Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Hier werden zwei verschiedene Methoden zur Beurteilung der Spermien-Chemoattraktion für den Zweikammer-Assay beschrieben. Aktivierte Froschspermien werden zunächst in Einsätze mit porösen Membranböden pipettiert, die in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte eingefügt sind. Sobald die Spermien positioniert sind, wird ein Chemoattraktant vorsichtig in den Boden der Vertiefung gegeben, um einen chemoattraktiven Gradienten zu erzeugen.

Anschließend werden die Spermien inkubiert, um den Zellen Zeit zu geben, die poröse Membran als Reaktion auf den chemotaktischen Gradienten zu durchqueren. Schließlich wird der Einsatz entfernt, und die Spermien, die in den zwei-Kammer-Assay in den Boden der Vertiefung migriert sind, werden mittels Hämozytometer gezählt. Letztendlich kann die Aktivität von Spermien-Chemoattractanten verglichen und quantifiziert werden, beispielsweise durch eine Dosis-Wirkungs-Kurvenanalyse für den Zigman-Kammer-Tracking-Assay.

Ein Deckglas wird zunächst mit Silikonöl auf die Zigman-Kammer aufgebracht und verkehrt herum über die kreisförmige Öffnung eines Mikroskops platziert. Eine Seite der Kammer wird anschließend mit aktivierten Froschspermien gefüllt. Danach wird die andere Seite mit der Chemoattraktantlösung gefüllt.

Nach fünf Minuten bildet sich der chemotaktische Gradient, und zu diesem Zeitpunkt können die Spermien aufgezeichnet werden, wie sie entlang des Gradienten schwimmen. Letztendlich kann die aus dem Zigmund-Kammer-Tracking-Assay gewonnene Aufnahme analysiert werden, um die Geschwindigkeit der Spermien sowie die chemokinetischen Muster und Bewegungsbahnen der Spermienbewegung in Reaktion auf einen Chemoattraktantengradienten zu bestimmen. Diese beiden Methoden zum Nachweis der Spermienchemotaxis ergänzen sich und liefern unterschiedliche Datentypen.

Der Zweikammer-Assay ermöglicht es Spermien, durch eine poröse Membran zu gelangen, wodurch die Quantifizierung der Spermienantwort auf einen Chemoattraktor ermöglicht wird. Die visuelle Demonstration des Zweikammer-Assays ist entscheidend, da die Schritte zum Hinzufügen von Spermien und Chemoattraktor zu Beginn sowie das Entfernen der Spermien und der Einsätze am Ende eine präzise Handhabung der Mikropipette erfordern. Der Zigmond-Kammer-Assay verwendet Videoaufnahmen, um das Schwimmen von Spermien in einem Chemotaxis-Gradienten zu dokumentieren.

Dies ermöglicht die Bestimmung dynamischer Parameter wie Geschwindigkeit und Richtung. Der Hauptvorteil des Zigmund-Kammer-Tracking-Assays gegenüber dem Zwei-Kammer-Assay besteht darin, dass das Schwimmen der Spermien sichtbar gemacht und mit einer Reihe dynamischer Parameter analysiert werden kann. Spülen Sie die Spermien aus einem Froschtestikel aus, indem Sie an einem Ende Löcher einstechen und am gegenüberliegenden Ende Puffer mit Spritze und Nadel injizieren.

Nachdem die Spermien aus den Froschtestes ausgespült wurden, schätzen Sie die Anzahl der gesammelten Zellen mittels Hämocytometer. Verdünnen Sie dann die Stammspermien-Suspension mit Oozyten-Ringer-Puffer, um eine Spermienkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen pro Milliliter zu erhalten. Beurteilen Sie die Spermienmotilität, indem Sie fünf Mikroliter Spermien 1:10 mit F1-Puffer verdünnen und die Bewegung mittels Phasenkontrastoptik beobachten.

