Name: Elektroporation von Craniofacial Mesenchym (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Elektroporation von geladenen Makromolekülen in das kraniofaziale Mesenchym von Xenopus laevis-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise in vivo-Manipulationen zur Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind dankbar, dass Nancy Papalopulu und Boyan Bonev für die Unterstützung bei Xenopus Elektroporation. Wir danken auch Marc Dionne für die kritische Durchsicht, Jeremy Green und John Wallingford für hilfreiche Diskussionen und die Mitglieder des Liu-Labor für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem BBSRC (BB/E013872/1) und dem Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) zu KJL finanziert.

Teil 1A. Ausrüstung Mikroskop: aufrecht Stereo-Binokular mit Low-Power-Ziel <ul><li> Spannung / Pulse Generator: BTX ECM 830 Square Wave Elektroporationssystem </li><li> Pipette puller: P-87 Micropipette Puller (Sutter Instrument Company, CA) </li><li> Manipulator: Grob-oder kombinierte Grob-und Fein je nach Zubereitung. </li><li> Micropipette Inhaber: Fine Science Tools </li><li> Elektrode: hausgemachte </li><li> Elektroporation Kammer: homemade </li></ul> L-förmige Elektroden: <ol><li> Cut 8 cm von hochreinem 0,4 mm Wolframdraht (Goodfellow) und bringen sich in der Mitte ein 1ml Spritze mit putty (wir verwenden Blu-Tack). Leave 4 cm Wolframdraht von der Spitze der Spritze und biegen Spitze in L-Form ausgesetzt, 1 cm vom Ende (Abb. 1A). </li><li> Trim Spitze, so dass am Ende 0,5 mm misst in Länge. TSein Tipp ist die Elektrode Terminus. </li><li> Run über Wolframdraht parallel zur Spritze und es verwenden, um die Elektrode Impulsgeber anschließen. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang macht ein Paar von Elektroden. </li><li> Bringen Elektroden Rechteckimpuls-Generator über DC-Kabel. </li></ol> Elektroporation Kammer <ol><li> Den Boden 90 mm Schale mit ca. 5 mm ungiftige Knete. </li><li> Füllen Gericht mit Elektroporation Medien. </li><li> Mit Nr. 5 Uhrmacher-Pinzette schnitzen eine T-förmige Vertiefung (Abb. 2). Die lange gut gemessen werden sollte ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm und die kurzen ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. Die Elektroporation Gericht kann gewaschen und wiederverwendet werden. </li></ol> Teil 1B. Reagenzien DNA oder geladene Makromoleküle <ul><li> Mikropipetten: 1 mm breit 4 "lang Borosilikatglas Kapillaren (WPI, TW100-F) </li><li> Kulturmedien: Normal Amphibian Media (NAM) </li><li> &gt; 10 X Bestand: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> Autoklaven und lagern bei 4 ° C. </li><li> 1 X NAM: Verdünnen von 10x Lager, Puffer mit 0,1 mM NaHCO 3 und 0,2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li> Xenopus laevis Kaulquappen, Stufe 28 </li></ul> DNA-Präparation: <ol><li> Bereiten Expressionsplasmide über Standardprotokolle. </li><li> Resuspendieren DNA auf eine Endkonzentration von 1 ug / ul in Nuklease freies H 2 0. </li></ol> * Wir hatten Erfolg mit Vektoren, die einen starken CMV-Promotor, wie pCS2 + [16]. Für Abstammung Analyse, wir gehören in der Regel DNA, grün fluoreszierende Protein (GFP pCS2 +) bei einer Endkonzentration von 0,1 ug / ul. [DNA-Konzentrationen