Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Diese experimentelle Methode dient zur Aufklärung der Eigenschaften der speicherbetriebenen Kalziumaufnahme oder SOCE in Krebs- und Skelettmuskelzellen mithilfe fluoreszenzbasierter Verfahren. Dies wird erreicht, indem die Fluoreszenz von URA zwei in lebenden Zellen aufgezeichnet wird, die auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration empfindlich reagiert. Zusätzlich wird die Fluoreszenzlöschungsrate durch Zugabe von Mangan bei einer kalziumkonzentrationsunempfindlichen Wellenlänge gemessen, was direkt die Aktivierung der SOCE widerspiegelt und somit die Untersuchung der SOCE ermöglicht.

In strukturell spezialisierten Skelettmuskelzellen werden Muskeln präpariert und enthäutet. Muskel­fasern werden hergestellt. Anschließend werden die Fasern mit Kalziumindikatoren geringer Affinität behandelt und deren interne Fluoreszenz überwacht.

Diese Methoden zeigen, dass SOCE sowohl in nicht erregbaren Zellen als auch in Skelettmuskeln mit gestufter Aktivierung und enger Kopplung an den Gehalt der intrazellulären Kalziumspeicher existiert. Der Hauptvorteil dieser auf Fluorescein basierenden Technik gegenüber anderen Methoden wie der Elektrophysiologie oder dem Patch-Clamp-Verfahren besteht darin, dass sie einfach anzuwenden ist und sich für Studien an Zellpopulationen oder für Hochdurchsatz-Screenings eignet. Es ist wichtig, die richtige Ästhetikerin S für das rituelle metrische Umfeld und den Mag-Coning-Assay zu verwenden.

Daher ist die Kalibrierung einzelner Geräte entscheidend, da jedes Gerät unterschiedlich ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist unerlässlich, da das manuelle Auslösen einzelner Muskel­fasern schwer zu erlernen ist, weil sie eine spezielle praktische Schulung, ein tiefes Verständnis und das Erlernen von Mikrodissektionstechniken, sorgfältige Beobachtung sowie eine große Portion Geduld erfordert. Vor Beginn kalibrieren Sie den Mikroskop-Setup zur Messung von URA zwei Fluoreszenz. Obwohl die Anregungs­wellenlängen für die Calciumbindung und Calcium drei URA zwei drei 40 und drei 80 Nanometer betragen, kann der optimale Dynamikbereich des URA-zwei-Verhältnisses für die Calciummessung bei anderen Wellenlängen in einem bestimmten Mikroskopsystem auftreten.

Derartige Verschiebungen der Wellenlängen beruhen auf Änderungen des optischen Pfads durch zusätzliche verschiedene optische Komponenten. Ebenso variiert der ISO-spastische Punkt für jedes System. Daher ist es wichtig, diese Wellenlängen durch Spektralscannen zu bestimmen.

Alternativ kann der Ming-Screening durch eine bloß fluoreszierende Aufnahme bei zwei beliebigen Wellenlängen erfasst werden, sodass der Endwert unabhängig von der Calciumkonzentration ist. Beginnen Sie damit, kultivierte K Ys SE eine 50 Zellen mit Plasmiden zu durchschneiden, die RFP exprimieren und entweder HRNA spezifisch gegen oder I eine oder eine zufällige Sequenz für 48 Stunden enthalten. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen in Schalen mit Glasboden.

Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen mit einer isotonischen Salzlösung oder BSS ab. Nach der Spülung geben Sie ein Milliliter BSS mit zwei Mikromolar RA 2:00 AM hinzu und inkubieren die Schale 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie die Zellen anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Umwandlung der intrazellulären URA 2:00 AM-Form in URA zwei zu ermöglichen.

Waschen Sie die Platte anschließend zweimal unter dem Mikroskop mit BSS. Wählen Sie im Visualisierungsmodus die Zellen aus, die RFP exprimieren. Wählen Sie den Anregungsverhältnis-Modus mit der Emissionswellenlänge von 510 Nanometern und den Anregungs­wellenlängen bei 350 und 390 Nanometern.

Das Verhältnis wird im dritten Fenster angezeigt. Danach aufzeichnen. Die Fluoreszenz der ausgewählten Zellen bei vorbestimmten Wellenlängen, während die Zellen mit vier verschiedenen Lösungen perfundiert werden.

