Name: Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Implantation von Glioblastomzellen in Mäusehirne für Chemoradiotherapie-Studien. Dieses orthotope Modell ermöglicht die Bewertung neuer Therapiestrategien durch Überlebenskurven-Analyse.

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Diese Forschung wird durch Mittel aus dem Programm Intramural des NIH unterstützt.

I. Zellpräparation <ol><li> Die Zellen werden bis zur Konfluenz in DMEM mit 10% FBS etwa ein 80% konfluenten 225 cm 3-Kolben für jeweils 5 Mäusen implantiert werden gezüchtet. </li><li> Saugen Sie Medien aus der Zellen, waschen mit 10 ml PBS ohne Calcium oder Magnesium. PBS absaugen off-Zellen. </li><li> Trypsinieren Zellen mit 3 ml Trypsin, 10-15 Min. warten, und neutralisieren das Trypsin mit 15 ml Medium. </li><li> Pipettieren Sie alle Zellen und Medien in einem 50 ml konischen. Zwei große Flaschen passen in ein 50 ml-Erlenmeyerkolben. </li><li> Spin-Zellen bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C Überstand vollständig absaugen. Die Zellen in 10 ml kaltem PBS, und spülen Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Stellen Sie sicher, das Zellpellet einheitlich mit der PBS gemischt. Die Suspension soll es wolkig. </li><li> Zu dieser Zeit eine Zellzahl erfolgt mit Hilfe eines Coulter-Zähler. Die Zellen werden erneut bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C zentrifugiert </li><li> Nach dem 2. Zentrifugation der Zellen, wiePirat aller PBS resuspendieren und in 1 ml PBS. </li><li> Die Zellen werden in der 1 ml PBS bei 3000 UpM für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert Die PBS abgesaugt wird, und PBS zugegeben, um die Endkonzentration bis 1x10 6 einzustellen pro 5 ul für U87-Zellen, können andere Zelllinien erfordern eine unterschiedliche Anzahl und Konzentration der Zellen für eine optimale Tumorwachstum. </li><li> Nachdem die letzte Volumen und Konzentration erhalten die Zellen werden auf Eis in einem Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt. </li></ol> II. Xenograft <ol class="ualpha"><li> Vorbereiten der Maus <ol><li> Die Mäuse werden betäubt mit einer Injektion Mischung aus Ketamin / Xylazin / Saline. Die Mischung ist 120 mg / kg Ketamin, 16 mg / kg Rompun und Saline. Die Mäuse werden einzeln gegeben und gewogen 0,1 ml pro 10 g bezogen auf ihr Gewicht. Die Narkose wird mit 26G Nadel befestigt, um 1 ml Spritze IP gegeben. Es dauert ca. 15 min für die Mäuse auf eine schlafende Phase für keine Schmerzreaktion zu erreichen. Sie können die Schmerzreaktion derMäuse durch Kneifen ihre Fußsohle. </li><li> Nachdem die Maus ist voll narkotisiert, wird Augensalbe verabreicht, um ihre Augen, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Die Maus wird auf dem Bett des stereotaktischen mit den vorderen oberen Zähne in die Kerbe auf der Mund-Bar platziert. Das Bett wird dann in der stereotaktischen angeordnet. </li><li> Der Nasenschutz wird über die Maus die Nase gesetzt, um die Bewegung des Kopfes zu verhindern, und das Ohr Bars werden sanft in die Gehörgänge der Mäuse zu platzieren. Achten Sie darauf, entweder die Platzierung der Nase oder Ohr-Bar Bars zu stramm zu tun, wie der Schädel kann brechen und / oder verhindern, dass die Maus von der Atmung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus auf gleicher Höhe mit den Markierungen auf der stereotaktischen ist hilfreich, während dieses Prozesses. </li><li> Zur Vorbereitung der Maus, Alkohol und Jod providine wird großzügig auf dem Kopf der Maus abwechselnd für insgesamt 3 Anwendung von Alkohol und 3 Anwendungen von Jod angewendet. Eine letzte Anwendung eines Alkohol-Pad mit 70% wird angewendetder Kopf. </li></ol></li><li> Chirurgische Verfahren <ol><li> Alle Geräte der Verfahren sollte entweder durch Autoklavieren oder Einweichen Instrumente in 70% Ethanol vor Beginn des Verfahrens sterilisiert werden. </li><li> Ein Schnitt ist oben auf dem Schädel hinter dem rechten Auge diagonal zurück auf die linke hintere des Schädels gemacht. Der Schnitt sollte etwa 10 mm bis 15 mm lang sein. </li><li> Mit einem Q-Tip, langsam trennen den Einschnitt, den Schädel freizulegen, und wischen Sie die Membran, die zwischen dem Schädel und der Haut ist. Verwenden Sie ein Q-Tip, um das Blut beflecken und für starke Blutungen zu beobachten. </li><li> Setzen Sie die Oberseite des Schädels, um die Bregma visualisieren. Mit dem Hamilton-Spritze Punkt, positionieren Sie es über das Bregma. Die richtige Position des Lochs im Schädel gebohrt werden soll 2 mm rechts und 1 mm anterior von Bregma (Abbildung 2). Ein Chirurg Filzspitze Marker, die gekauft sterilen wird, wird verwendet, um die Position des zu bohrenden Lochs markieren. Bitte beachten Sie, dass das Loch in der Nähe ist mit der ein sichterior Nahtlinie. </li><li> Anschließend bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel an der markierten Stelle mit der Spitze einer 22G-Nadel