Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Glioblastomzellen, die intrakraniell in das Gehirn einer Maus implantiert wurden, zu beschreiben, darzustellen und zu behandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen vorbereitet und anschließend in das Gehirn einer Maus implantiert werden. Nach dem chirurgischen Eingriff entwickelt sich ein Tumor im Gehirn, an dem verschiedene Behandlungen experimentell getestet werden können.

Schließlich kann eine Überlebenskurve zeigen, ob die Behandlung wirksam war oder nicht. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Glioblastomen, da sie eine effektivere Methode zur Testung neuer Behandlungen wie Medikamente und Strahlung im Vergleich zur Gewebekultur darstellen könnte. Beginnen Sie damit, die Zellen von Interesse, beispielsweise U-87-Zellen, bis zu einer Konfluenz von 80 % zu kultivieren. In DMEM mit 10 % FBS liefert ein 225-Kubikzentimeter-Fläschchen ausreichend Zellen, um fünf Mäuse zu implantieren. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen Sie die Zellen kurz mit 10 Millilitern PBS ohne Calcium oder Magnesium durch manuelles Schwenken.

Nach dem Absaugen der Waschlösung wird die Trypsin-Behandlung der Zellen nach 10 bis 15 Minuten durch Zugabe von 15 Milliliter Medium beendet. Überführen Sie nun alle Zellen und das Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas. Zwei Zellkulturenflaschen passen in ein solches Gefäß.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1600 U/min für sieben Minuten und entfernen Sie das Überstand vollständig durch Absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter kalter PBS und spülen Sie die Zellen, indem Sie sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, bis eine gleichmäßige trübe Suspension entsteht. Nach der Bestimmung der Zellkonzentration mit einem Kulturzähler wiederholen Sie die PBS-Waschung für ein optimales Tumorwachstum.

Stellen Sie die endgültige Konzentration der U 87-Zellen auf 200.000 Zellen pro Mikroliter ein. Andere Zelllinien benötigen möglicherweise eine abweichende Konzentration für ein optimales Tumorwachstum. Nachdem die Zellen für die Injektion vorbereitet wurden, lagern Sie sie auf Eis und fahren Sie mit der Vorbereitung des Tieres fort.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mäuse, indem Sie den Wirtsmäusen ein Anästhetikum verabreichen. Nach etwa 15 Minuten überprüfen Sie, ob die Mäuse schmerzunempfindlich sind, indem Sie eine Zehe einklemmen. Sobald die Mäuse narkotisiert sind, tragen Sie eine Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.

Bringen Sie dann die Maus auf das Bett für den stereotaktischen Rahmen an. Haken Sie die Zähne in die Kerbe der Mundstange ein. Positionieren Sie dann das Bett im Rahmen.

Um nun den Kopf zu stabilisieren, setzen Sie eine Nasenklammer am Maus auf und schieben Sie anschließend vorsichtig die Ohrstifte in die Ohröffnungen. Achten Sie darauf, dass keiner der beiden Stifte zu fest angezogen wird, da sonst der Schädel gebrochen oder die Maus erstickt werden könnte. Überprüfen Sie an dieser Stelle, ob der Kopf waagerecht ausgerichtet ist.

Die endgültige Vorbereitung besteht darin, den Kopf jeweils dreimal abwechselnd mit Alkohol und Jod abzutupfen und abschließend ein viertes Mal mit Alkohol zu behandeln. Beginnen Sie die Implantationsoperation mit einem Schnitt hinter dem rechten Auge, der diagonal nach links hinten zum Hinterhaupt des Schädels verläuft. Der Einschnitt sollte etwa 10 bis 15 Millimeter lang sein.

Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um den Schnitt langsam zu weiten, wodurch der Schädel freigelegt wird. Entfernen Sie die Membran zwischen Schädel und Haut und tupfen Sie Blut oder übermäßige Blutungen ab. Visualisieren Sie nun das bgma und positionieren Sie eine 10-Mikroliter-Glaskolben-Hamilton-Spritze darüber, indem Sie einen Filzstift verwenden. Markieren Sie zwei Millimeter rechts und einen Millimeter vor dem bgma in der Nähe der vorderen Nähtelinie.

Entfernen Sie nun die Spritze und bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel an der markierten Stelle. Der Bohrer hat die Größe einer 22-Gauge-Nadel. Lassen Sie den Bohrer langsam in den Schädel eindringen.

Es ist kein zusätzlicher Druck erforderlich. Laden Sie mit einer Spritze mit einer Nadel der Größe 30 bis 33 Gauge fünf Mikroliter gut gemischter Zellen auf und befestigen Sie sie anschließend erneut am Rahmen. Richten Sie die Nadel auf die Öffnung im Schädel aus und senken Sie sie von der Schädeloberfläche aus bis zur Schädeloberfläche ab.

Senken Sie die Nadel um drei Millimeter ab und warten Sie zwei Minuten. Diese Pause verringert die Gefahr einer Verletzung. Drücken Sie den Kolben langsam herunter, um die Zellen mit einer Geschwindigkeit von etwa einem µL pro Minute zu implantieren.

Vermeiden Sie sorgfältig jeglichen Rückfluss, nachdem die letzten Zellen implantiert wurden. Lassen Sie die Nadel weitere zwei Minuten lang an Ort und Stelle, damit sich alle Zellen absetzen können. Danach ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Gehirn und reinigen Sie das Loch behutsam mit einem Wattestäbchen.

Jetzt mit einer 5-0-PBS-Naht die Inzision mit etwa drei Stichen verschließen. Die Maus auf eine Wärmematte legen und gegebenenfalls erneut Augensalbe auftragen.

Sobald die Maus ihren Kopf hebt oder ihre Schultern bewegt, bringen Sie sie in ihren Heimkäfig zurück. Ab dem Zeitpunkt der Anästhesie-Injektion dauert dieser Vorgang zwischen 30 und 60 Minuten. Wenn sich die Maus nach 90 Minuten noch nicht gerührt hat, könnte sie sich nicht erholen, und Euthanasie könnte eine sinnvolle Alternative sein.

Außerdem wird bei übermäßiger Blutung oder wenn der Schädel zu irgendeinem Zeitpunkt während des Eingriffs Risse bekommt, eine euthanasie empfohlen. Abhängig von der Zelllinie kann die Bestrahlungsbehandlung der Mäuse fünf bis sieben Tage nach der Implantation erfolgen. Beispielsweise kann ein Orthovolt-Bestrahlungsgerät für die Strahlenbehandlung verwendet werden.

Verwenden Sie bildgebende Verfahren wie B-L-I-M-R-I oder CT, um den Tumor zu visualisieren, bevor die Mäuse in experimentelle Gruppen randomisiert werden. Nach der Zellimplantation bildeten sich Tumoren typischerweise innerhalb von zwei bis vier Wochen, abhängig von der Zelllinie. Bei Eintritt des Todes wurde die Färbung an den Hirngeweben durchgeführt, um den Tumor zu untersuchen.

Eine wichtige Bewertung der Behandlungseffizienz ist die Erstellung einer Kaplan-Meier-Überlebenskurve. Diese vergleicht die mittlere Lebensdauer nach der Injektion von Tieren, die einer medikamentösen Behandlung, Strahlentherapie oder einer kombinierten Therapie unterzogen wurden. Durch diese Entwicklung hat diese Technik den Weg für die Forschung im Bereich der Onkologie geebnet, um Therapien bei Gehirntumoren und Mäusen zu erforschen.