Ebenso werden KYSE 150-Zellen mit Fura-2 beladen und der Aufnahme unterzogen. Im Anregungsverhältnis-Modus wird im Gegensatz zum vorherigen Verfahren eine Anregungswellenlänge von 360 Nanometern gewählt. Anschließend wird die Fluoreszenz bei 360 und 390 Nanometern gleichzeitig aufgezeichnet, während die Zellen mit fünf verschiedenen BSS-Lösungen perfundiert werden.

Für dieses Protokoll müssen C2C12-Zellen, eine murine myogene Zelllinie, auf Glasbodenkulturschalen bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend in Differenzierungsmedium mit 2,5 % Pferdeserum zu Myotuben differenziert werden. Beladen Sie die C2C12-Myotuben mit einer Endkonzentration von fünf µM RA200AM in BSS-Lösung und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang. Geben Sie danach eine Endkonzentration von 20 µM Benzothiazolamin (BTS) zu, um Muskelkontraktionen und die dadurch verursachten Bewegungsartefakte zu hemmen.

Die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und BTS in allen Lösungen beibehalten. Danach vier ausgewogene Salzlösungen in das Perfusionsystem geben.

Wie zuvor beschrieben. Registrieren Sie während jedes Perfusionsvorgangs die Fluoreszenz ausgewählter Zellen bei 360 und 390 Nanometern. In dieser Serie werden Magnesium und Thap-Argen gemeinsam appliziert, um die Quenchung durch Magnesiumionen zu überwachen.

Während die Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums abgebaut werden. Um den Musculus extensor digitorum longus oder EDL-Muskel zu präparieren, positionieren Sie das Bein einer euthanasierten Maus seitlich und entfernen Sie die Haut vom Knöchelbereich bis zum Knie. Schneiden Sie die oberflächlichen Muskelgewebeschichten durch, um den EDL freizulegen, und durchtrennen Sie sowohl die obere als auch die untere Sehne, um den intakten EDL-Muskel zu lösen.

Es ist wichtig, die Länge der Sehnen so lang wie möglich zu halten. Um Kontraktionen zu verhindern, überführen Sie nun den EDL unter einem Stereomikroskop in eine T-Road-Lösung, die 0,1 Millimolar EGTA und kein Calcium enthält. Drücken Sie die Sehnenansätze am Knie in zwei Hälften und teilen Sie den EDL-Muskel in zwei Bündel auf.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis acht Bündel erhalten sind. Falls Sehnen aus einem Bündel verloren gehen, entsorgen Sie das Bündel. Greifen Sie danach beide Sehnen eines EDL-Bündelstreifens und dehnen Sie den Streifen vorsichtig, bis drei oder vier getrennte einzelne Muskel­fasern mit Sehnengewebe an beiden Enden erhalten bleiben.

Geben Sie einen Tropfen kalziumfreies Tyro-Puffer in eine Glasboden-Schale. Legen Sie die EDL-Streifen gerade in die Schale und entfernen Sie schnellstmöglich so viel Lösung wie möglich. Anschließend befestigen Sie beide Sehnen mit wasserfester Tesafilm fest auf der Schale.

Waschen Sie die Faser zuerst mit der calciumfreien Lösung und anschließend zweimal mit einer 2,5 Millimolar Calciumlösung. Falls eine Hyperkontraktion der Faser und Schäden bemerkt werden, entsorgen Sie die Faser, waschen die ausgewählten gesunden Muskel­fasern dreimal mit Waschlösung Nummer eins und geben sie danach für fünf Minuten in eine modifizierte intrazelluläre, der Hautung ähnliche Lösung. Entfernen Sie mechanisch die Umhüllung der Faser unter einem Stereomikroskop mit einer an einen Nadelführer befestigten Wolframnadel; die Fasern verschließen sich wieder und speichern so Road 5 n, konjugiert mit Calcium, in den Querkanälchen ein.

Das Gewinnen gesunder, einzelner, intakter Muskel­fasern oder zumindest Bündel solcher Fasern, an denen noch etwas Sehne angeheftet ist, ist meiner Ansicht nach einer der schwierigsten Schritte, dem stets die sehr anspruchsvolle Übertragung dieser Fasern in die endgültige Versuchs­kammer folgt. Während dieses Vorgangs können die Fasern übermäßig kontrahieren oder sogar reißen. Wenn Sie daher gesunde Fasern haben, wird das mechanische Beladen des SR deutlich einfacher. Inkubieren Sie die Fasern in der Auf­skinnungs­lösung mit 20 µM Fluo-5N AM.

