Name: Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Lernen Sie die Herstellung mehrlagiger Alginat-Mikrokugeln für die Zell- und Proteinverkapselung in der Biomedizin. Diese Methode ermöglicht innovative Anwendungen in der Arzneimittelfreigabe und Diabetesforschung.

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Diese Studie wurde durch das US Department of Veterans Affairs (Washington DC), Zuschüsse 0852048, 0731201, 0854430 und von der National Science Foundation (Arlington, VA), und Grant RO1 DK080897 von den National Institutes of Health (Bethesda, MD) unterstützt . Herr Khanna erhielt Unterstützung von einer großzügigen Spende von Herrn Edward Ross und Dr. Monica Moya von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).

Das Protokoll beschreibt hier ein dreistufiges Verfahren zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikrokugeln gebildet (Abbildung 2A). Dieses Verfahren wird in Abschnitt 1 beschrieben. Zellen oder Proteine ​​können die Mikrokügelchen in diesem Schritt zugegeben werden, um als ein Abgabesystem zu handeln. Der nächste Schritt beinhaltet die Bildung einer Schicht auf den permselektive Mikroperlen und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Der letzte Schritt beinhaltet die Bildung einer zusätzlichen Schicht Alginat und wird in Kapitel 3 beschrieben. Diese Schicht bildet sich auf der Außenseite der Oberfläche der Kügelchen (2B) kann zum Kapseln und liefern therapeutische Moleküle (2C), um zelluläre Reaktion auf das System nach der Transplantation zu leiten. 1. Alginat Nichtmetallisches Vorbereitung <ol><li> Vorbereiten einer 1,5% (w / v) LVM Alginatlösung durch Auflösen von 15 g LVM Alginat in 1 mlInnenschicht Alginat-Lösung (25 mM HEPES-Puffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl und 2,5 mM MgCl 2 in DI-Wasser, eingestellt auf pH 7,4). Mischen Sie auf einem Vortexer, bis das Alginat Macht vollständig aufgelöst hat, um eine klare, viskose Lösung zu bilden. Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt Bedingungen optimal für Insel-Kapselung innerhalb Alginat-Mikrokapseln 1 Die Konzentration und Zusammensetzung der Alginat-Mikrokugeln verändert werden, um Eigenschaften für andere Anwendungen (z. B. Drug Delivery, Tissue Engineering, etc.) Hinweis abzustimmen. Für Inselchen Kapselung die Inseln Sie können der Alginatlösung in diesem Schritt vor dem Laden in der microencapsulator zugesetzt werden. </li><li> Bereiten Sie die Vernetzungslösung (22 mM CaCl 2 in DI-Wasser) durch Lösen von 100 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer in DI-Wasser und Einstellen auf pH 7,4. Hinweis: andere zweiwertige Kationen, wie Br 2 +, Sr 2 + usw. können anstelle von Ca 2 +, je nach Art von Alginat Gelierung d verwendet werdenesired. </li><li> Richten Sie die Zwei-Kanal-Luftmantel Alginat microencapsulator durch Zugabe einer 25-Gauge-Nadel mit einer Spritze, und passen Sie die Ventile auf jeder Seite um sicherzustellen, dass die Nadel in der Mitte des Luft-Jacke. Kanülen unterschiedlicher Größe kann für diesen Schritt verwendet werden, abhängig von der Größe der Alginat-Mikrokugeln ausgerichtet. Dieser Schritt kann mit einer Spritze durchgeführt werden, sollte ein microencapsulator nicht zur Verfügung. Fügen Sie die Alginat-Lösung mit der Spritze, und wählen Sie einen Nadelabstand von der Größe der gewünschten Mikroperlen basiert. </li><li> Stellen Sie ein Kolben, der 10 ml Vernetzungslösung direkt unterhalb der Nadel. Legen Sie einen Rührstab in der Lösung. </li><li> Spritzen Tröpfchen direkt in die CaCl 2-Lösung, um das Alginat zu vernetzen, um Mikrokügelchen zu bilden. Inkubieren der Kügelchen in der Vernetzungslösung zu mindestens fünfzehn Minuten härten, unter kontinuierlichem Rühren. </li><li> Übertragen der Perlen zu einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die restliche Lösung,und führen Sie drei Waschungen mit einer 0,2% igen CaCl 2 in physiologischer Kochsalzlösung für zwei Minuten. </li></ol> 2. Die Beschichtung der Mikrokügelchen mit Poly-L-Ornithin <ol><li> Planen 3 ml einer 0,1% (w / v) Lösung von Poly-L-Ornithin (PLO) in normaler Kochsalzlösung. Legen Sie die Lösung auf einem Vortex, bis es vollständig gelöst ist, bildet eine klare Lösung. Poly-L-Lysin (PLL) kann anstelle der PLO für diesen Schritt, der in ähnlichen Niveaus von Permselektivität Ergebnissen verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die Alginat-Mikrokugeln in die PLO-Lösung. Platz auf einem Vortex für 30 Minuten, damit sich die PLO genügend Zeit, um mit dem Alginat interagieren und bilden eine Polykation-Polyanion-Komplex. Am Ende der 30 Minuten, sollte es eine deutlich sichtbare weiße Beschichtung um die Alginat-Mikrokugeln sein. </li><li> Entfernen Sie die PLO-Lösung, und führen Sie drei Waschungen mit 0,2% CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten. </li></ol> 3. Erstellen der Outer Alginat LayER <ol><li> Planen einer Alginatlösung einer gewünschten Konzentration, die verwendet werden, um die äußere Schicht zu erzeugen ist. Die Lösung wird hergestellt, wie in (1.1) beschrieben. Die Größe der äußeren Schicht wird durch die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat verwendet (3) beeinflusst. </li><li> Übertragen der Alginat-Mikrokugeln auf eine Zelle-Sieb. Mit einem Kimwipe um überschüssige Lösung zu absorbieren, um die Mikroperlen so weit wie möglich zu trocknen. </li><li> Übertragen Sie die Mikrokugeln zu einem Parafilm Oberfläche. Andere glatten Oberflächen wie Glas oder einer Kunststoff-Petrischale für Parafilm substituiert sein kann, falls gewünscht. </li><li> Übertragen Sie die Alginat-Lösung in (3,1) auf die Alginat-Mikrokugeln vorbereitet. Das Volumen der Alginat-Lösung werden sollte vollständig abdecken Alginat-Mikrokugeln. Wir bleiben die Mikrokügelchen in der Alginat-Lösung für 45 Minuten. </li><li> Mit einer Pipette, um die überschüssige Alginat-Lösung nicht auf die Mikroperlen gebunden zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Mikrokügelchen inZu einer Lösung von 22 mm CaCl 2. Diese vernetzt das Alginat-Lösung in der Umgebung der Mikrokügelchen, was zur Bildung der verschiedenen äußeren Schicht Alginat. </li><li> Führen Sie drei Wäschen mit 22 mM CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten. Anzeigen der Mikrokügelchen unter einem Mikroskop sollte für eine bestimmte äußere Alginat zu bildende Schicht um den Kern Mikrokügelchen gesehen werden können. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> 1. Eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Erstellen mehrschichtigen Alginat-Mikrokugeln. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> 2. (A) und (B) Phasenkontrastaufnahmen der Alginat-Mikrokugeln. (A) zeigt eine Mikroperlenach der Synthese der Schritt (1.7), während (B) zeigt eine deutliche äußeren Alginatschicht vorliegenden nach Beendigung des Schrittes (3,7). (C) ein FITC Bild von fluoreszenzmarkierten BSA-Protein in der äußeren Schicht eingekapselt. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> 3. Die Größe des äußeren Alginat-Schicht kann bezogen auf die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat variiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass für LVM und LVG Alginat, die äußere Schicht Größe zunehmen Alginatkonzentration, und daß LVG Alginat dickeren äußeren Schichten liefert als LVM Alginat bei gleichen Konzentrationen. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> 4. Freigabe von FGF-1, einem angiogenen Wachstumsfaktor-Proteins, von der äußeren Schicht variiert Alginat bezogen auf die Konzentration der LVM und LVG Alginat verwendet. (A) und (B) zeigen prozentuale Freisetzung, und (C) und (D) bezeichnen die entsprechende Masse Freisetzung von FGF-1 gegen die Zeit für verschiedene äußere Schicht Formulierungen. Es gibt eine Burst-Release für alle Bedingungen innerhalb der ersten 5 h (A und C) ausgestellt, und niedrig dosierte kontinuierliche Freisetzung für bis zu 30 Tage (B und D). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. November;. 95 (2), 632-40 (2010) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3388/3388fig4large.jpg" target="_blank">Hier klicken, um größere Abbildung anzuzeigen</a> .