Als Nächstes pipettieren Sie 700 Mikroliter F1-Puffer in jedes Brunnen einer 24-Loch-Kunststoffkulturplatte. Verdünnen Sie dann 100 Mikroliter der Spermensuspension mit 900 Mikrolitern F1-Puffer bei Raumtemperatur in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Spermienmotilität durch osmotischen Schock für jeden durchzuführenden Test zu aktivieren. Setzen Sie einen 12 Millimeter durchmessenden Insert mit einer Porosität von 12 Mikrometern in einen mit Puffer gefüllten Brunnen ein, wobei sichergestellt werden muss, dass der Insert exzentrisch platziert wird und auf einer Seite ein Freiraum verbleibt.

Danach mithilfe einer Mikropipette mit abgeschnittener Spitze unverzüglich 400 Mikroliter beweglichkeitsaktivierter Spermien in die Vertiefung überführen; tragen Sie die Spermien-Suspension auf die Wand des Inserts auf, sodass sie an dieser herunterläuft und auf dem Filter am Boden des Inserts auftrifft. Als Nächstes pipettieren Sie vorsichtig 50 Mikroliter des Chemoattraktans in jede Vertiefung der Platte in den Zwischenraum zwischen der Vertiefung und dem exzentrisch angeordneten Insert.

Dabei sorgfältig darauf achten, den Tropfen dort abzusetzen, wo die Seitenwand und der Boden des Wells zusammentreffen. Die Pipette entnehmen, ohne das System zu stören. Nachdem alle Assays eingerichtet wurden.

Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur, bis der erste gestartete Assay 50 Minuten inkubiert hat. Danach, nachdem Sie den Insert vorsichtig mit einer Hand stabilisiert haben, beenden Sie den Assay, indem Sie mithilfe einer Mikropipette den größten Teil oder die gesamte Spermensuspension aus der oberen Kammer entfernen.

Nachdem das Sperma aus der oberen Kammer übertragen wurde, ziehen Sie den Insert sofort heraus und entsorgen Sie ihn. Mischen Sie nun die Spermensuspensionen in jedem Well, um eventuell am Boden abgesetzte Spermien erneut in Suspension zu bringen. Übertragen Sie anschließend die gesamte Spermensuspension aus jedem Well in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (Volumen pro Volumen) hinzu. Pelletieren Sie die fixierten Spermien in jedem Röhrchen. Drehen Sie es mit der Zehn-Sekunden-Taste an einer persönlichen Mikrozentrifuge.

Entfernen Sie anschließend aus jedem Röhrchen alles bis auf 100 Mikroliter des Überstandes und resuspendieren Sie das Pellet in diesem Volumen. Verdünnen Sie danach 20 Mikroliter der Spermensuspension im Verhältnis 1 zu 10 mit destilliertem Wasser und zählen Sie die Spermien mit einem Hämozytometer. Mithilfe des 40×-Objektivs eines aufrechten Mikroskops liefert der Zwei-Kammer-Test quantitative Ergebnisse, die für Dosis-Wirkungs-Studien oder Vergleiche zwischen Lockstoffen geeignet sind.

Im Beispiel enthält Froschei-Wasser den Spermien-Chemoattraktant Alluring, wie mit den roten Symbolen gezeigt. Das Ei-Wasser führt zu einer Zunahme und anschließenden Abnahme der Anzahl von Spermien, die die poröse Membran durchqueren, wenn die Dosis des Spermien-Chemoattraktanten erhöht wird. Im Gegensatz dazu hat Rinderserumalbumin, dargestellt durch die weißen Symbole, im gleichen Dosisbereich kaum eine Wirkung.

Bevor Sie mit dem Zigman-Kammer-Assay beginnen, überprüfen Sie zunächst, ob die Invertiertmikroskop-Workstation für die Videoaufnahme vorbereitet ist. Richten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Kamerasteuerungssoftware, um sieben Bilder pro Sekunde aufzuzeichnen.