in einem Stift Vase oder Fed durch eine 18G Nadel. </li><li> Laden Sie die 10 pl Glas Hamilton-Spritze mit 5 ul der Zellen. Der Hamilton-Spritze ist 10 ul mit einem stumpfen 30G bis 33G fester Nadel attached to it. Achten Sie darauf, um die Zellen vor dem Laden zu mischen, entweder durch Pipettieren ihnen oder mit einer 1 ml Spritze mit einer 25G Kanüle. Nach dem Hamilton-Spritze geladen wird, setzen Sie ihn wieder in den Arm, um es zu einer Linie mit dem Loch in den Schädel. </li><li> Senken der bunt Ende der Nadel auf die Oberfläche des Schädels, sobald die Nadel Höhe der Schädeldecke; Senken der Nadel, bis sie in einer Tiefe von 3 mm unterhalb der Oberfläche des Schädels. </li><li> Nachdem die Nadel abgesenkt wird, so ist dort für 2 Minuten keine schweres Trauma von der Nadel, die das Gehirn zu vermeiden. Implantation der Zellen ist mit einer Rate von 1 ul pro Minute für insgesamt 6-8 Minuten, achten Sie auf jeden backflow. Nachdem die letzte der Zellen implantiert worden sind, lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für weitere 2 Minuten, damit alle Zellen, sich einzugewöhnen </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus dem Gehirn, und reinigen Sie das Loch mit einem Q-Tip. Fahren Sie mit der Nadel und Spritze mit 50% Actone, 100% EtOH und PBS, 3x in jeder Lösung und in dieser Reihenfolge zu reinigen. </li><li> Die Haut auf dem Schädel bereit ist, an dieser Stelle vernäht werden. Mit 5-0 PBS schließen Sie den Schnitt mit etwa 3 Stiche. </li><li> Lassen Sie die Maus zum Aufwachen auf einem Heizkissen, und erneut anwenden, Augensalbe, wenn nötig. Die Maus kann an den Käfig zurückgebracht werden, nachdem es auf Bewegungen auf seiner eigenen Shows (z. B. durch Anheben des Kopfes oder Bewegen der Schultern). </li></ol></li></ol> III. Die Behandlung der IC-Implantat durch Strahlung und Drug <ol class="ualpha"><li> Bestrahlung <ol><li> Abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung der Mäuse Platz 5 bis 7 Tagen nach der Implantation zu nehmen. Unsere Abteilung nutzt einen Orthovolt Strahlentherapie-Einheit für die Strahlung behandelnment. </li><li> Imaging wie BLI (Biolumineszenz-Bildgebung), MRT oder CT kann verwendet werden, um den Tumor vor der Randomisierung (Abbildung 3A) zu visualisieren. </li><li> Die Mäuse werden betäubt mit der Ketamin / Xylazin / Kochsalzlösung Cocktail wie zuvor, und Augensalbe, um ihre Augen aufgetragen. </li><li> Die Mäuse werden in einem speziell angefertigten Schablone Strahlung, die wie eine Torte Rad, in der die Köpfe der Mäuse zeigen in Richtung der Mitte konfiguriert positioniert ist. Die Körper der Mäuse werden von der Strahlung mit Blei abgeschirmt. </li><li> Die medikamentöse Behandlung kann entweder vor oder Strahlung durch verschiedene Lieferwege, dh SQ, IP-und IV angegeben. </li></ol></li></ol> IV. Ergebnisse Die Maus sollte aufwachen aus dem Verfahren innerhalb von 45-60 Minuten nach der Narkose Injektion. Wenn die Maus schwer Aufwachen hat sich nach dem Eingriff und die Zeit ist 1 überschritten ½ Stunde nach dem Eingriff kann die Maus nicht erholen und Euthanasie kann eine wirksame Alternative sein. Wenn there ist starke Blutungen oder der Schädel wird an jedem Punkt während des Verfahrens Euthanasie geknackt wird empfohlen. Wenn alles gut geht und je nach Zelllinie, sollte ein Tumor bilden, beginnen innerhalb von 2-4 Wochen nach dem Eingriff erfolgen hat. Bei der Verwendung von intrakraniellen Xenograft-Modellen, wird die therapeutische Wirksamkeit in der Regel als das Überleben nach der Implantation 5 gemessen. Da dies jedoch eine IC-Modell Anzeichen und Symptome wird vor Tod eintreten. Einige der körperlichen Zeichen der Maus zeigen können sind eine gekrümmte Haltung, Verlust von Körpergewicht, und Nichterwerbstätigkeit. Einige der neurologischen Symptome können Krampfanfälle, Kopfschiefhaltung und Verlust des Gleichgewichts sein. 3B zeigt eine HE-Färbung eines Tumors bei Mortalität. Eine Kaplan-Meier-Plot wird verwendet, um die Daten (Bild 4) zu bewerten. Die Anzahl der Tage des Überlebens bei 50% berechnet und verglichen mit der Kontrollgruppe. Wenn die Kombination Gruppe lebte länger als die Addition der einzelnen Strahlung und Drogen Arme die Kombination erfolgreich war. <img alt='"Abbildung' src="/files/ftp_upload/3397/3397fig1.jpg" files> Abbildung 1. Die Stölting stereotaktischen Geräten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig2.jpg"> 2. Eine schematische Darstellung der Position der Bohrung in der Maus Schädel. <img alt="3A" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3A.jpg"> 3A. BLI Bildgebung nach Implantation GBM. <img alt="3B" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3B.jpg"> 3B. H und E der GBM Tumor auf die Sterblichkeit. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig4.jpg"> Abbildung 4. Ergebnisse der U87 IC Implantate mit PARP-Inhibitor 7 Tage nach der Operation injiziert.