<ol><li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-+Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alginate+composition+and+gelling+conditions+on+diffusional+and+mechanical+properties+of+calcium-alginate+gel+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Eng.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads.</a> J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+low+levels+of+fibroblast+growth+factor-1+promote+persistent+microvascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation.</a> Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).</li>
<li>Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+delivery+of+FGF-1+increases+vascular+density+in+comparison+to+bolus+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration.</a> Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).</li>
<li>Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+FGF-1+loaded+alginate+microbeads+on+neovascularization+and+adipogenesis+in+a+vascular+pedicle+model+of+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+Microcapsules+for+the+Sustained-Release+of+Angiogenic+Proteins+From+Encapsulated+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells.</a> Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multilayered+alginate+microcapsules+for+the+sustained-release+of+fibroblast+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Alginat ist ein natürliches, saures Polysaccharid aus Algen extrahiert und aus Einheiten von 1,4 &#39;-β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2,3 besteht. Einfache Gelierung auftritt, wenn zweiwertigen Kationen, wie Ca 2 +, Sr 2 + oder Ba 2 + interagieren mit G-Monomeren unter Bildung ionischer Brücken zwischen benachbarten Alginatketten. Mikrokugeln aus Alginat verwendet worden, um eine Vielzahl von Proteinen, einschließlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1), Ner...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Pronova Ultrapure LVG Alginat </td><td> Nova-Matrix </td><td> 4200006 </td><td> Eine Vielzahl von Alginat Formulierungen zur Verfügung. Die Wahl von Alginat beeinflusst die Eigenschaften der End-Mikroperlen, einschließlich Größe, mechanische Eigenschaften, und Transport. Zusammensetzung verwendet werden für eine gegebene Anwendung optimiert werden. </td></tr><tr><td> Pronova Ultrapure LVM Alginat </td><td> Nova-Matrix </td><td> 4200206 </td><td> Eine Vielzahl von Alginat Formulierungen zur Verfügung. Die Wahl von Alginat beeinflusst die Eigenschaften der End-Mikroperlen, einschließlich Größe, mechanische Eigenschaften, und Transport. Zusammensetzung verwendet werden für eine gegebene Anwendung optimiert werden. </td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin-hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2533 </td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von alginat-mikrokugeln für biomedizinische anwendungen