zwischen 0,1-3 ug / ul wurden ebenfalls getestet. Wir fanden, dass die Konzentrationen unterhalb von 0,8 ug / ul ineffizient markierten Zellen, während DNA-Konzentrationen von mehr als 2 g / m &amp;u; l nicht verbessert Elektroporation Effizienz]. Morpholino Oligonukleotid Zubereitung: (Hinweis:. MOs müssen fluoresceinated werden (3'-Carboxyfluorescein modifiziert) oder anderweitig gegen Gebühr) <ol><li> Resuspendieren Morpholino-Oligonukleotide (MOs) (GeneTools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) in einer Konzentration von 2 mM in Nuklease freies H 2 0. </li><li> Hitze Aliquot der Stammlösung bei 65 ° C für 5 Minuten. </li><li> Verdünnen, um eine Endkonzentration von 0,5 mM in Nuclease freies Wasser. </li></ol> * 0,1-1mM MO-Lösungen getestet. 0,5 mM MO-Lösungen reichten für die Elektroporation von vielen mesenchymalen Zellen. Mikropipetten <ol><li> Bereiten Mikropipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1 mm breit, 4 "lang, WPI-Nr. TW100-F). Verwenden Nadel puller zu Mikropipetten mit einem 8-12 mm langen Kegel und feine Spitze vorzubereiten. </li><li> Crush-Spitze ~ 2 mmVon der Spitze mit einer Pinzette, die Schaffung eines zerklüfteten brechen. </li></ol> Medien <ol><li> Incubation Medien: Bereiten Sie frischen 3 / 4 Normal-Amphibian Media (NAM) von 1x Lager. Add 0,025 mg / ml Gentamycin. </li><li> Elektroporation Medien: wie oben, mit 0,1% Benzocain (Sigma, 06950). </li></ol> 2. Elektroporation Micropipette Setup <ol><li> Füllen Mikropipette mit ~ 1 ul Injektionslösung. </li><li> Sichere Mikropipette in Mikromanipulator und heften sich an Mikroinjektor (Picospritzer II). </li><li> Angle Mikropipette bei 50 ° von der Tischplatte. </li><li> Set Einspritzdruck bei 20 PSI. </li><li> Kalibrieren Mikropipette zu 30 nl pro Puls zu injizieren. </li></ol> Tadpole Vorbereitung <ol><li> Anesthetize Stufe 28 Xenopus Larven durch Inkubation in Elektroporation Medien für 5 Minuten. </li><li> Transfer narkotisierten Kaulquappe in Elektroporation Kammer mit Elektroporation Medien gefüllt. Position Embryoinnerhalb der langen gut, so dass der Kopf in der T-Kreuzung mit dorsalen Seite nach unten und Bauchseite ausgesetzt ruht. Der Kopf sollte leicht im Vergleich zu den Schwanz angehoben werden. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig zu sichern Kaulquappe in gut mit den umliegenden Plastilin. (Hinweis:.. Wenn die Kaulquappen nicht gesichert ist, kann es zucken und Kontaktelektrode bei der Elektroporation In diesem Fall verwerfen die Kaulquappe als Kosmetiktücher schwer beschädigt wird) </li></ol> Elektroporation <ol><li> Legen Sie Mikropipette Spitze unmittelbar hinter der Zement-Drüse und in Gesichts-Mesenchym. </li><li> Inject 30 nl Lösung in Mesenchym. </li><li> Retract Mikropipette. </li><li> Schnell align Elektrodenspitzen parallel zum Kopf des Embryos (Abb. 3). </li><li> Bewerben 8 50 ms, 20mV Rechteckimpulse. </li><li> Retract Elektroden. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig Entlassung aus gut Kaulquappe und Transfer zum 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml Gentamycin. </li><li> Kaulquappen können in 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml Übernacht inkubiert werdenight, oder länger. </li><li> Screen-Embryonen für die effiziente Elektroporation durch Fluoreszenzmikroskopie nach 24 Stunden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen erlaubt eine einfache Screening von Embryonen elektroporiert. Abbildung 4 zeigt eine typische Charge von MO elektroporiert Kaulquappen ~ 12, 48 und 96 Stunden nach der Elektroporation mit 14,5 ° C inkubiert Mit Fluoreszenz-Mikroskopie kann MOs unmittelbar nach der Elektroporation visualisiert werden und bleiben für einige Tage nach der Elektroporation. Nach unserer Erfahrung ist die Fluoreszenz schwach erkennbar im Stadium 46 (ca. 5 Tage später). In den Knorpeln, sinkt dramatisch Fluoreszenz nach dem Beginn der Differenzierung (~ st 42), jedoch besteht MO Fluoreszenz stärker in andere Zelltypen wie der pharyngealen Endoderm. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass Oligonukleotide in mehreren kraniofazialen Gewebe einschließlich Knorpel eingebaut werden. Oligonukleotid-Fluoreszenz ceine oft im Gewebe auf beiden Seiten des Kopfes sichtbar gemacht werden. Dies ist wahrscheinlich auf eine schnelle Diffusion der Injektionslösung während der lose kraniofazialen Mesenchym vor der Elektroporation. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> Abbildung 1 Homemade Elektroden. L-förmige Wolframdraht ist es, eine 1 ml Spritze mit nicht-toxischen oder Kitt befestigt. (A) Die Elektrode terminus misst 5 mm. (B) Befestigen Sie ein Paar von Elektroden, so dass die Enden parallel laufen. Die Elektroden sind an Impulsgeber von DC-Kabel angeschlossen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> Abbildung 2 Elektroporation Kammer. (A) 90 mm-Schale mit Plastilin gesäumt ist mit Medien und eine T-förmige Kammer mit Nr. 5 Uhrmacher-Pinzette geschnitzt gefüllt. (B) Die lange Seite misst 2 mm X 2 mm X10 mmwährend der kurzen misst 2 mm X 2 mm X 5 mm. Der Kopf des Embryos liegt in der T-Kreuzung, Bauchseite auf. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> Abbildung 3 Schematische Darstellung der Elektroporation Verfahren. St. 28 Kaulquappe ist in Elektroporation Kammer platziert, Bauchseite auf. Mikropipette in Gesichts-Mesenchym zugrunde liegenden Zement Drüse eingefügt. Inject. Mikropipette wird entfernt und L-förmigen Elektroden sind parallel ausgerichtet flankierenden den Kopf. Wenden Sie acht 50 ms, 20 mV Rechteckimpulse. Retract Elektroden. Wachsen Kaulquappen zu wünschen Stufen. Visualisieren MOs oder GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> Abbildung 4 Vertreter Kaulquappen 12 (A), 48 (B) und 96 (C) Stunden nach der Elektroporation (Stufen 30, 34 bzw. 44). (A "-B") Fluorescent MO innerhalb kraniofazialen Mesenchym bei Hirsch visualisiert werdenES 30 und 34 Jahren. Fluoreszenz kann in Knorpel im Stadium 44 (Pfeilspitze, C'-C ") nachgewiesen werden. Der Darm ist sehr autofluoreszierenden.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