<ol><li>Bleau, A. M., Holland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+the+mouse+genome+to+hunt+human+alternations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trapping the mouse genome to hunt human alternations.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).</li>
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<li>Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathlogical+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression.</a> J. Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
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<li>Purow, B., Schiff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+glioblastoma%3A+are+we+reaching+critical+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass.</a> Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Maligne Gliome, wie zB Glioblastoma multiforme, stellen die häufigsten primären Hirntumoren und haben eine schlechte Prognose 4. Die Überlebenschancen von Patienten durch GBM betroffen praktisch unverändert geblieben ist während des letzten Jahrzehnts (dh 9-12 Monate nach der Diagnose) trotz der Fortschritte in der Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie 5. Die Merkmale eines geeigneten Modells für das Studium der Gliom-Behandlung sollte eine reproduzierbare Tumorlokalisation und Wachstum der Zell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Lab Standard Stereotaktische Instrutment </td><td> Maus und Ratte Stoelting Adapter </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 100% EtOH </td></tr><tr><td> 70% EtOH </td><td> 50% Aceton </td></tr><tr><td> 6 &quot;Q-Tips </td><td> Alkoholtupfer </td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze 80008 </td><td> Ethicon 5-0 PD </td></tr><tr><td> 1701 SN 31-33G / 1 &quot;/ PT3 Nadel </td><td> 1 ml-Spritzen </td></tr><tr><td> 25G Nadeln </td><td> Heizkissen </td></tr><tr><td> Künstliche Tränen-Salbe </td><td> Sehr feine Spitze Permanentmarker </td></tr></tbody></table>