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginat-Basis-Werkstoffe haben beträchtliche Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer hydrophilen Natur, Biokompatibilität und physikalischen Architektur erhalten hat. Zu den Anwendungen gehören der Verkapselung von Zellen, Drug-Delivery-, Stammzellen-Kultur, und Tissue Engineering Scaffolds. In der Tat sind derzeit klinische Studien durchgeführt, in dem Inselchen in PLO beschichteten Alginat-Mikrokugeln werden als eine Behandlung von Typ-I-Diabetes eingeschlossen. Allerdings sind eine große Anzahl von kleinen Inseln auf Wirksamkeit aufgrund der schlechten Überleben nach der Transplantation erforderlich. Die Fähigkeit, lokal anregen mikrovaskulären Netzwerk Formation um den verkapselten Zellen können ihre Lebensfähigkeit durch verbesserte Transport von Sauerstoff, Glukose und anderen lebenswichtigen Nährstoffen zu erhöhen. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1) ist ein natürlich vorkommendes Wachstumsfaktor, der in der Lage, die Bildung von Blutgefäßen fördern und zu verbessern Sauerstoffgehalt im ischämischen Gewebe ist. Die Wirksamkeit von FGF-1 wird verbessert, wenn es in einem sust geliefert wirdained Weise statt eines einzelnen großen Bolus-Verabreichung. Der lokale langfristige Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Inselchen Verkapselung Systeme könnten das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren direkt gegenüber den transplantierten Zellen, die möglicherweise die Verbesserung der funktionellen Ergebnisse Transplantat. In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, die wir zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln entwickelt. Die Zellen können in der inneren Alginat Kern und angiogenen Proteine ​​in der äußeren Schicht Alginat verkapselt werden. Die Freisetzung von Proteinen aus dieser äußeren Schicht würde die Bildung von lokalen Netzwerken mikrovaskulären direkt stimulieren gegenüber den transplantierten Inseln.

In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Alginatbasierte Materialien haben aufgrund ihrer hydrophilen Natur, Biokompatibilität und ... erheblich Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen erhalten.