In diesem Video haben wir die Machbarkeit der Elektroporation-vermittelte Gentransfer in die Gesichts-Mesenchym von Xenopus Kaulquappen nachgewiesen. Mit diesem Ansatz können wir umgehen frühen Entwicklungsstadium Einfluss der Manipulation von Gen-Funktion ermöglicht es uns, spezifische Gewebe zu späteren Zeitpunkten Ziel. Unsere Studien zeigen, dass heterogene Populationen von kraniofazialen mesenchymalen Zellen beeinflusst werden kann, so dass wir Abstammung elektroporiert Zellen sowie Zell-autonome Anforderungen für Proteine ​​von Interesse zu untersuchen. In Kombination mit Live-Bildgebung können wir mit diesem Ansatz Genfunktion Studie über die Zeit, während der kraniofazialen Entwicklung. Dieses neuartige Verfahren hebt die Lenkbarkeit des Xenopus für das Studium der Organogenese. Wir gehen davon aus, dass diese Methode im Großen und Ganzen kann angepasst werden, um Morphogenese und Differenzierung von anderen Geweben sowie zu studieren.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

elektroporation von craniofacial mesenchym

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporation ist eine effiziente Methode der Bereitstellung von DNA und andere geladene Makromoleküle in das Gewebe zu präzisen Zeitpunkten und in genauen Standorte. Zum Beispiel, Elektroporation wurde mit großem Erfolg verwendet worden, um Nerven-und Retina-Entwicklung in Xenopus-Studie, Huhn und Maus 1-10. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass in all diesen Studien, Ermittler wurden nicht gezielt Weichteile. Weil wir in kraniofazialen Entwicklung interessiert sind, passten wir eine Methode zur Gesichts-Mesenchym Ziel. Wenn wir die Literatur gesucht, fanden wir zu unserer Überraschung, nur sehr wenige Berichte über erfolgreiche Gentransfer in Knorpelgewebe. Die meisten dieser Studien waren Gentherapie-Studien, wie siRNA oder Proteinen Lieferung in chondrogene Zelllinien, oder Tiermodellen von Arthritis 11-13. In anderen Systemen, wie Huhn oder eine Maus, die Elektroporation von Gesichts-Mesenchym war eine echte Herausforderung (persönliche KommunikIonen, Dept of Craniofacial Development, KCL). Wir stellten die Hypothese, dass Elektroporation in procartilaginous und knorpeligen Gewebe in Xenopus könnte besser funktionieren. In unseren Studien zeigen wir, dass Gen-Transfer in die Gesichts-Knorpel tritt effizient in einem frühen Stadium (28), wenn das Gesicht Primordium noch von Weichgewebe umfasst vor Knorpel Differenzierung. Xenopus ist ein sehr zugänglicher Wirbeltier-System für die Analyse von kraniofazialen Entwicklung. Kraniofazialen Strukturen sind gut sichtbar in Xenopus als in jedem anderen Wirbeltier-Modell, vor allem weil Xenopus Embryonen extern befruchtet werden mit Hilfe von Analysen der frühesten Stadien, und die Erleichterung leben Bildgebung bei einzelnen Zelle Auflösung, sowie die Wiederverwendung der Mütter 14. Unter Wirbeltieren Modelle entwickeln extern, ist Xenopus mehr nützlich für die kraniofaziale Analyse als Zebrafisch, wie Xenopus Larven größer und leichter zu dissect und die Entwicklung von Gesichts-Region besser zugänglich zu Bildgebung als die entsprechende Region in Fisch. Darüber hinaus ist Xenopus evolutionär näher an den Menschen als Zebrafisch (~ 100.000.000 Jahre näher) 15. Schließlich in diesen Phasen sind Xenopus Kaulquappen transparent, und die gleichzeitige Expression von fluoreszierenden Proteinen oder Molekülen wird eine einfache Visualisierung der Entwicklung von Knorpeln zu ermöglichen. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz wird es uns ermöglichen, schnell und effizient Testkandidat Moleküle in einem in vivo Modellsystem.

