Name: Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie eine zweistufige Affinitätschromatographie zur Reinigung rekombinanter Proteine mit einem kleinen bispezifischen Tag. Diese Methode ermöglicht effiziente Proteinreinigung für anspruchsvolle Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Projekt wurde durch die Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Schwedischen Forschungsrat finanziert.

1. Die Klonierung der Target gene/ABDz1-tagged Fusionskonstrukt <ol><li> Bereiten PCR Fragmente der ABDz1 Gen durch geeignete Restriktionsschnittstellen für N-terminale Ligation des Zielgens in das Expressionsplasmid (ein Plasmid, das ABDz1 ist frei verfügbar durch ein Material Transfer Agreement) flankiert. </li><li> Cleave gereinigt Expressionsvektor und PCR-Fragmente mit ausgewählten Restriktionsenzymen in einem geeigneten Reaktions-Puffer. Purify die Produkte vor der Ligation. </li><li> Ligieren des eingeschränkten ABDz1 Fragment in den Expressionsvektor mit dem Gen von Interesse und verwandeln das Ligationsprodukt zu E. coli (in der ursprünglichen Methode der RR1ΔM15 Stamm wurde 8 verwendet). Spread-transformierten Zellen auf Agarplatten mit geeigneten Antibiotika zur Auswahl ergänzt. </li><li> PCR-Bildschirm ein paar Kolonien und die Sequenz überprüft die resultierende Expressionskassette durch DNA-Sequenzierung. </li><li> Bereiten Sie aus einer Übernachtkultur einer Sequenz verif PlasmidIED Kolonie und zu transformieren, um die bevorzugte Ausdruck Dehnung (in der ursprünglichen Methode E. coli Rosetta (DE3), präsentiert ein PRARE Plasmid für die Produktion von Proteinen durch menschliche Gene kodiert zu verbessern, wurden verwendet). </li></ol> 2. Proteinexpression <ol><li> Impfen einer einzelnen Kolonie in 10 ml CASO-Bouillon mit 5 g / l Hefeextrakt und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubation bei 150 rpm bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Inoculate 1 ml der Übernacht-Kultur in 100 ml frisches Medium und induzieren Proteinexpression (ursprünglich 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid wenn ein lac-Operon verwendet wurde), wenn die Zellen der logarithmischen Wachstumsphase zu erreichen. </li><li> Inkubation bei 150 rpm bei 25 ° C über Nacht und Ernte Zellen durch Zentrifugation. </li></ol> 3. Orthogonal Affinitätsreinigung <ol><li> Das Pellet in 25 ml Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) und stören the-Zellen durch Beschallung bei 60% Amplitude und 1.0/1.0 Impulse für 3 min. Zentrifugieren Sie die Probe und Filter das Zielprotein mit Überstand (0,45 um), bevor eine weitere Reinigung. </li><li> Äquilibrieren entweder eine 1 ml HSA-Sepharose-Säule oder eine NHS-aktivierte Säule, die zuvor mit HSA nach den Empfehlungen des Lieferanten verbunden, mit 10 Säulenvolumen (CV) von Laufpuffer bei 1 ml / min auf einem geeigneten Proteinreinigung System. Laden Sie die Bakterienlysat bei 0,5 ml / min und setzen Sie dann die Durchflussmenge auf 1 ml / min. </li><li> Die Säule wird mit 5 CV von Laufpuffer von 5 CV Waschpuffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5) folgten. </li><li> Eluieren der Probe mit Elutionspuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) bei 1 ml / min und sammeln Fraktionen, Monitor-Absorption bei 280 nm, um Fraktionen aus der eluierte Peak zur weiteren Reinigung aus. </li><li> Pool der Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration verdünnt zwei Mal in SuRe Laufpuffer (20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2) undsicherstellen, dass der pH-Wert liegt bei neutral. Add 1 M Tris-HCl pH 8 bis pH ggf. zu erhöhen. </li><li> Legen Sie die Probe mit 0,5 ml / min auf einer 1 ml HiTrap MabSelect SuRe Spalte, die äquilibriert mit 10 CV von Sure Laufpuffer wurde auf 1 ml / min. Setzen Sie den Durchfluss auf 1 ml / min nach dem Laden. </li><li> Die Säule wird mit 5 CV von Sure Laufpuffer (Schritt 5) und eluieren die Proteine ​​mit 0,2 M