Mein Name ist Goldie Ana, und ich bin eine Studentin, die im Labor von Dr. Eric Bras am Illinois Institute of Technology arbeitet. In diesem Video werde ich Techniken zur Verwendung von Alginate-Mikroperlen in der biomedizinischen Technik beschreiben, insbesondere im Bereich der Zell- und Gewebeengineering. Die gesamte hier beschriebene Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Emmanuel OPA am Wake Forest Institute for Regenerative Medicine durchgeführt.Ich werde Techniken zur Herstellung von Alginate-Mikroperlen vorstellen, die sowohl für die Arzneimittelfreisetzung als auch für die Zellverkapselung verwendet werden können. Abschließend werde ich ein neuartiges Verfahren demonstrieren, das wir in unserem Labor entwickelt haben, um mehrschichtige Alginate-Mikrokapseln zu erzeugen, die gleichzeitig zur Verkapselung von Zellen und Proteinen dienen können. Alginate besteht aus Beta-D-Mannuronsäure- und Alpha-L-Guluronsäure-Resten in wechselnden Sequenzen.Alginatlösungen vernetzen sich unter Bildung eines Gels in Gegenwart eines mehrwertigen Kations wie Calcium zwei plus, das am häufigsten verwendet wird. Forscher haben die Verwendung von Algen-Mikroperlen für die Einschließung von Zellen und Proteinen untersucht. Die Eigenschaften von Algen-Hydrogelen können je nach den Synthesebedingungen variiert werden, wodurch inhärent unterschiedliche Eigenschaften entstehen, die beispielsweise zur Einstellung der Freisetzungs­kinetik genutzt werden können.Alginate-Mikroperlen wurden für zahlreiche unterschiedliche Anwendungen verwendet, darunter die Einschließung von Proteinen, die Arzneimittelfreisetzung, die Zelleinschließung sowie als Bestandteil in der Lebensmittelwissenschaft, beispielsweise in der Molekularküche. Wir beginnen mit der Herstellung einer inneren Alginatlösung. Geben Sie 25 Millimolar HEPES, 118 Millimolar Natriumchlorid, 5,6 Millimolar Kaliumchlorid und 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid zu entionisiertem Wasser hinzu und schütteln Sie gründlich, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien gelöst sind.Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, was physiologischen Bedingungen entspricht. Wägen Sie das gesamte Pulver zur Erzielung der gewünschten Konzentration ab und geben Sie es in die vorbereitete Inter-Allergen-Lösung. Fügen Sie die Lösung in ein Vortex-Gerät ein, bis das gesamte Pulver gelöst ist, wodurch eine klare, viskose Lösung entsteht.Stellen Sie die Vernetzungslösung her, indem Sie 10 Millimolar HEPES-Puffer und 100 Millimolar Calciumchlorid in entionisiertes Wasser geben. Schütteln Sie die Lösung gründlich und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Geben Sie 10 Milliliter der Vernetzungslösung in ein Becherglas.Überführen Sie das Alginate in eine Spritze, die mit einer Nadel der gewünschten Größe ausgestattet ist. Halten Sie die Nadel senkrecht zur Vernetzungslösung und geben Sie langsam Tropfen in die Vernetzungslösung ab, wodurch sich sphärische Kügelchen bilden. Um ein großes Volumen an gleichmäßigen Mikrokügelchen herzustellen, kann eine Mikroverkapselung mit zwei Kanälen eingesetzt werden.Füllen Sie die Alginate-Lösung in die Spritze und schalten Sie zunächst das Luftmantelventil ein, gefolgt vom Alginatmantelventil, sodass Tropfen in einen Kolben mit Vernetzungslösung ausgestoßen werden können. Lassen Sie die Perlen 15 Minuten lang in der Lösung inkubieren. Die Mikroperlen werden dreimal mit einer Lösung von 22 Millimolar gewaschen.Calciumchlorid- und normale Kochsalzlösung-Algen-Mikrokapseln wurden umfassend für die Einschließung von Zellen erforscht. Beispielsweise beinhaltet eine vorgeschlagene Methode zur Behandlung von Typ-1-Diabetes die Transplantation von Spender-Augenlidern in einen Patienten, um die Abstoßung der autologen Zellen zu verhindern. Allerdings müssen die Patienten immunsuppressive Medikamente einnehmen, die ihr Immunsystem beeinträchtigen.Die Einschließung von Alis in einem Behälter. Materialien wie Alginsäure könnten die Notwendigkeit für immunsuppressive Medikamente überflüssig machen. Eine Polyol-Ornithin- oder PLO-Beschichtung, die um das alginsäurebasierte Mikrobenmodell angebracht wird, dient als semipermeable Membran.Eine dünne Alginat-Monoschicht wird um die PLO-Beschichtung herum hinzugefügt, was dazu beiträgt, die entzündliche Reaktion einzuschränken. Das positiv geladene PLOI interagiert entgegen der Erwartung mit dem Alginat, wodurch eine Beschichtung um die Perle entsteht, die als permselektive Membran dient. Anschließend wird eine Monoschicht aus Alginat um die PLO-Beschichtung gebildet, um deren positive Ladung abzuschirmen und die entzündliche Reaktion zu begrenzen.Nach der Transplantation eine 0,1%-ige Lösung von Poly-L-Ornithin herstellen, indem PLO in physiologischer Kochsalzlösung gelöst wird. Die PLO-Lösung zu den Alginate-Mikroperlen geben und 30 Minuten auf einem Vortexer inkubieren, damit die Alginate-Mikroperlen ausreichend Zeit haben, mit der PLO-Lösung zu interagieren. Die umgebende Flüssigkeit entfernen und dreimal jeweils zwei Minuten mit 22 Millimolar Calciumchlorid in physiologischer Kochsalzlösung