Überprüfen Sie, ob die Kamera auf die Beobachtungsplattform fokussiert ist und ob die Ausgabe an den Computermonitor gesendet wird. Stellen Sie anschließend sicher, dass das mikroskopische Sichtfeld die gesamte oder zumindest den größten Teil der Breite der Beobachtungsplattform erfasst. Bereiten Sie dann eine Froschspermien-Suspension in Oozyten-Ringer-Puffer sowie einen Chemoattraktant vor, der mit F1-Puffer auf die richtige Konzentration verdünnt wurde, und lagern Sie beides bis zur Verwendung auf Eis.

Dann beginnen Sie mit einer sauberen, trockenen Zigmund-Kammer. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette eine Linie von etwa vier Mikrolitern Silikonöl in einem Abstand von ungefähr fünf Millimetern parallel zur Außenkante jedes trth ab. Anschließend wird ein 22 mal 40 Millimeter großer Deckgläser auf die Kammer gelegt, wobei das Silikonöl gleichmäßig bis zur Außenkante jedes trth verteilt wird.

Drehen Sie nun die Kammer um und platzieren Sie sie über der großen kreisförmigen Aussparung im Mikroskopständer. Achten Sie darauf, dass das Deckglas nicht mit dem Ständer in Kontakt kommt, und aktivieren Sie 20 Mikroliter des Xap-Spermas im Oocyte-Ringer-Puffer, indem Sie diesen im Verhältnis 1:10 mit F1-Puffer bei Raumtemperatur mischen. Saugen Sie mithilfe einer Mikropipette mit abgeschnittenem Pipettenspitze unverzüglich 70 Mikroliter des beweglich gemachten Spermas auf.

Dann halten Sie die Mikropipette in einem flachen Winkel und platzieren die Spitze an der Seitenöffnung. Füllen Sie die Kammer und die Brücke durch Kapillarwirkung. Danach füllen Sie die gegenüberliegende Kammer auf dieselbe Weise mit einer Chemotaktantlösung, da Xap-Spermien eine begrenzte Motilitätsdauer aufweisen.

Beginnen Sie die Videoaufnahme innerhalb von drei Minuten und setzen Sie sie fünf Minuten lang fort. Der Zigman-Kammer-Tracking-Test ermöglicht die Videomikroskopie von Spermien, die in einem Chemoattraktantengradienten schwimmen. Dieser Film zeigt eine Aufnahme von Spermien, die auf der Beobachtungsplattform schwimmen, wobei ihre Trajektorien wie in diesem Diagramm dargestellt in Rot nachgezeichnet werden.

Spermienbahnen bestehen aus Segmenten, wobei jedes Segment durch einen Pfeil gekennzeichnet ist und die Bewegung der Spermien zwischen aufeinanderfolgenden Filmframes darstellt. Die Segmentverläufe zeigen das Schwimmverhalten einzelner Spermien und verdeutlichen Muster wie Kreise und Richtungswechsel. Aus diesen Daten kann man die Geschwindigkeit und Richtung jedes Segments oder die Eigenschaften aller Segmente einer Bahn beziehungsweise einer Gruppe von Bahnen bestimmen.

Beispielsweise die netto lineare Distanz. Der Vektor, der den Anfang einer Trajektorie mit ihrem Ende verbindet, weist eine Komponente entlang der x-Achse auf und liegt unter einem Winkel Theta zur x-Achse, wie hier in Rot dargestellt. Theta sollte abnehmen und die Bewegung entlang der x-Achse sollte zunehmen, wenn ein Chemoattraktant-Gradient vorhanden ist. Diese Veränderungen bedeuten, dass die Spermien eine Präferenz dafür zeigen, entlang des Gradienten in Richtung des Chemoattraktanten zu schwimmen. Bei der Durchführung beider Assays ist zu beachten, dass die korrekte Zugabe von Spermien und Chemoattraktant in jedes Gerät entscheidend ist, um reproduzierbare chemotaktische Gradienten und eine zuverlässige Spermienleistung zu erzielen.