Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mittels einer zweistufigen Affinitätsreinigung sehr reine rekombinante Proteine herzustellen. Dazu wird ein bispezifisches Reinigungstag, das auf einer Albumin-bindenden Domäne basiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der das Gen der Interesse enthält, woraufhin das Fusionsprotein in e coli exprimiert wird. Im zweiten Schritt wird das bakterielle Lysat, das das Zielprotein enthält, einer Reinigung an einer chromatographischen Säule mit immobilisiertem humanem Serumalbumin oder HSA unterzogen.

Anschließend erfolgt eine zusätzliche Reinigung an einer MAB select superior resistance- oder Sure-Säule, die eine immobilisierte Z-Domäne aus dem Staphylokokken-Protein A enthält. Dies führt zu einem hochreinen Produkt, das für anspruchsvolle Anwendungen geeignet ist. Danach wird die Reinheit durch SDS-Page und gegebenenfalls Massenspektrometrie überprüft, um sicherzustellen, dass das Protein von Interesse erfolgreich bis zur Homogenität gereinigt wurde. Die Ergebnisse zeigen eine effiziente Reinigung nach zwei aufeinanderfolgenden Schritten im Vergleich zu einem einzelnen Schritt mit dem in diesem Protokoll verwendeten neuartigen bifunktionellen Reinigungstag. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der einkomponentigen Affinitätsreinigung besteht darin, dass mithilfe eines einfachen Protokolls reines Protein unter Verwendung nur eines einzigen Affinitäts-Handles unabhängig von den Eigenschaften des Zielproteins erhalten werden kann.

Diese Methode kann für Proteine mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften verwendet werden. Da der Tag außerdem sehr klein ist, wird er leicht vom bakteriellen Wirt produziert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Aufreinigungsverfahren neu sind, es als sehr einfach und unkompliziert empfinden.

Ein entscheidender Schritt besteht darin, den pH-Wert Ihrer Probe anzupassen, bevor sie auf die zweite Säule aufgetragen wird. Ein kleiner Reinigungstag mit zwei inhärenten Affinitäten wurde entwickelt, indem eine zusätzliche Bindungsstelle in eine bereits bestehende, aus dem streptokokkalen Protein G stammende Albumin-bindende Domäne eingefügt wurde. Die 46 Aminosäuren umfassende Albumin-bindende Domäne falten sich zu einem stabilen Dreihelix-Bündel und enthält eine Bindungsstelle für humanes Serumalbumin, die hauptsächlich auf der zweiten Helix lokalisiert ist. Durch genetische Randomisierung von 11 oberflächenexponierten Aminosäuren in der ersten und dritten Helix wurden neue Bindungsflächen konstruiert. Mehrere Runden von Biopanning gegen eine Diametrie-Zoma, die aus dem staphylokokkalen Protein A abgeleitet ist, mithilfe einer kombinatorischen Bibliothek, die auf Phagen exprimiert wurde, führten zu einem bispezifischen Molekül, das als A BDZ eins bezeichnet wird und Affinität sowohl für HSA als auch für die Z-Domäne besitzt. Um das Plasmid für den bispezifischen Fusions-Tag herzustellen, bereiten Sie PCR-Fragmente des A BDZ-eins-Gens vor, flankiert von geeigneten Restriktionsstellen für die Insertion am Anfang und am Ende des Zielgens im Expressionsplasmid. Schneiden Sie die A BDZ-eins-PCR-Fragmente und den gereinigten Expressionsvektor, der das Gen von Interesse enthält, mit den gewählten Restriktionsenzymen in einem geeigneten Reaktionspuffer und reinigen Sie die Produkte vor der Ligierung.

Ligieren Sie anschließend das restriktionierte A-BDZ-Ein-Fragment in den Expressionsvektor, der das Gen von Interesse enthält, und transformieren Sie das Ligationsprodukt in e coli. Streichen Sie die transformierten Zellen auf Agarplatten, die mit geeigneten Antibiotika zur Selektion ergänzt wurden. Führen Sie eine PCR-Analyse einiger Kolonien durch und überprüfen Sie die resultierende Expressionskassette mittels DNA-Sequenzierung.

Schließlich bereiten Sie das Plasmid aus einer Übernachtkultur einer sequenzverifizierten Kolonie vor und transformieren es in den bevorzugten Expressionssstamm, um das Zielprotein zu exprimieren. Mit dem neuartigen Tag, der an das terminale Ende fusioniert ist, impfen Sie zunächst eine einzelne bakterielle Kolonie in 10 Milliliter Tryptych-Soja-Brühe, ergänzt mit fünf Gramm pro Liter Hefeextrakt und den geeigneten Antibiotika, und inkubieren über Nacht bei 150 U/min und 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag impfen Sie ein Milliliter der Übernachtkultur in 100 Milliliter frisches Medium und induzieren die Proteinsynthese.

Wenn die Zellen die exponentielle Wachstumsphase erreichen. Nach der Proteininduktion die Zellen über Nacht bei 150 U/min und 25 Grad Celsius inkubieren, am nächsten Tag durch Zentrifugation ernten. Die orthogonale Affinitätsreinigung des A-BDZ1-Fusionsproteins erfolgt durch eine erste Reinigung an einer Säule mit immobilisiertem HSA oder Zoma. Anschließend wird ein weiterer Reinigungsschritt unter Verwendung der zweiten Affinität des biklonalen Tags durchgeführt.