waschen.Geben Sie eine Lösung von Alginate zu den mit PLO beschichteten Mikroperlen hinzu und vortexen Sie fünf Minuten lang. Führen Sie drei Waschschritte à zwei Minuten mit einer 0,9 %igen Kochsalzlösung durch, um nicht gebundenes Alginsäure zu entfernen. Nach Abschluss der Waschschritte können Sie die Perlen lagern, indem Sie sie in eine Calciumchloridlösung geben.Eine der Einschränkungen von Zelltransplantationen besteht darin, dass viele Zellen aufgrund eines fehlenden durchgängigen Blutgefäßversorgung sterben, die Sauerstoff, Glukose und andere lebenswichtige Nährstoffe zu den Zellen transportieren würde. Die Angiogenese, das Wachstum von Blutgefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, kann durch die Zufuhr therapeutischer angiogener Proteine wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 oder FGF 1 oder vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor oder VEGF angeregt werden. Unser Labor hat bereits gezeigt, dass eine gleichmäßige, niedrige Freisetzung von FGF 1 im Vergleich zu einer hohen Bolusdosis eine stabile Vaskularisierung fördert. Wir haben ein neuartiges Verfahren entwickelt, um mehrschichtige Algen-Mikroperlen herzustellen, mit einer beträchtlichen äußeren Alginschicht anstelle einer einfachen dünnen Monoschicht, wie sie traditionell verwendet wird.Unser Drug-Delivery-System erfüllt die doppelte Funktion der Zell- und Proteinverkapselung, wobei beispielsweise s im inneren Kern und angiogenetische Proteine wie FGF eins im äußeren alginathaltigen Bereich eingeschlossen werden können. Die Freisetzung therapeutischer Proteine würde die Bildung neuer Blutgefäße in Richtung der Transplantationsstelle fördern und dadurch die Lebensfähigkeit der Inselzellen erhöhen. Mehrschichtige Allergen-Mikroperlen erfüllen die doppelte Funktion der Zell- und Proteinverkapselung.Ein beträchtlicher äußerer Allergenbereich, anstelle einer herkömmlich verwendeten Mono-Monoschicht, bildet sich um die PLO-Beschichtung und kann als Bereich für die Proteinentkapselung genutzt werden. Die Freisetzung therapeutischer Proteine aus dem äußeren alginathaltigen Bereich würde das Aussprossen von Gefäßen in Richtung der Transplantationsstelle bewirken. Theoretisch würde dies eine durchgängige Blutversorgung schaffen, die lebenswichtige Nährstoffe zu den eingeschlossenen Zellen transportiert und dadurch die Lebensfähigkeit der Zellen erhöht.Das Verfahren zur Herstellung mehrschichtiger Alginat-Mikroperlen ähnelt dem zuvor beschriebenen. Es werden Alginat-Mikroperlen, die Zellen enthalten, synthetisiert, gefolgt von der Bildung einer PLO-Beschichtung. Im letzten Schritt wird jedoch die äußere Schicht durch Vernetzung des Alginats in einer Calciumchloridlösung anstelle von physiologischer Kochsalzlösung erzeugt.Um mehrschichtige Ginnet-Mikroperlen herzustellen, überführen Sie zunächst die in Lösung enthaltenen, mit PLO beschichteten Mikroperlen in ein Zellfilter, um überschüssige Flüssigkeit ablaufen zu lassen. Anschließend geben Sie die Perlen auf eine flache Oberfläche wie Perfil oder eine Petrischale. Geben Sie die äußere Allergenlösung auf die Mikroperlen und lassen Sie sie 45 Minuten inkubieren. Danach entfernen Sie die überschüssige äußere Allergenlösung mit einer Pipette und überführen die Mikroperlen in eine Lösung aus Calciumchlorid, wodurch die Alginatmatrix vernetzt wird, um die äußere Schicht zu bilden. Führen Sie drei Waschschritte durch, jeweils zwei Minuten lang.Mit einem zwei Millimolar Calciumchlorid und Kochsalzlösung enthaltenden Bildfeld. A zeigt die Oberfläche einer Ginnet-Mikroperle im Vergleich zu Bildfeld B, wo eine beträchtliche äußere Allergenschicht sichtbar ist. Bildfeld C zeigt ein Bild einer mehrschichtigen Algenat-Mikroperle mit fluoreszenzmarkiertem Protein, das in der äußeren Schicht eingeschlossen ist.Die Größe der äußeren Alginate-Schicht kann je nach Zusammensetzung und Konzentration des verwendeten Alginate variiert werden, um das Freisetzungsprofil von FGF-1 aus mehrschichtigen Alginate-Mikroperlen zu beeinflussen. Die Mikroperlen können je nach den Bedingungen, die zur Synthese der äußeren Schicht verwendet werden, angepasst werden. Alle Bedingungen führen zu einem initialen Freisetzungsanstieg innerhalb der ersten vier Stunden, setzen die Freisetzung von FGF-1 jedoch bis zu 30 Tage lang fort.Die langfristige Freisetzung von FGF one weist ein Potenzial auf, eine anhaltende Vaskularisierung zu stimulieren, was dazu beitragen würde, die Lebensfähigkeit der eingeschlossenen Zellen zu erhöhen. Damit kommen wir zum Ende unserer Präsentation. Wir hoffen, dass Sie diese als informativ empfinden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir haben eine Methode zur Verkapselung von pluripotenten Stammzellen (PS-Zellen) in Alginat-Hydrogel-Kapseln mit einer koaxialen Düse etabliert.  Dies verhindert eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt die Scherspannung, der Zellen in Suspensionskulturen ausgesetzt sind.  Die Technik ist sowohl auf die Massenproduktion von PS-Zellen als auch auf die Forschung in der Stammzellnische anwendbar.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