kombination strahlentherapie in einem orthotopen maus brain tumor-modell

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste und aggressivste erwachsenen primären Hirntumoren ein. In den letzten Jahren hat es erhebliche Fortschritte im Verständnis von den Mechanismen der Tumorinvasion und direkter intrazerebraler Inokulation des Tumors bietet die Möglichkeit der Beobachtung der invasiven Verfahren in einem physiologisch geeigneten Umgebung 2. Soweit menschlichen Hirntumoren betrifft, so sind die derzeit verfügbaren Modelle orthotopen entweder durch stereotaktische Injektion von Zellsuspensionen oder Implantation eines festen Tumors Stück durch ein kompliziertes Verfahren Kraniotomie 3 hergestellt. In unserer Technik ernten Zellen aus Gewebekulturen, um eine Zellsuspension verwendet, um direkt in das Gehirn implantiert zu schaffen. Die Dauer der Operation beträgt etwa 30 Minuten, und die Maus muss in einem konstanten chirurgischen Ebene liegen, eine injizierbare Anästhetika. Die Maus wird in einen stereotaktischen Bohrlehre von Stoetling (Abbildung 1) aus angeordnet. Achterner das Operationsgebiet wird gereinigt und vorbereitet, wird ein Einschnitt vorgenommen, und die Bregma befindet, um die Position der Kraniotomie bestimmen. Die Lage der Kraniotomie ist 2 mm nach rechts und 1 mm rostral zu Bregma. Die Tiefe von 3 mm von der Oberfläche des Schädels und die Zellen werden mit einer Rate von 2 ul alle 2 Minuten injiziert. Die Haut wird mit 5-0 PDS genäht, und die Maus darf aufwachen auf einem Heizkissen. Aus unserer Erfahrung, abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung Platz 7 bis 10 Tagen nach der Operation. Drug Delivery ist abhängig von der Arzneimittel-Zusammensetzung. Für Bestrahlung die Mäuse sind anästhesiert, und in einem speziell angefertigten Vorrichtungsbau. Blei deckt der Maus Körpers und setzt nur das Gehirn der Maus. Das Studium der Tumorentstehung und die Evaluierung neuer Therapien für GBM erfordern genaue und reproduzierbare Hirntumor Tiermodellen. So verwenden wir diese orthotopen Gehirn Modell, um die Interaktion der Mikroumgebung des Gehirns und des Tumors zu studieren, um das zu testen aftlichess von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen mit und ohne Bestrahlung.