Chromatographische Medien mit immobilisierter Z-Domäne, wie beispielsweise MA select sure, sind leicht verfügbar zur Reinigung von Antikörpern. Während HSA chemisch an Medien gekoppelt werden kann, um die zweite Matrix für die orthogonale Affinitätsreinigung bereitzustellen, resuspendieren Sie das Pellet in 25 Milliliter Laufpuffer. Anschließend lysieren Sie die Zellen durch Beschallung bei 60 % Amplitude mit Impulsen von jeweils einer Sekunde Dauer, gefolgt von einer einsekündigen Pause, insgesamt drei Minuten lang.

Nach der Zentrifugation der Probe filtrieren Sie das Zielprotein, das sich im Überstand befindet, durch einen 0,45-Mikron-Filter, bevor Sie die weitere Reinigung durchführen. Danach equilibrieren Sie eine Ein-Milliliter-HSA-Sphäros-Säule oder eine mit HSA gekoppelte NHS-aktivierten Säule mit 10 Säulenvolumina Laufpuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute an einem geeigneten Proteinaufreinigungssystem. Sobald die Säule equilibriert ist, geben Sie das bakterielle Lysat mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute auf die Säule, stellen die Flussrate anschließend wieder auf einen Milliliter pro Minute ein und waschen die Säule mit fünf Säulenvolumina Laufpuffer, gefolgt von fünf Säulenvolumina Waschpuffer.

Eluieren Sie die Probe mit Elutionspuffer bei einem Milliliter pro Minute und sammeln Sie die Fraktionen. Überwachen Sie die Absorption bei 280 Nanometern, um Fraktionen aus dem eluierten Peak auszuwählen. Für eine weitere Reinigung vereinigen Sie die Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration und verdünnen Sie diese anschließend zweifach.

Stellen Sie sicher, dass der Laufpuffer verwendet wird, und überprüfen Sie, ob der pH-Wert annähernd neutral ist. Dieser Schritt ist entscheidend für die Bindung des Proteins an die Z-Domäne. Geben Sie bei Bedarf einmolares Tris-HCl, pH 8, hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen.

Als Nächstes wird die Probe mit 0,5 Milliliter pro Minute auf eine MA-Hochladesäule mit einer Milliliter Kapazität aufgebracht, die zuvor mit Sure-Puffer vorgespült wurde. Nachdem die Flussrate auf einen Milliliter pro Minute zurückgesetzt wurde, wird die Säule mit fünf Säulenvolumina Sure-Laufpuffer gewaschen. Anschließend werden die Proteine mit 0,2 molarer Essigsäure, pH 2,7, für empfindliche Zielproteine eluiert.

Das EIT kann direkt nach der Sammlung durch Zugabe von T Tris neutralisiert werden. Die H-C-L-S-D-S-Seite kann zur Beurteilung der Proteintreine verwendet werden. Es ist wichtig, die Probe vollständig zu reduzieren, da ein freies Cyte in A BDZ zu einer Dimerisierung des Produkts unter nicht reduzierenden Bedingungen führen kann.

Im letzten Schritt kann das Molekulargewicht des gereinigten Produkts mittels Massenspektrometrie analysiert werden, nachdem eine Reinigung nach dem orthogonalen Protokoll an einer HSA-Säule und anschließend an einer MA select sure-Säule durchgeführt wurde. Verschiedene Proben, die an mehreren Reinigungsschritten gesammelt wurden, wurden mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Proben umfassten das AB DZ one-Tag selbst sowie drei verschiedene humane Zielproteine, die an AB DZ one fusioniert waren und unterschiedliche Löslichkeitsklassen, Molekulargewichte und isoelektrische Punkte repräsentierten.

Die Gelen 1 bis 4 zeigen Proteinlysate vor der Reinigung für die drei verschiedenen AB-DZ1-Fusionsproteine und den AB-DZ1-Tag selbst. Die Gelen 5 bis 8 zeigen die Ergebnisse des HSA-Reinigungsschritts der Proteine. Schließlich stammen die Gelen 9 bis 12 aus dem abschließenden mABs select Sure-Reinigungsschritt.

Außerdem wurden hier Proben analysiert, die aus denselben Lysaten gewonnen wurden, die in umgekehrter Reihenfolge auf denselben Säulen gereinigt worden waren. Die Gelen in den Spuren eins bis drei zeigen Lysate vor der Reinigung, während die Spuren vier bis sechs nach dem ersten Reinigungsschritt an der MAB Select Sure-Säule entnommen wurden. Die Produkte hoher Reinheit in den Spuren sieben bis neun resultieren aus der abschließenden HSA-Reinigung.

Die Ergebnisse zeigen eindeutig den Nutzen eines Doppeltags und zweier hochspezifischer Reinigungsschritte. Obwohl nach dem ersten Reinigungsschritt, wie anhand der Gele ersichtlich, bereits eine beachtliche Reinheit erreicht wird, liefert der nachfolgende Schritt ein sehr reines Produkt, das sich hervorragend für anspruchsvolle Anwendungen eignet. Sobald der zentrale Reinigungsschritt dieser Methode beherrscht ist, kann eine Person innerhalb weniger Stunden ein hochreines rekombinantes Protein herstellen, das für zahlreiche unterschiedliche Anwendungen geeignet ist.

Beispielsweise können die nach diesem Verfahren gereinigten Biomoleküle für andere Anwendungen verwendet werden, wie etwa Interaktionsstudien, um Fragen hinsichtlich der Bindungsstärke eines Komplexes zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe dieses dualen Affinitäts-Tags ein tatsächlich reines Proteinprodukt erhält.