ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Einzelvertiefung werden getestet, was zu endgültigen mimischen Konzentrationen zwischen 10 und 15 Nanomolar führt.

Entfernen Sie als letzten Schritt vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung der ausgesäten Zellen und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter der entsprechenden endgültigen Transfektionsmischung. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie 24 bis 48 Stunden lang. Der größte Teil der Mischung führt innerhalb von 24 Stunden zu signifikanten Ergebnissen.

Eine Inkubationszeit von 48 Stunden führt zu einer höheren Variation des Signals von Bohrung zu Bohrung. An Tag 3, 24 Stunden nach der Transfektion, können Luziferase-Assays mit Lichtschalter-Luciferase-Assay-Reagenzien durchgeführt werden. Die Zellen können sofort oder bei minus 80 Grad Celsius eingefroren und später untersucht werden. Das Hinzufügen des Gefrier-Auftau-Zyklus führt zu einer verbesserten Zelllyse und einem höheren Reportersignal. Bringen Sie die Platte mit den transfizierten Zellen auf Raumtemperatur.

Bereiten Sie dann die Luziferase-Assay-Lösung mit Lichtschalter gemäß den Anweisungen des Kits vor und gießen Sie sie in ein steriles Reservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter Light-Switch-Assay-Lösung direkt in jede Probe zu geben. Decken Sie die weiße 96-Well-Platte ab, schützen Sie sie vor Licht und inkubieren Sie sie nach der Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Lesen Sie jede Welle für zwei Sekunden auf einem Platten-Luminometer, der Knockdown von drei primen UTR Luciferase Reporteraktivität durch LE sieben A wurde in HT 10 80 Zellen von cot gemessen. Durchschneiden Sie jedes Reporterkonstrukt mit einem let seven A-Nachahmungs- oder Nicht-Ziel-Steuerelement, um die Ergebnisse zu analysieren. Betrachten Sie das Signal des Nicht-Ziel-Steuerelements als 100 % für jedes Konstrukt.

Berechnen Sie den prozentualen Knockdown, indem Sie das Signal von der spezifischen Mikro-RNA-Nachahmung durch das Nicht-Ziel-Steuersignal dividieren. Jede gegebene Mikro-RNA-Nachahmung kann unspezifische Auswirkungen auf die Gesamtlebensfähigkeit der Zellen oder das Assay-Signal haben, um unspezifische Effekte zu korrigieren. Vergleichen Sie den mit einem experimentellen UTR-Ziel beobachteten Knockdown mit dem Knockdown, der bei der Haushaltsführung oder der Zufallskontrolle T beobachtet wurde, wie hier gezeigt.

Die PONC und die ariden drei B-Gene des Menschen mit drei Prime-Urs sind Ziele der let-seven-A-microRNA-Signale von humanen drei prime-UTR-Reportern für die PUNC- und ariden drei B-Gene werden in Gegenwart der let-seven-A-micro-RNA-Mimik signifikant ausgeschaltet. Während Signale für Housekeeping und Zufallssequenz URS nicht sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein erfolgreiches Kinderbett, die Transfektion von microRNA-Nachahmungen und drei erstklassige UTR-Reporterkonstrukte in lebenden Zellen einrichten und das Signal auf dem Luminometer ablesen, um den Signal-Lockdown zu messen.