HAc, pH 2,7. Für empfindliche Zielproteine ​​das Eluat kann direkt bei der Abholung neutralisiert werden durch Zugabe von Tris-HCl. </li></ol> Wenn die chromatographische Schritte des Eluats von der MabSelect umgekehrt sind sicher Spalte kann in Laufpuffer (Schritt 3,1) verdünnt und der pH-Wert erhöhte sich auf rund 8 durch Zugabe von 1 M Tris-HCl. Im Allgemeinen sind die schmaleren Peaks beobachtet, wenn die SuRe Matrix in der zweiten Stufe eingesetzt wird. 4. Evaluation der Reinheit durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) <ol><li> Legen Sie die gereinigten Fraktionen auf einereduzierenden SDS-PAGE und, falls gewünscht, analysieren das Molekulargewicht des gereinigten Produktes durch Massenspektrometrie. Es ist wichtig, reduzieren Sie die Probe, da ein freies Cystein in ABDz1 kann Dimerisierung des Produktes unter nicht-reduzierenden Bedingungen verursachen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Als proof of principle, war orthogonal Affinitätsreinigung von der ABDz1 tag erleichtert für drei menschliche Zielproteine, die verschiedene Löslichkeit Klassen, Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten (Tabelle 1) ausgewertet. Die ABDz1 Gen gentechnisch war es, die Zielgene fusioniert und die Konstrukte wurden in E. coli exprimiert, zeigt Abbildung 2 ein Flussdiagramm für alle Schritte des Verfahrens nacheinander. Nach der Reinigung durch die orthogonal-Protokoll wurden die Proben an verschiedenen Punkten gesammelt durch SDS-PAGE (Abbildung 3) analysiert. Die Ergebnisse zeigen deutlich den Nutzen einer dualen Tag und zwei hochspezifische Reinigungsschritte. Obwohl angemessene Reinheit achieved nach der ersten Reinigungsstufe als aus den Gelen gesehen, ergibt sich die aufeinander folgenden Schritt ein sehr reines Produkt auch für anspruchsvolle Anwendungen geeignet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Aufbau der kombinatorischen Bibliothek für die Auswahl des bispezifischen ABDz1 Tag verwendet. Die 46 Aminosäuren Albumin-bindende Domäne faltet sich zu einer stabile Drei-Helix-Bündel, und es enthält eine Bindungsstelle für humanes Serumalbumin vor allem auf die zweite Helix liegt. Durch gentechnisch randomizing elf ausgesetzte Oberfläche Aminosäuren in der ersten und dritten Helix befindet, wurde eine neuartige bindende Oberfläche entwickelt. Die elf Positionen sind in der Abbildung gezeigt und nummeriert nach Kraulis et al. 9. Nach Biopanning gegen ein Dimer der Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A mit der kombinatorischen Bibliothek auf Phagen exprimiert, die bispezifischen ABDz1 Molekül identifiziert wurde. <img alt='"Bild' src='"/' files> Abbildung 2. Ein vereinfachtes Flussdiagramm für die orthogonal Affinitätsreinigung Protokoll. Ein PCR-Fragment, welches das ABDz1 Sequenz ligiert (N-terminal) mit einem Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Das Ligationsprodukt ist E. verwandelt coli für Sequenz-Verifikations-und Plasmid-Präparation. Nach der Transformation zu einem Ausdruck Host ist ein groß angelegtes Kultur für Expression rekombinanter Proteine ​​aus einer ersten Nacht-Kultur gesetzt. Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und lysiert durch Beschallung zu Bakterienlysat mit dem Zielprotein zu produzieren. Nach einer Filtration, um restliche feste Partikel zu entfernen, wird das Lysat orthogonal Affinitätsreinigung auf einem Liquid-Handling-System durchläuft zwei Reinigungsschritten hintereinander unterzogen. Eluierten Peaks von beiden Reinigungsschritte werden abgetastet und ausgewertet durch SDS-PAGE auf Reinheit zu bewerten und im Vergleich zu ter Lysat vor der Reinigung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. SDS-PAGE-Analyse von Target-Proteinen exprimiert und gereinigt in Fusion mit ABDz1. Die Proben aus dem bakteriellen Lysat aus drei Proteinen in Fusion mit ABDz1, die verschiedene Eigenschaften und die ABDz1 Tag selbst zur Kenntnis genommen wurden zusammen mit Proben aus den entsprechenden Peaks von Reinigung über eine HSA-Spalte durch eine MabSelect Sure-Spalte gefolgt gesammelt (A) . Spuren 1-4 repräsentieren Proben aus Lysaten vor der Reinigung, Spur 5-8 von der HSA-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 9-12 aus dem MabSelect SuRe Reinigung (zweiter Schritt). ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 und ABDz1: Die Proben sind in der folgenden Reihenfolge geladen. Darüber hinaus wurden die Proben aus dem gleichen Lysaten in umgekehrter Reihenfolge auf die gleichen Spalten gereinigt erworben analysiert (B). Bahnen 1-3 stellen Beispiele aus Lysaten vor der Reinigung, Spuren 4-6 from MabSelect Sure-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 7-9 von HSA-Reinigung (zweiter Schritt). Die Proben wurden in der gleichen Reihenfolge wie in (A), aber der Tag selbst ist nicht im Lieferumfang enthalten geladen. Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, dass dieses zweistufige Verfahren hochreine Proteine ​​liefert unabhängig von der Reihenfolge, in der die Schritte angewendet werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Name b </td><td> Zielprotein UniProt c </td><td> Molecular Gewicht (kDa) </td><td> Löslichkeit Klasse d </td><td> Molekulargewicht der Fusion Produkt (kDa) </td><td> Isoelektrischen Punkt von Fusionsprodukt </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Molekulargewicht von ABDz1 Tag allein ist 6,3 kDa, isoelektrischer Punkt 6.7. </li><li> Zielprotein stellt einen Teil der UniProt Protein. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Löslichkeit Klasse von Protein-Fragment mit N-terminalen His 6 ABP 10. </li></ol> Tabelle 1. Zielproteine ​​und Fusion-Produkte mit ABDz1 Tag ein in einem Proof of Principle-Studie ausgewertet. Drei einzigartige menschliche Proteine ​​mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt wurden zur Expression und Reinigung durch die orthogonale Affinität Ansatz gewählt.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die orthogonale Affinitätsreinigung Protokoll hier vorgestellten ermöglicht eine effiziente Reinigung einer Vielzahl von Target-Proteinen. Durch die Kombination der inhärenten Bindungsstelle des Albumin-bindende Domäne mit einem neuartigen bindende Oberfläche wurde eine kleine bispezifische Protein-Tag entwickelt. Es ist sehr einfach mit dem Tag nutzen, da es einfach geklont werden kann und ausgedrückt in Fusion auf jedes Protein von Interesse in jeder gewünschten Expressionsvektor. Verfügbare Standardausstattung in den meisten Labors können für die Zwei-Schritt-Protein Reinigung eingesetzt werden. Da die Funktion des ABDz1 Tag hängt die korrekte Faltung der Domäne, effizient aufzudecken seinen zwei bindenden Oberflächen, ist die Methode, um Proteine ​​in löslicher Form exprimiert begrenzt und nicht für Reinigungen unter denaturierenden Bedingungen geeignet. Reduktionsmittel sollten auch vermieden werden, da sie stören die Bindung von ABDz1 der Z-Domäne auf dem MabSelect SuRe Matrix. Orthogonal-Affinität ReiniTION bietet eine sinnvolle Alternative zu herkömmlichen Methoden, um die Anforderungen von hoch gereinigten Proteinen in vielen anspruchsvollen Anwendungen gerecht zu werden. Gleichzeitig wird durch diese Methode die Notwendigkeit für die kombinatorische Tagging, wenn unterschiedliche Reinigungsverfahren Strategien in Folge verwendet werden. Für Anwendungen, die eine native Zielprotein kann eine Protease-Spaltstelle eingeführt, um die enzymatische Entfernung der ABDz1 Tag möglich 11 zu rendern. Darüber hinaus ist die ABDz1 Tag das erste bispezifische kleine und gefaltete Protein-Domain bisher beschriebenen. Es ist einzigartig, da es eine Reinigung Strategie, die auf zwei Zielgruppen spezifische Affinität Interaktionen hängt bietet. In Zukunft wäre es interessant, dieses Konzept durch die Entwicklung neuartiger bispezifischer Tags, die neue Bindung Oberflächen, die mit leicht verfügbar und preiswert Chromatographieharze sind, tragen zu erweitern. Zum Beispiel durch den Austausch der Aminosäuren in Albumin-Bindung beteiligt mit basischen Resten, ein Tag mit iauf Austausch-Chromatographie dürfte erreichbar sein. Ein ähnliches Konzept hat sich bewährt, um tags wie Z-Säure 12 und Z 13 kompatibel mit grundlegenden Anionen-und Kationenaustausch bekannt zu erzeugen, die jeweils durch Ladung Engineering der Z-Domäne.