Craniofacial Knorpel entwickeln in engem Kontakt mit anderen Geweben und sind schwer zu lebenden Tieren zu manipulieren. Wir sind mit Elektroporation, um molekulare Werkzeuge während des Wachstums des kraniofazialen Skeletts liefern unter Umgehung der frühen Embryonalentwicklung Effekte. Dieser Ansatz erlaubt es uns, effizient Testkandidat Moleküle<em&gt; In vivo.</em

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Die Elektroporation ist eine effiziente Methode, um DNA und andere geladene Makromoleküle zu präzisen Zeitpunkten und an präzisen Stellen in Gewebe einzuschleusen. ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrisch geladene Makromoleküle in das kraniofaziale Mesenchym einzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesiertes Embryo im Stadium 28 in der Elektroporationskammer positioniert wird. Im nächsten Schritt erfolgt die Mikroinjektion der Lösung, die die geladenen Makromoleküle enthält, in das kraniofaziale Mesenchym.Darauf folgt umgehend die Anwendung eines elektrischen Stroms, wodurch die geladenen Nukleotide in die Zellen eingeführt werden. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das elektroporierte Gewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in den kraniofazialen Geweben zeigen.Diese Ergebnisse können in vivo oder in fixiertem Gewebe mittels Fluoreszenz, Mikroskopie oder Immunhistochemie analysiert werden. Der Hauptvorteil der Elektroporation gegenüber etablierten Methoden wie Mikroinjektion und Mutagenese liegt in der räumlichen und zeitlichen Kontrolle über unsere molekularen Werkzeuge. Den hier vorgestellten Vorgang wird heute Jackie Tabler durchführen, eine Postdoktorandin in meinem Labor. Das für diesen Vorgang benötigte Paar L-förmiger Elektroden besteht aus hochreinem Wolframdraht mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern; für jede Elektrode wird zunächst ein 8 Zentimeter langes Stück Draht abgeschnitten.Dann wird mit einem Kitt wie Blaupaste eine Ein-Milliliter-Spritze in der Mitte des Wolframdrahts befestigt, wobei vier Zentimeter Draht von der Spitze der Spritze freibleiben. Die Spitze wird in einem Abstand von einem Zentimeter vom Ende zu einer L-Form gebogen. Die Spitze wird abgeschnitten, sodass das Ende eine Länge von 0,5 Zentimetern aufweist.Dieser Tipp ist das Elektrodenende; führen Sie den überschüssigen Wolframdraht parallel zur Spritze. Er wird verwendet, um die Elektrode mit dem Impulsgenerator zu verbinden, nachdem die zweite Elektrode hergestellt wurde. Befestigen Sie das Elektrodenpaar mit Klebeband so aneinander, dass die Elektrodenanschlüsse parallel zueinander in einem Abstand von einem Zentimeter verlaufen.Schließen Sie abschließend die Elektroden über Gleichstromkabel an einen Rechteckimpuls-Generator an. Um die selbstgebaute Elektroporationskammer vorzubereiten, legen Sie den Boden einer 90-Millimeter-Schale mit etwa fünf Millimetern ungiftigem Gips-Szenen-Modellier-Ton aus. Füllen Sie die Schale mit Elektroporationsmedium, sodass die Gipsszene eingetaucht wird.Verwenden Sie anschließend Pinzette Nummer fünf für Uhrmacher, um eine T-förmige Vertiefung in der Gipsplatte auszuformen, die als Elektroporationskammer dient. Der lange Teil der Vertiefung sollte etwa zwei Millimeter mal zwei Millimeter mal 10 Millimeter messen, der kurze Teil zwei Millimeter mal zwei Millimeter mal fünf Millimeter. Mikropipetten für dieses Verfahren werden aus Silikatglas-Kapillaren hergestellt.Verwenden Sie einen Nadelzieher, um Mikropipetten mit einer Taperlänge von acht bis zwölf Millimetern und einer feinen Spitze herzustellen. Zerkleinern Sie die Spitze etwa zwei Millimeter von der Spitze entfernt mithilfe einer Pinzette, wodurch ein gezackter Bruch entsteht, um die Mikropipette vorzubereiten. Füllen Sie sie zunächst mit etwa einem Mikroliter Injektionslösung, die in dieser Demonstration fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide enthält. Befestigen Sie danach die Mikropipette in einem Mikromanipulator und richten Sie die Mikropipette in einem Winkel von 50 Grad zur Tischoberfläche aus.Stellen Sie den Injektionsdruck auf 20 PSI ein und kalibrieren Sie die Mikropipette, um pro Impuls 30 Liter zu injizieren. Betäuben Sie im Vorbereitungsschritt für die Elektroporation eine Xenopus-Larve im Entwicklungsstadium 28 durch fünfminütige Inkubation in