Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Dieses Verfahren erzeugt rekombinantes Rift-Valley-Fieber-Virus der MP-12-Stamm, der mutierte NSS mittels Reverser Genetik codiert, und zielt darauf ab, die Phänotypen für die Impfstoffentwicklung zu charakterisieren. Zuerst werden unter Verwendung eines Transfektionssystems in Bhk-T-seven-nine-Zellen, die stabil T-seven-RNA-Polymerase exprimieren, rekombinante MP-12-Stamm-Mutanten regeneriert, anschließend die regenerierten rekombinanten MP-12-Stamm-Mutanten in Vero-E-six-Zellen amplifiziert und die amplifizierten MP-12-Mutanten mittels Plaque-Assay titriert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Ausfall der Interferon-alpha- oder -beta-Suppression durch mutierte NS-Proteine zu überprüfen.

Letztendlich können die Ergebnisse die Herstellung eines lebend-abgeschwächten Impfstoffkandidaten gegen das Rift-Tal-Fieber mithilfe eines Reverse-Genetik-Systems erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der zufälligen Einführung von Mutationen in das virale Genom durch chemischen Stickstoff oder serielle Passagen, liegt in der Möglichkeit, gezielte Mutationen mittels eines genetischen Systems in das virale Genom einzubringen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Rift-Tal-Fieber-Impfstoffe zu klären, beispielsweise die Bedeutung des wichtigsten Virulenzfaktors NSS für die Immunogenität von Impfstoffkandidaten.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Rift Valley Fieber-Virus, wie bei der Formulierung von Zielblöcken und der Visualisierung der Blöcke, eine optimierte Technik erfordert. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Virusrekonstitution und Hydratation schwer zu erlernen sind, weil bisher kein schrittweises Protokoll für diese Methode veröffentlicht wurde. Verwenden Sie 6 cm-Dishs, geben Sie die T79-Baby-Hamster-Nierenzellen, die stabil T7-RNA-Polymerase exprimieren, hinein und stellen Sie sie in einen Inkubator bei 70 bis 80 % Zellkonfluenz. Wechseln Sie das Medium zu komplettem MEM-Alpha ohne Hygromycin B. Beginnen Sie innerhalb einer Stunde mit dem Transfektionsprozess zur Rekonstitution des Rift Valley Fieber-Virus.

Erstellen Sie einen Satz von Plasmiden, die virale genomische RNAs für die Expression vollständiger viralen RNA kodieren, und einen zweiten Satz, der offene Leserahmen viraler Gene für die Expression viraler Proteine kodiert. Geben Sie nun 30 Mikroliter Transit LT1 zu 385 Mikrolitern Optum in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu. Vortexen Sie kurz und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Bei Raumtemperatur die resultierenden Liposomen langsam tropfenweise zu den 10 Mikrogramm Plasmid-Sets hinzufügen, die vorsichtig per Pipettierung gemischt wurden, und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Transfektionsmischung zu den BHK-T7-9-Zellen geben und 24 Stunden inkubieren. Den Kulturüberstand durch komplettes MEM Alpha ersetzen und weitere vier Tage kultivieren. Die Kulturüberstände in einen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln und zelluläre Trümmer durch Zentrifugation entfernen.

Überführen Sie nun Eloqua in die Überstände und füllen Sie diese in verschraubbare 5-mL-Kryoröhrchen ab. Lagern Sie diesen P0-Virusstamm bei minus 80 Grad Celsius, um nachfolgende Experimente zu ermöglichen. Amplifizieren Sie den P0-Virus in Zellen, die die Interferon-alpha- und -beta-Gene fehlen. Kultivieren Sie 80 % konfluente Vero-E6-Zellen in vollständigem DMEM, ersetzen Sie das Medium durch verdünnten P0-Virus und inkubieren Sie eine Stunde lang.

Entfernen Sie das Inokulum und kultivieren Sie in 10 Milliliter komplettem DMEM für drei bis vier Tage, bis der zytopathische Effekt an Vero E6-Zellen sichtbar wird. Gewinnen Sie das Überstandmedium wie zuvor beschrieben und kennzeichnen Sie die Proben als E6P1. Verwenden Sie 6-Loch-Platten, um Vero E6-Zellen in komplettem DMEM bis zu einer Konfluenz von 80 % auszuwachsen. Entfernen Sie das Medium von den Vero E6-Zellen und geben Sie 400 Mikroliter zehnfacher serieller Verdünnungen der E6P1-Viruspräparation hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang.