Im Anschluss an die Inkubation erfolgen ausgiebige Wäschen und eine zusätzliche 30-minütige Inkubation mit Waschlösung Nummer zwei, um eine vollständige Deesterifizierung des Farbstoffs zu ermöglichen. Die Fasern können anschließend mithilfe eines konfokalen Mikroskops mit einem 60×-Objektiv aus interessierenden Bereichen visualisiert werden. Gleichzeitig wird die Fluoreszenz jedes Farbstoffs aufgezeichnet, während die Faser mit SR-Lade- und SR-Depletionslösungen perfundiert wird.

Die SOCE-Aktivität in KYS-, SE- und 50-Zellen wurde mittels intrazellulärer Kalziummessung untersucht. Die Zellen wurden ko-transfiziert mit RFP und einem kurzen Haarnadel-RNA gegen das OR-I-1-Gen, das den A-S-O-C-E-Kanal kodiert, verglichen mit Kontrollen, dargestellt durch die schwarze Spur. Die Herunterregulierung der I-1-Expression führte zu einer verminderten SOCE-Aktivität. SOCE in KYC-1-50-Zellen wurde ebenfalls mit dem Mangan-Quenching-Assay bestätigt. Nachdem TG die Kalziumspeicher des ER vollständig erschöpft hatte, führte die Zufuhr von Mangan zu einer signifikanten Abnahme der Fluoreszenz.

Die steilere Abnahme der URA-Signalintensität weist auf eine aktivere SOCE hin. Somit deutet die langsame Abnahme der Fluoreszenz in zwei mit A PB behandelten Zellen darauf hin, dass die SOCE-Aktivität durch diese Verbindung blockiert wurde. Die Mangan-Quenchraten wurden aus den ersten 10 Sekunden bestimmt, in denen das Quenching noch im linearen Bereich ohne Sättigung lag; ein ähnlicher Mangan-Quench-Assay wurde in kultivierten Muskelzellen durchgeführt.

In diesem Fall wurde Mangan zusammen mit TG appliziert. Während TG die Kalziumspeicher des SR leerte, änderte sich die Steigung der Fluoreszenzlöschung allmählich, bis sie ihre maximale Rate erreichte. Die sigmoide Kurve zeigte die gestufte Aktivierung der SOCE unter diesen experimentellen Bedingungen an.

Bei der konfokalen Bildgebung zeigte die Überlappung von markierten Fasern im TT-Kompartiment mit Road Five und Die im roten Kanal das charakteristische Doppelpuls-Muster der Säugetiere. Nach der Beladung des SR mit Flow Five NM war im grünen Kanal nach der Perfusionsbehandlung der enthauteten Faser mit der TTSR-Ladelösung das typische punktförmige SR-Muster sichtbar. Die Fluoreszenzintensität sowohl von Road Five N als auch von Flow Five N stieg nach der Perfusionsbehandlung mit der SR-Depletionslösung an. Die Fluoreszenzwerte im SR-Kompartiment und im TT-Kompartiment begannen abzunehmen. Dies deutete auf eine Kopplung zwischen der Depletion der SR-Calciumspeicher und der SOCE-Aktivierung hin.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man zunächst lebensfähige, wirklich gesunde und intakte Muskel­fasern gewinnt. Diese müssen an ihren Enden ausreichend Sehnen­gewebe aufweisen, um einen effektiven Hautprozess zu ermöglichen, wodurch letztendlich dem Experimentator eine physiologisch relevante Präparation mit einem erstaunlichen Vorteil zur Verfügung steht. Vergessen Sie nicht, dass alle in dieser Studie verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe in der Regel lichtempfindlich sind, und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Beladen im abgedunkelten Gefäß sowie das Waschen im Dunkelraum stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

Wenn diese Technik beherrscht wird, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Wir empfehlen, zunächst mehrere intakte Fasern zu gewinnen, um eine höhere Erfolgsquote bei den mechanischen Dünnschneitschritten zu erreichen, und falls gewünscht, diese Fasern über Nacht zu kultivieren, nachdem die Methode etabliert wurde. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Kalziumsignalisierung, um die Rolle der speicherbetätigten Kalziumaufnahme beim Wachstum und beim Absterben von Krebszellen zu untersuchen.

Die physiologische und pathologische Funktion im Muskel.