Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, geladene Makromoleküle elektrisch in das kraniale Gesichtsmesenchym zu betätigen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesierter Embryo im Stadium 28 in der Elektroporationskammer positioniert wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Lösung, die geladene Makromoleküle enthält, in das kraniofaziale Mesenchym C zu mikroinjizieren.

Darauf folgt schnell das Anlegen eines elektrischen Stroms, wodurch die Ladungsnukleotide in die Zellen der anderen Zellen eingebracht werden. Der letzte Schritt des Eingriffs besteht darin, das elektroporierte Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen im kranialen Gesichtsgewebe zeigen.

Diese Ergebnisse können in vivo oder in fixiertem Gewebe mittels Fluoreszenz, Mikroskopie oder Immunhistochemie analysiert werden. Der Hauptvorteil der Elektroporation gegenüber bestehenden Methoden wie Mikroinjektion und Mutation ist die Gewebe- und Zeitkontrolle unserer molekularen Werkzeuge, wobei unser heutiges Verfahren von Jackie Tabler, einem Postdoc in meinem Labor, demonstriert wird. Das für dieses Verfahren benötigte Paar L-förmiger Elektroden besteht aus hochreinem, 0,4 Millimeter schwerem Wolframdraht, wobei jede Elektrode zuerst acht Zentimeter des Drahtes abschneidet.

Die Verwendung von Kitt wie Blue Tack wirkt sich dann auf eine Ein-Milliliter-Spritze in der Mitte des Wolframdrahts aus, so dass vier Zentimeter Draht von der Spitze der Spritze freiliegen. Biege die Spitze einen Zentimeter vom Ende entfernt in eine L-Form. Schneide die Spitze so ab, dass das Ende 0,5 Zentimeter lang ist.

Diese Spitze ist der Elektrodenabschluss, an dem der überschüssige Wolframdraht parallel zur Spritze geführt wird. Es wird verwendet, um den Elektrodenimpulsgenerator anzuschließen, nachdem die zweite Elektrode hergestellt wurde. Befestigen Sie das Elektrodenpaar mit Klebeband aneinander, so dass der Elektrodenanschluss I parallel verläuft, einen Zentimeter voneinander entfernt.

Befestigen Sie abschließend die Elektroden über Gleichstromkabel an einem Rechteckimpulsgenerator. Um die speziell angefertigte Elektroporationskammer vorzubereiten, legen Sie den Boden einer 90-Millimeter-Schale mit etwa fünf Millimetern ungiftiger Gipsszenen-Modelliermasse aus. Füllen Sie die Schale mit Elektroporationsmedien und tauchen Sie die Gipsszene ein.

Dann schnitzen Sie mit der Uhrmacherzange Nummer fünf eine T-förmige Vertiefung in die Gipsszene, um die Elektroporation zu bilden. Nun, die lange Seite des Bohrlochs sollte etwa zwei Millimeter mal zwei Millimeter mal 10 Millimeter messen, und die kurze Seite sollte zwei Millimeter mal zwei Millimeter mal fünf Millimeter groß sein. Mikropipetten für dieses Verfahren werden aus Silikatglaskapillaren hergestellt.

Verwenden Sie einen Nadelzieher, um Mikropipetten mit einem acht bis 12 Millimeter langen Kegel und einer feinen Spitze vorzubereiten, drücken Sie die Spitze mit einer Pinzette etwa zwei Millimeter von der Spitze entfernt und erzeugen Sie einen gezackten Bruch, um die Mikropipette einzurichten. Füllen Sie es zunächst mit etwa einem Mikroliter Injektionslösung, die in dieser Demonstration fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide enthält. Befestigen Sie anschließend die Mikropipette in einem Mikromanipulator, winkeln Sie die Mikropipette in einem Winkel von 50 Grad zur Tischplatte.

Stellen Sie den Injektionsdruck auf 20 PSI ein und kalibrieren Sie die Mikropipette so, dass 30 Liter pro Impuls injiziert werden. Zur Vorbereitung der Elektroporation betäuben Sie eine Xeno-Larve des Stadiums 28, indem Sie sie fünf Minuten lang inkubieren. In Elektroporationsmedien, bei denen es sich um normale amphibische Medien handelt, die 0,1 % Benzocain enthalten, wird die anästhesierte Kaulquappe in die Elektroporationskammer übertragen.

Diese ist mit Elektroporationsmedien gefüllt. Der kniffligste Teil des Verfahrens ist das Einsetzen des Mikro-Haustiers in die Kaulquappe. Um den Erfolg zu gewährleisten, muss man den Embryo also sehr fest befestigen und dann nach der Mikroinjektion schnell den Strom auftragen.

Positionieren Sie den Embryo innerhalb der langen Vertiefung, so dass der Kopf im T-Übergang aufliegt. Mit der Rückenseite nach unten und der Bauchseite freiliegend sollte der Kopf im Vergleich zum Schwanz mit einer Pinzette leicht angehoben werden, die Kaulquappe in der Vertiefung mit der umgebenden Gipsszene vorsichtig befestigen. Es ist wichtig, die Kaulquappe zu sichern, um zu verhindern, dass sie während der Elektroporation zuckt, was zu schweren Schäden am Gesichtsgewebe führen könnte.

Um diesen Vorgang zu beginnen, führen Sie die Spitze der Mikropipette unmittelbar hinter der Zementdrüse und in den Gesichtsmechanismus ein. Injizieren Sie 30 Nanoliter Lösung in das Mesenchym und ziehen Sie die Mikropipette zurück. Richten Sie die Elektrodenspitzen schnell parallel zum Kopf des Embryos aus und wenden Sie acht 50-Millisekunden-Rechteckimpulse mit 20 Millivolt an.

Ziehen Sie dann die Elektroden mit einer Pinzette zurück. Löse die Kaulquappe vorsichtig aus der Vertiefung. Dann mit einer Pipette die Kaulquappe mit 0,025 Milligramm pro Milliliter auf Dreiviertelnom übertragen.

Gentamycin-Kaulquappen können über Nacht oder länger nach 24 Stunden in diesem Medium inkubiert werden. Schirmen Sie Kaulquappen durch Fluoreszenzmikroskopie für eine effiziente Elektroporation ab. Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen ermöglicht ein einfaches Screening von elektroporierten Embryonen.

Diese Abbildung zeigt eine typische Charge von Morph-Oligonukleotid-elektroporierten Kaulquappen etwa 1248 und 96 Stunden nach der Elektroporation. In den Etappen 30, 34 und 44. Fluoreszierende Morph-Oligonukleotide können in den Stadien 30 und 34 innerhalb des kranialen Gesichts sichtbar gemacht werden.

Im Stadium 44 kann Fluoreszenz in Knorpeln nachgewiesen werden, die durch die weißen Pfeilspitzen angezeigt werden. Der stark autofluoreszierende Bereich ist der Darm. Mit diesem Verfahren können wir die Abstammung von Elektrozellen sowie die molekularen Anforderungen an die interessierenden Proteine verfolgen.

Dieser Ansatz kann mit Live-Bildgebungsverfahren kombiniert werden, um die Genfunktion im Laufe der Zeit während der kraniofazialen Entwicklung zu untersuchen.