Bereiten Sie derweil zwei 15-Milliliter-Röhrchen für das Agar-Overlay-Röhrchen vor. Ein Röhrchen A enthält sieben Milliliter 1,2 % Noble Agar in Wasser und zwei Röhrchen B enthalten jeweils sieben Milliliter zweifach konzentriertes komplettes MEM und 10 % Trips-Phosphat-Bouillon. Nach 15 Minuten in den Wasserbädern wird das Röhrchen B in das Röhrchen A umgegossen und mit einer Pipette vermischt. Ersetzen Sie das virale Inokulum durch zwei Milliliter pro Vertiefung einer 1:1-Mischung aus den Röhrchen A und B. Kultivieren Sie die Zellen anschließend drei bis vier Tage weiter.

Stellen Sie die Schraubenziehler-Überlagerung her, indem Sie 1,2 % nobles Agar zwei Mal komplettes MEM und neutrales Rot zu Gefäß A, zu Gefäß B und einem dritten Gefäß, das mit „neutrales Rot“ beschriftet ist, hinzufügen. Stellen Sie Gefäß A in ein Wasserbad mit 42 Grad Celsius und die beiden anderen Gefäße in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend sieben Milliliter aus Gefäß A, sieben Milliliter aus Gefäß B und 0,5 Milliliter neutrales Rot vermischen, zwei Milliliter der Mischung in jedes Brunnen einer 6-Brunnen-Platte aliquotieren und die Platte über Nacht inkubieren. Bestimmen Sie nun die Anzahl der Plattierungseinheiten pro Milliliter. C57 Wildtyp-Maus-embryonale Fibroblasten exprimieren ein durch NF-κB sowie IRF3 oder IRF7 induzierbares Gen für eine sekretierte embryonale alkalische Phosphatase.

Hier untersuchen wir die durch angeborene Immunantworten induzierte Seep-Aktivität, indem wir subkonfluente Zellen in 12-Loch-Platten entweder mit rekombinantem MP 12, das NS-Mutationen codiert, oder mit MP 12-Kontrolle infizieren und eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie das Inokulum, geben Sie je Loch ein Milliliter vollständiges DMEM hinzu und kultivieren Sie 14 Stunden lang. Gewinnen Sie die Kulturüberstände für einen Seep-Assay, geben Sie in jedes Loch einer 96-Loch-Platte 200 Mikroliter Quantum Blue und 50 Mikroliter jeder Probe hinzu, verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Messen Sie den OD bei 650 Nanometern mithilfe eines Plattenlesegeräts. Das Rift-Valley-Fieber-Virus besitzt ein dreiteiliges, negatives RNA-Genom, dessen Segmente als S-, M- und L-Segment bezeichnet werden, im Vergleich zum NSS des MP-12-Stamms. Der offene Leserahmen des C-13-Typs ist um 69 % verkürzt. Typischerweise erzeugt das reverse genetische System lebensfähige rekombinante MP-12-Viren mit Titerwerten, die höher als 1 × 10⁶ PFU pro Milliliter C-13-Typ-Virus sind.

Ohne N's Funktion bilden große, trübe Plaques, während MP 12 im Vergleich zu mock-infizierten Zellen nach 14 Stunden post Infektion klare Plaques unterschiedlicher Größe bildet. C57 Wildtyp-Meth-Zellen, die mit MP 12 infiziert wurden, zeigen keine Erhöhung des Seep-Spiegels in der Kultur.

Im Gegensatz dazu induziert eine Infektion mit dem C13-Typ eine erhöhte Ausscheidung ab 14 Stunden nach der Infektion. Northern Blots mit einer RNA-Sonde, die spezifisch für die mRNA von Maus-ISG56 ist, bestätigen die Hochregulation der ISG56-mRNA in Abwesenheit der N'S-Expression. Mithilfe dieses Verfahrens können, beispielsweise durch Maus-Immunisierung und Testung neutralisierender Antikörper, Fragestellungen wie die Immunogenität von NSS-Mutanten untersucht werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Valley-Fieber-Forschung, um die Funktionen nichtstruktureller Gene in infizierten Zellen und Tieren zu erforschen.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit infektiösen Viren äußerst gefährlich sein kann, daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um das Einatmen von AOLs zu vermeiden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie rekombinante MP-12-Stämme gewonnen und titriert sowie wie NSS-Mutanten, die die Interferon-alpha-beta-Suppressionsfunktion fehlen, gescreent werden können.