Selbstorganisierte Polyelektrolytkomplexe (PEC), die aus Heparin und Protamin hergestellt wurden, wurden auf Alginatkügelchen abgelagert, um die Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren einzufangen und zu regulieren. Diese Verabreichungsstrategie ermöglicht eine 20-fache Reduzierung der BMP-2-Dosis bei Wirbelsäulenfusionsanwendungen. Dieser Artikel veranschaulicht die Vorteile und die Herstellung von PECs.

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Die Entwicklung und Analyse von tragenden Geweben mit heterogenen Zellpopulationen ist immer noch eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von zweischichtigen Alginat-Hydrogel-Scheiben als Plattform für die Co-Kultur verschiedener Zellpopulationen innerhalb eines Konstrukts.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

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Dieses Protokoll veranschaulicht eine Zellverkapselungsmethode durch schnelle physikalische Gelation von Alginat zur Immobilisierung von Zellen. Erhaltene Mikroperlen ermöglichen eine kontrollierte und nachhaltige Sekretion von Amyloid-B im Laufe der Zeit und können verwendet werden, um die Auswirkungen von abgesonderten Amyloid----Modellen in in vitro und in vivo zu untersuchen.

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Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Hier wird eine milde 3D-Drucktechnik vorgestellt, die durch abwechselnd viskos-inertiale Kräfte angetrieben wird, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern zu ermöglichen. Hausgemachte Düsen bieten Flexibilität und ermöglichen einen einfachen Austausch für verschiedene Materialien und Durchmesser. Zellbindende Mikroträger mit einem Durchmesser von 50-500 μm können erhalten und für die weitere Kultivierung gesammelt werden.

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung von hochoffenen porösen Mikrosphären (HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) mittels der auf einer Einzelemulsionsformulierung basierenden einfachen mikrofluidischen Technologie. Diese Mikrosphären haben potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und im Arzneimittelscreening.

Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von Natriumalginat-Mikrosphären, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind, unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts für das Wirkstoffträgerdesign. Untersucht wurden auch die antimikrobiellen Eigenschaften und die langsame Wirkstofffreisetzung dieser Mikrosphären.

Herstellung von vernetzten Natriumalginat-Mikrosphären mit unterschiedlichen Metallionen unter Verwendung der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie

Lernen Sie die Herstellung mehrlagiger Alginat-Mikrokugeln für die Zell- und Proteinverkapselung in der Biomedizin. Diese Methode ermöglicht innovative Anwendungen in der Arzneimittelfreigabe und Diabetesforschung.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

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