Elektroporationsmedium, das aus normalem Amphibienmedium mit 0,1 % Benzocain besteht, und überführen Sie die betäubte Kaulquappe in die Elektroporationskammer.Das ist mit Elektroporationsmedium gefüllt. Der schwierigste Teil des Verfahrens besteht darin, die Mikrokanüle in den Kaulquappen einzuführen. Um den Erfolg sicherzustellen, muss man das Embryo fest fixieren und unmittelbar nach der Mikroinjektion schnell den Strom anlegen.Positionieren Sie das Embryo in der langen Mulde, sodass der Kopf in der T-Kreuzung liegt. Mit der dorsalen Seite nach unten und der ventralen Seite freigelegt, sollte der Kopf mit Hilfe einer Pinzette leicht gegenüber dem Schwanz angehoben werden; befestigen Sie den Froschlaich vorsichtig in der Mulde mit dem umgebenden Gips. Es ist wichtig, den Froschlaich zu fixieren, um zu verhindern, dass er während der Elektroporation zuckt, was zu schweren Schäden an den Gesichtsgeweben führen könnte.Um dieses Verfahren zu beginnen, bringen Sie die Mikropipettenspitze unmittelbar hinter die Zementdrüse und in das Mesenchym ein. Injizieren Sie 30 Nanoliter Lösung in das Mesenchym und ziehen Sie die Mikropipette zurück. Richten Sie die Elektrodenspitzen schnell parallel zum Kopf des Embryos aus und geben Sie acht rechteckförmige Impulse mit jeweils 50 Millisekunden und 20 Millivolt ab.Danach die Elektroden mit einer Pinzette zurückziehen. Den Kaulquappen vorsichtig aus der Vertiefung befreien. Anschließend den Kaulquappen mit einer Pipette in Dreiviertel-NOM mit 0,025 Milligramm pro Milliliter überführen.Gentamycin-Keimlinge können nach 24 Stunden über Nacht oder länger in diesem Medium inkubiert werden. Untersuchen Sie die Keimlinge mittels Fluoreszenzmikroskopie auf eine effiziente Elektroporation. Die Verwendung fluoreszierender Moleküle ermöglicht eine einfache Auswahl elektroporierter Embryonen.Diese Abbildung zeigt eine typische Charge von mittels Elektroporation behandelten Froschlarven mit morpholino-Oligonukleotiden etwa 12, 48 und 96 Stunden nach der Elektroporation bei den Entwicklungsstadien 30, 34 bzw. 44. Fluoreszierende morpholino-Oligonukleotide sind in den kranialen Gesichtsbezirken in den Stadien 30 und 34 sichtbar.Im Stadium 44 ist Fluoreszenz in den durch die weißen Pfeilspitzen markierten Knorpeln nachweisbar. Der stark autofluoreszierende Bereich ist der Darm. Mit dieser Methode können wir die Zelllinie der Elektrozyten sowie die molekularen Anforderungen an Proteine von Interesse verfolgen.Dieser Ansatz kann mit Live-Bildgebungstechniken kombiniert werden, um die Genfunktion während der kraniofazialen Entwicklung über die Zeit zu untersuchen.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik, die Abgabe von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Hier haben wir ausführlich das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Xenopus laevis Kaulquappen.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die...

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Wie neuronale Netze sind in der embryonalen Gehirn etabliert ist eine grundlegende Frage in Entwicklungsneurobiologie. Hier haben wir eine Elektroporation kombiniert Technik mit neuartigen genetischen Werkzeugen, wie Cre / Lox-Plasmiden und DNA-vermittelte PiggyBac Umsetzung System in der aviären hindbrain nach dorsal Interneuronen kennzeichnen und verfolgen ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele auf verschiedenen Entwicklungsstadien.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt.  Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Hier stellen wir die akute genetische Manipulation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden durch Elektroporation vor. Diese kortikalen Organoidmodelle eignen sich besonders gut für die Injektion, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können, was die funktionelle Untersuchung der kortikalen Entwicklung des Menschen, neurologischer Entwicklungsstörungen und der kortikalen Evolution ermöglicht.

Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden zur Untersuchung der Genfunktion

Erfahren Sie die Elektroporation von geladenen Makromolekülen in das kraniofaziale Mesenchym von Xenopus laevis-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise in vivo-Manipulationen zur Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Weitere Videos entdecken