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> CASO-Bouillon </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Hefeextrakt </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Vibra Zelle Sonicator </td><td> Sonics und Materialien </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Ehemalige Produkt </td></tr><tr><td> HiTrap MabSelect SuRe </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-activated HP Säule </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification von einer kleinen bispezifische affinity tag facilitated

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Aufgrund der hohen Kosten, die mit Aufreinigung von rekombinanten Proteinen die Protokolle müssen rationalisiert werden verbunden. Für High-Throughput-Anstrengungen besteht eine Nachfrage nach allgemeinen Methoden, die keine Zielprotein spezifischen Optimierung 1. Um dies zu erreichen, sind Reinigung Tags, die genetisch mit dem Gen von Interesse fusioniert werden üblicherweise 2 verwendet. Die am weitesten verbreitete Affinität Griff ist der Hexa-Histidin-Tag, der geeignet für die Reinigung unter nativen und denaturierenden Bedingungen 3. Die metabolische Belastung für die Herstellung der tag ist gering, aber es funktioniert nicht so hohe Spezifität als konkurrierende Affinitätschromatographie Strategien 1,2 bereitzustellen. Hier ein bispezifischer Reinigung tag mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen auf einem 46 Aminosäure, hat kleine Protein-Domäne entwickelt. Die Albumin-bindende Domäne von Streptokokken-Protein G abgeleitet und verfügt über eine starke inhärenten Affinität zu humanem Serumalbumin(HSA). Elf Oberflächen-exponierten Aminosäuren, nicht in albuminbindenden 4 genannten Aufgaben wurden genetisch randomisiert einer kombinatorischen Bibliothek zu erzeugen. Das Protein-Bibliothek mit dem Roman zufällig angeordnet bindende Oberfläche (Abbildung 1) wurde am Phagenpartikel ausgedrückt, um die Auswahl von Bindemitteln durch Phagen-Display-Technologie zu erleichtern. Durch mehrere Runden von Biopanning gegen ein dimeres Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A 5, ein kleines, bispezifische Molekül mit einer Affinität zu HSA und der Roman Ziel war 6 identifiziert abgeleitet. Das neue Protein-Domäne, die so genannte ABDz1, wurde als eine Reinigung tag für eine Auswahl von Target-Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt bewertet. Drei Zielproteine ​​wurden in Escherishia coli mit dem Roman tag fusioniert, um ihre N-Termini und danach affinitätsgereinigte ausgedrückt. Erste Reinigung entweder auf eine Säule mit immobilisiertem HSA oder Z-Domäne führte zu relatiVely reinen Produkten. Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung mit dem bispezifischen Tag führte zu einer deutlichen Verbesserung der Protein-Reinheit. Chromatographische Medien mit der Z-Domäne immobilisiert, zum Beispiel MabSelect Klar, sind leicht zugänglich für die Reinigung von Antikörpern und HSA kann leicht chemisch Medien gekoppelt werden, um die zweite Matrix liefern. Diese Methode ist besonders vorteilhaft, wenn es eine hohe Nachfrage auf Reinheit des gewonnenen Zielprotein. Die Bifunktionalität der Tag können zwei verschiedene chromatographische Schritte verwendet werden, während die metabolische Belastung auf die Expression Host beschränkt ist aufgrund der geringen Größe des Tags. Es bietet eine wettbewerbsfähige Alternative zu so genannten kombinatorischen Tagging, wo mehrere Tags in Kombination 1,7 verwendet werden.

Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Aufgrund der hohen Kosten, die mit der Reinigung rekombinanter Proteine verbunden sind, müssen die Protokolle rationalisiert werden. Für High-Throughput-Ansätze gibt es einen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mittels einer zweistufigen Affinitätsreinigung sehr reine rekombinante Proteine herzustellen. Dazu wird ein bispezifisches Reinigungstag, das auf einer Albumin-bindenden Domäne basiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der das Gen der Interesse enthält, woraufhin das Fusionsprotein in e coli exprimiert wird. Im zweiten Schritt wird das bakterielle Lysat, das das Zielprotein enthält, einer Reinigung an einer chromatographischen Säule mit immobilisiertem humanem Serumalbumin oder HSA unterzogen.Anschließend erfolgt eine zusätzliche Reinigung an einer MAB select superior resistance- oder Sure-Säule, die eine immobilisierte Z-Domäne aus dem Staphylokokken-Protein A enthält. Dies führt zu einem hochreinen Produkt, das für anspruchsvolle Anwendungen geeignet ist. Danach wird die Reinheit durch SDS-Page und gegebenenfalls Massenspektrometrie überprüft, um sicherzustellen, dass das Protein von Interesse erfolgreich bis zur Homogenität gereinigt wurde. Die Ergebnisse zeigen eine effiziente Reinigung nach zwei aufeinanderfolgenden Schritten im Vergleich zu einem einzelnen Schritt mit dem in diesem Protokoll verwendeten neuartigen bifunktionellen Reinigungstag. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der einkomponentigen Affinitätsreinigung besteht darin, dass mithilfe eines einfachen Protokolls reines Protein unter Verwendung nur eines einzigen Affinitäts-Handles unabhängig von den Eigenschaften des Zielproteins erhalten werden kann.Diese Methode kann für Proteine mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften verwendet werden. Da der Tag außerdem sehr klein ist, wird er leicht vom bakteriellen Wirt produziert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Aufreinigungsverfahren neu sind, es als sehr einfach und unkompliziert empfinden.Ein entscheidender Schritt besteht darin, den pH-Wert Ihrer Probe anzupassen, bevor sie auf die zweite Säule aufgetragen wird. Ein kleiner Reinigungstag mit zwei inhärenten Affinitäten wurde entwickelt, indem eine zusätzliche Bindungsstelle in eine bereits bestehende, aus dem streptokokkalen Protein G stammende Albumin-bindende Domäne eingefügt wurde. Die 46 Aminosäuren umfassende Albumin-bindende Domäne falten sich zu einem stabilen Dreihelix-Bündel und enthält eine Bindungsstelle für humanes Serumalbumin, die hauptsächlich auf der zweiten Helix lokalisiert ist. Durch genetische Randomisierung von 11 oberflächenexponierten Aminosäuren in der ersten und dritten Helix wurden neue Bindungsflächen konstruiert. Mehrere Runden von Biopanning gegen eine Diametrie-Zoma, die aus dem staphylokokkalen Protein A abgeleitet ist, mithilfe einer kombinatorischen Bibliothek, die auf Phagen exprimiert wurde, führten zu einem bispezifischen Molekül, das als A BDZ eins bezeichnet wird und Affinität sowohl für HSA als auch für die Z-Domäne besitzt. Um das Plasmid für den bispezifischen Fusions-Tag herzustellen, bereiten Sie PCR-Fragmente des A BDZ-eins-Gens vor, flankiert von geeigneten Restriktionsstellen für die Insertion am Anfang und am Ende des Zielgens im Expressionsplasmid. Schneiden Sie die A BDZ-eins-PCR-Fragmente und den gereinigten Expressionsvektor, der das Gen von Interesse enthält, mit den gewählten Restriktionsenzymen in einem geeigneten Reaktionspuffer und reinigen Sie die Produkte vor der Ligierung.Ligieren Sie anschließend das restriktionierte A-BDZ-Ein-Fragment in den Expressionsvektor, der das Gen von Interesse enth&auml;lt, und transformieren Sie das Ligationsprodukt in e coli. Streichen Sie die transformierten Zellen auf Agarplatten, die mit geeigneten Antibiotika zur Selektion erg&auml;nzt wurden. F&uuml;hren Sie eine PCR-Analyse einiger Kolonien durch und &uuml;berpr&uuml;fen Sie die resultierende Expressionskassette mittels DNA-Sequenzierung.Schließlich bereiten Sie das Plasmid aus einer Übernachtkultur einer sequenzverifizierten Kolonie vor und transformieren es in den bevorzugten Expressionssstamm, um das Zielprotein zu exprimieren. Mit dem neuartigen Tag, der an das terminale Ende fusioniert ist, impfen Sie zunächst eine