Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verschlechterung biologischer Bilder durch die Lufträume in Pflanzenblättern zu minimieren, um klarere Bilder von lebenden Zellen im Blatt zu erhalten. Wenn das Blatt in ein wässriges Einbettmedium eingelagert wird und ein Fluorophor durch einen Laser angeregt wird, begrenzen viele ungefüllte Lufträume und Änderungen des Brechungsindex innerhalb des orange dargestellten Gewebes die Stärke des Signals tief aus dem Gewebe im resultierenden Bild. Wird das Blatt stattdessen per Fluoro Deline oder PFD montiert, wird die resultierende Laseranregung des Fluorophors weniger abgeschwächt und ermöglicht eine bessere Übertragung der emittierten Signale.

Letztendlich liefert die Verwendung der konfokalen Rasterlasermikroskopie mit dem PFD-Eindeckmedium klare Bilder von lebenden Zellen im Pflanzenblatt in einer Tiefe, die mehr als doppelt so hoch ist wie bei der Verwendung eines wässrigen Eindeckmediums. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Fixieren oder Einbetten von Blättern und wässrigen Medien besteht darin, dass sie die Brechung innerhalb der Mesofüllung reduziert und eine genauere Abbildung von lebenden Zellen tiefer im Inneren des Blattes ermöglicht, was sich als problematisch erwiesen hat. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Pflanzenwissenschaft zu beantworten, wie z. B. die Behandlung der Mesofüllung, der Zellbiologie und der Signalübertragung in vivo, der Besiedlung von Blättern durch Krankheitserreger und der Pathogenfüllungsinteraktionen, obwohl diese Methode Einblicke in die grundlegende Pflanzenbiologie geben kann.

Es kann auch auf andere hochbrechende Gewebe angewendet werden, die reich an Luftraum sind, wie z. B. Einsichtsspiralen oder die Lunge von Wirbeltieren. Dieses Verfahren wird von Dr. George Littlejohn aus meinem Labor To Mount Leaf demonstriert. Proben in PFD beginnen mit der Vorbereitung eines Objektträgers mit einer gasdurchlässigen Dichtung aus Polydimethylsloane oder P-D-M-S-P-D-M-S ist ein viskoelastisches Polymer, das geformt werden kann, um eine Kammer zu schaffen, die auf experimentelle Anforderungen zugeschnitten ist.

Gleichen Sie die Schwimmweste mit Luft aus, indem Sie eine kleine Menge Schwimmweste in eine luftgefüllte Flasche schütteln. Dies kann auch erreicht werden, indem anschließend Luft durch die Schwimmweste sprudelt, die Schwimmweste in eine offene Petrischale umgefüllt und ein ganzer Sämling oder ein Blatt fünf Minuten lang auf der Flüssigkeit schwimmen gelassen wird. Das Gewebe sollte durchscheinend werden, was an verglastes Gewebe erinnert.

Die Blätter können dunkler oder heller erscheinen als vor der Exposition gegenüber der Schwimmweste, abhängig von den Lichtverhältnissen und dem Alter des verwendeten Gewebes. Füllen Sie abschließend die PDMS-Kammer mit aeroäquivalenter PFD und übertragen Sie die Gewebeproben vorsichtig aus der Petrischale der Inkubation in die PDMS-Kammer. Versiegeln Sie die Folie mit einer Abdeckung, einem Zettel und einem Bild.

Gemäß den experimentellen Anforderungen wurden die Blätter des Monats fünf Minuten lang in einer Suspension aus rekombinantem grün fluoreszierendem Protein oder GFP inkubiert. Die mikroskopische Untersuchung von PFD-inkubierten Blattproben zeigt, dass die meisten Lufträume mit rekombinantem GFP geflutet sind, das in PFD suspendiert ist. Das GFP ist grün und das rote steht für Chlorophyll, Lottofluoreszenz und Delits für Mesofüllzellen.

Es ist offensichtlich, dass das Blatt bei der Inkubation mit Schwimmweste überflutet wird, dass aber gelegentlich Lufteinschlüsse zurückbleiben können. Unter diesen Bedingungen überflutet das Blatt nicht. Hier werden ein opsys-Blätter, der Venus exprimiert, eine Variante von YFP, die an das Zytosol lokalisiert ist, inkubiert und in Luft-, Wasser- oder PFD-Laserscanning montiert. Die konfokale Mikroskopie der Proben zeigt einen Vorteil der Schwimmweste gegenüber Luft und Wasser mit einer etwa zweifachen Vergrößerung der Bildgebungstiefe.

Beim Vergleich von Schwimmweste und Wasser Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass peripheres Delin Nagellack und Teflon auflöst, aber es ist mit Silikonfett kompatibel. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie per fluro delin als Einbettmedium verwenden können, um die Bildgebung in Zellen von Pflanzenblättern zu verbessern.

Vergessen Sie nicht, dass Delin pro Fluor zwar ungiftig ist, wir jedoch empfehlen, bei der Durchführung dieses Verfahrens die Standardsicherheitspraktiken anzuwenden.