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor bei Erwachsenen1. In den letzten Jahren wurden erhebliche Fortschritte bei der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Glioblastomzellen, die intrakraniell in das Gehirn einer Maus implantiert wurden, zu beschreiben, darzustellen und zu behandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen vorbereitet und anschließend in das Gehirn einer Maus implantiert werden. Nach dem chirurgischen Eingriff entwickelt sich ein Tumor im Gehirn, an dem verschiedene Behandlungen experimentell getestet werden können.Schließlich kann eine Überlebenskurve zeigen, ob die Behandlung wirksam war oder nicht. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Glioblastomen, da sie eine effektivere Methode zur Testung neuer Behandlungen wie Medikamente und Strahlung im Vergleich zur Gewebekultur darstellen könnte. Beginnen Sie damit, die Zellen von Interesse, beispielsweise U-87-Zellen, bis zu einer Konfluenz von 80 % zu kultivieren. In DMEM mit 10 % FBS liefert ein 225-Kubikzentimeter-Fläschchen ausreichend Zellen, um fünf Mäuse zu implantieren. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen Sie die Zellen kurz mit 10 Millilitern PBS ohne Calcium oder Magnesium durch manuelles Schwenken.Nach dem Absaugen der Waschlösung wird die Trypsin-Behandlung d

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Forschung

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Medizin

Hirntumor-Patienten routinemäßig durchlaufen kranialen Strahlentherapie, und während von Vorteil, diese Behandlung führt oft lähmenden kognitive Dysfunktion. Dieser ernste ungelöste Problem hat derzeit keine klinischen Inanspruchnahme und getrieben hat unsere Anstrengungen zur Stammzell-basierten Therapien für die Verwertung von Strahlung induzierte kognitive dekrementiert zu entwickeln.

Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Das Video demonstriert die orthotope Inokulationstechnik für Brustkrebs in einem Mausmodell. Diese Technik führt zu einer hohen Tumorgeneserate mit geringerer Variabilität in Tumorgröße und -form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgischen Injektion.

Orthotope Injektion: Implantation gewebespezifischer Krebszellen in eine erwachsene Maus

Dieses Video zeigt die Implantation von Tumorzellen in das Gehirn von Mäusen durch intrakranielle Injektion.

Intrakranielles orthotopisches Modell: Ein Verfahren zur Implantation von Krebszellen in das Gehirn von Mäusen

Stammzellen sind vielversprechende therapeutische Träger, um Hirntumoren aufgrund ihrer intrinsischen Tumor-Tropismus zu behandeln. Nicht-invasive intranasale Stammzell-Abgabe umgeht die Blut-Hirn-Schranke und zeigt ein starkes Potenzial für die klinische Übersetzung. Dieser Artikel fasst die Grundprinzipien der intranasalen Stammzellabgabe in einem Mausmodell des Glioms zusammen.

Intranasale Abgabe von therapeutischen Stammzellen an Glioblastom in einem Mausmodell

In der Vergangenheit war kleine Tier Bestrahlung in der Regel ohne die Fähigkeit, eine gut abgegrenzte Tumorvolumen Ziel durchgeführt. Ziel war es, die Behandlung von menschlichen Glioblastom bei Ratten zu imitieren. Über eine kleine Tier Bestrahlung-Plattform haben wir MRT-geführte 3D konformalen Bestrahlung mit der PET-basierten Teilvolumen Förderung in einer präklinischen Einstellung durchgeführt.

PET und MRT geführte Bestrahlung von einem Glioblastom Rattenmodell mit einer Mikro-Moorpackung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Forschung auf Behandlungsstrategien für pluripotente Stammzellen abgeleitet darum ist wichtig für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erstens Stammzellen abgeleitet darum zu generieren, bei Mäusen und dann selektiv auf und behandeln diese Tumoren in vivo mit einem kleinen Tier Brutapparat.

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

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Positronen-Emissions-Tomographie-basierte Dosismalerei-Strahlentherapie in einem Glioblastom-Rattenmodell unter Verwendung der Small Animal Radiation Research Platform

In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches orthotopes Mausmodell für GBM, das durch intrakranielle Injektion von Zellen aus gentechnisch veränderten Mausmodelltumoren etabliert wurde. Dieses Modell zeigt die Krankheitsmerkmale des humanen GBM. Für translationale Studien wird der Hirntumor der Maus mittels In-vivo-MRT und Histopathologie verfolgt.

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