einzelne bakterielle Kolonie in 10 Milliliter Tryptych-Soja-Brühe, ergänzt mit fünf Gramm pro Liter Hefeextrakt und den geeigneten Antibiotika, und inkubieren über Nacht bei 150 U/min und 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag impfen Sie ein Milliliter der Übernachtkultur in 100 Milliliter frisches Medium und induzieren die Proteinsynthese.Wenn die Zellen die exponentielle Wachstumsphase erreichen. Nach der Proteininduktion die Zellen über Nacht bei 150 U/min und 25 Grad Celsius inkubieren, am nächsten Tag durch Zentrifugation ernten. Die orthogonale Affinitätsreinigung des A-BDZ1-Fusionsproteins erfolgt durch eine erste Reinigung an einer Säule mit immobilisiertem HSA oder Zoma. Anschließend wird ein weiterer Reinigungsschritt unter Verwendung der zweiten Affinität des biklonalen Tags durchgeführt.Chromatographische Medien mit immobilisierter Z-Domäne, wie beispielsweise MA select sure, sind leicht verfügbar zur Reinigung von Antikörpern. Während HSA chemisch an Medien gekoppelt werden kann, um die zweite Matrix für die orthogonale Affinitätsreinigung bereitzustellen, resuspendieren Sie das Pellet in 25 Milliliter Laufpuffer. Anschließend lysieren Sie die Zellen durch Beschallung bei 60 % Amplitude mit Impulsen von jeweils einer Sekunde Dauer, gefolgt von einer einsekündigen Pause, insgesamt drei Minuten lang.Nach der Zentrifugation der Probe filtrieren Sie das Zielprotein, das sich im Überstand befindet, durch einen 0,45-Mikron-Filter, bevor Sie die weitere Reinigung durchführen. Danach equilibrieren Sie eine Ein-Milliliter-HSA-Sphäros-Säule oder eine mit HSA gekoppelte NHS-aktivierten Säule mit 10 Säulenvolumina Laufpuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute an einem geeigneten Proteinaufreinigungssystem. Sobald die Säule equilibriert ist, geben Sie das bakterielle Lysat mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute auf die Säule, stellen die Flussrate anschließend wieder auf einen Milliliter pro Minute ein und waschen die Säule mit fünf Säulenvolumina Laufpuffer, gefolgt von fünf Säulenvolumina Waschpuffer.Eluieren Sie die Probe mit Elutionspuffer bei einem Milliliter pro Minute und sammeln Sie die Fraktionen. Überwachen Sie die Absorption bei 280 Nanometern, um Fraktionen aus dem eluierten Peak auszuwählen. Für eine weitere Reinigung vereinigen Sie die Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration und verdünnen Sie diese anschließend zweifach.Stellen Sie sicher, dass der Laufpuffer verwendet wird, und überprüfen Sie, ob der pH-Wert annähernd neutral ist. Dieser Schritt ist entscheidend für die Bindung des Proteins an die Z-Domäne. Geben Sie bei Bedarf einmolares Tris-HCl, pH 8, hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen.Als Nächstes wird die Probe mit 0,5 Milliliter pro Minute auf eine MA-Hochladesäule mit einer Milliliter Kapazität aufgebracht, die zuvor mit Sure-Puffer vorgespült wurde. Nachdem die Flussrate auf einen Milliliter pro Minute zurückgesetzt wurde, wird die Säule mit fünf Säulenvolumina Sure-Laufpuffer gewaschen. Anschließend werden die Proteine mit 0,2 molarer Essigsäure, pH 2,7, für empfindliche Zielproteine eluiert.Das EIT kann direkt nach der Sammlung durch Zugabe von T Tris neutralisiert werden. Die H-C-L-S-D-S-Seite kann zur Beurteilung der Proteintreine verwendet werden. Es ist wichtig, die Probe vollständig zu reduzieren, da ein freies Cyte in A BDZ zu einer Dimerisierung des Produkts unter nicht reduzierenden Bedingungen führen kann.Im letzten Schritt kann das Molekulargewicht des gereinigten Produkts mittels Massenspektrometrie analysiert werden, nachdem eine Reinigung nach dem orthogonalen Protokoll an einer HSA-Säule und anschließend an einer MA select sure-Säule durchgeführt wurde. Verschiedene Proben, die an mehreren Reinigungsschritten gesammelt wurden, wurden mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Proben umfassten das AB DZ one-Tag selbst sowie drei verschiedene humane Zielproteine, die an AB DZ one fusioniert waren und unterschiedliche Löslichkeitsklassen, Molekulargewichte und isoelektrische Punkte repräsentierten.Die Gelen 1 bis 4 zeigen Proteinlysate vor der Reinigung für die drei verschiedenen AB-DZ1-Fusionsproteine und den AB-DZ1-Tag selbst. Die Gelen 5 bis 8 zeigen die Ergebnisse des HSA-Reinigungsschritts der Proteine. Schließlich stammen die Gelen 9 bis 12 aus dem abschließenden mABs select Sure-Reinigungsschritt.Außerdem wurden hier Proben analysiert, die aus denselben Lysaten gewonnen wurden, die in umgekehrter Reihenfolge auf denselben Säulen gereinigt worden waren. Die Gelen in den Spuren eins bis drei zeigen Lysate vor der Reinigung, während die Spuren vier bis sechs nach dem ersten Reinigungsschritt an der MAB Select Sure-Säule entnommen wurden. Die Produkte hoher Reinheit in den Spuren sieben bis neun resultieren aus der abschließenden HSA-Reinigung.Die Ergebnisse zeigen eindeutig den Nutzen eines Doppeltags und zweier hochspezifischer Reinigungsschritte. Obwohl nach dem ersten Reinigungsschritt, wie anhand der Gele ersichtlich, bereits eine beachtliche Reinheit erreicht wird, liefert der nachfolgende Schritt ein sehr reines Produkt, das sich hervorragend für anspruchsvolle Anwendungen eignet. Sobald der zentrale Reinigungsschritt dieser Methode beherrscht ist, kann eine Person innerhalb weniger Stunden ein hochreines rekombinantes Protein herstellen, das für zahlreiche unterschiedliche Anwendungen geeignet ist.Beispielsweise können die nach diesem Verfahren gereinigten Biomoleküle für andere Anwendungen verwendet werden, wie etwa Interaktionsstudien, um Fragen hinsichtlich der Bindungsstärke eines Komplexes zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe dieses dualen Affinitäts-Tags ein tatsächlich reines Proteinprodukt erhält.

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Wir beschreiben ein Verfahren zur affinitätsmarkiert Reinigung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung Probenbehandlungstafel Robotik. Dieses Verfahren ist allgemein anwendbar auf die kleinteilige Reinigung von löslichen Proteinen mit His-Tag in einem Hochdurchsatz-Format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Quelle: Becker, B., et al. Ein einfacher, fluoreszenzbasierter Reporter-Assay zur Identifizierung zellulärer Bestandteile, die für den Transport von Ricintoxin A-Kette (RTA) in Hefe benötigt werden. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Reinigung eines polyhistidin-markierten rekombinanten Proteins mittels nickelbasierter Affinitätschromatographie. Es beschreibt wichtige Schritte, darunter bakterielle Lyse durch Sonikation, Klärung und Filtration des Lysats sowie selektive Bindung...

 Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

In diesem Video demonstrieren wir die Nickel-Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase-Enzymen aus Clostridium difficile-Bakterien.

Proteinreinigung auf Basis der Nickel-Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Polyhistidin-markierten rekombinanten Proteinen aus bakteriellem Zelllysat

In dem vorliegenden Protokoll, zeigen wir eine hocheffiziente und kostengünstige kleine Proteinreinigungsverfahren, die die Reinigung von rekombinanten Proteinen ermöglicht dank einer einzigartigen Kombination eine spaltbare GST-Tag und einen kleinen His-Tag.

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Die Methode der Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) wurde ausgiebig verwendet, um native Komplexe aus zellulärem Extrakt, hauptsächlich eukaryotisch, für die Proteomik zu isolieren. Hier stellen wir ein TAP-Methodenprotokoll vor, das für die Aufreinigung von nativen Komplexen für Strukturstudien optimiert ist.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Bei diesem Verfahren wird ein DsRed-basierter Epitopligand immobilisiert, um als Alternative zu Protein A ein hochselektives Affinitätsharz für den Abscheidung monoklonaler Antikörper aus rohen Pflanzenextrakten oder Zellkulturüberbleibsanten herzustellen.

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Affinitätsreinigung eines humanen rekombinanten Proteins, der Lappen-Endonuklease 1 (FEN1), vor, das mit einem 6X-Histidin-Tag markiert wurde. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei unterschiedlichen immobilisierten Metallionensäulen für die Aufreinigung des markierten Proteins.

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System 

Lernen Sie eine zweistufige Affinitätschromatographie zur Reinigung rekombinanter Proteine mit einem kleinen bispezifischen Tag. Diese Methode ermöglicht effiziente Proteinreinigung für anspruchsvolle Anwendungen.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Weitere Videos entdecken