Name: Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) in lebenden Krebs- und Skelettmuskelzellen mit fluoreszenzbasierten Methoden messen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Calciumdynamiken mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

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Wir danken Dr. Noah Weisleder zum Lesen und Editieren von diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien UMDNJ Stiftung 62-09 bis ZP, American Heart Association SDG2630086 zu XZ, 0535555N zu MB, und National Institutes of Health RC2AR058962-01 bis MB unterstützt.

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<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Obwohl die Anregungswellenlängen für Ca 2 +-Bindung und Ca 2 +-freien Fura-2 340 nm und 380 nm sind jeweils das beste Verhältnis Dynamikbereich von Fura-2 für Ca 2 +-Konzentration Messung kann bei anderen Wellenlängen bei einer bestimmten Mikroskop-System. Solche Verschiebungen in der Wellenlänge sind in der Regel aufgrund von Änderungen in dem optischen Pfad mit der Zugabe von verschiedenen optischen Komponenten. In dieser Studie wurden die Anregungswellenlängen für Fura-2 als 350 nm und 390 nm zur Spektralanalyse von Fura-2 Fluoreszenz bestimmt. Die intrazellulären Ca 2 +-Ebene im Zytosol resultiert aus einem Gleichgewicht aus mehreren Quellen, einschließlich intrazellulärer Ca 2 +-Freisetzung, extrazellulären Ca 2 +-Eintrag, sowie Ca 2 +-Ausschluss-Mechanismus an der ER und Plasmamembran. Um die unidirektionale SOC-vermittelte Ca 2 +-Einstrom aus intrazellulären Ca 2 +-Freisetzung und Ca 2 + extr isolierenusion, kann die Mn 2 + Abschrecken des Tests verwendet werden. Mn 2 + ist bekannt, können in die Zellen über SOCE Permeat aber undurchlässig für Oberflächenmembran Extrusion oder ER Aufnahme von Ca 2 +-Pumpen. Daher stellt Fluoreszenzlöschung eine Messung der unidirektionalen Mn 2 +-Fluss in die Zellen, die den Grad der Aktivierung des SOCE schätzt. Mn 2 + Abschrecken Test wird bei der isosbestischen Punkt durchgeführt, an solchen Wellenlänge Fura-2-Fluoreszenzintensität ist unabhängig von Ca 2 +-Konzentration. Die isosbestischen Punkt für jedes System sollte durch Scannen Spektrum bestimmt werden. Alternativ kann Mn 2 + Abschrecken durch angepasste Fluoreszenz bei zwei beliebigen Wellenlängen so dass der endgültige Wert unabhängig von Ca 2 +-Konzentration 13 aufgezeichnet werden. Um die räumlichen und zeitlichen Informationen der Tätigkeit der SOCE in der Skelettmuskulatur zu gewinnen, verwendeten wir eine Dual-Farbstoff-Methode, die gleichzeitige MeasureMe erlaubtnt von SOCE Aktivität und SR Ca 2 +-Gehalt in enthäuteten erwachsener Säugetiere EDL Muskelfasern. Die Korrelation zwischen den Veränderungen im SR Ca 2 +-Gehalt und SOCE Aktivität kann aufgetragen, um die Schwelle und Empfindlichkeit der SOCE Aktivierung zu einer Erschöpfung des SR Ca 2 +-Lagerung hinzuweisen. Der TT-loading Lösung ist optimiert, um zusätzlich laden die T-Tubuli mit Ca 2 + und für die Grundierung der T-Tubuli und der SR-loading-Lösung wurde entwickelt, um maximale SR Ca 2 +-Beladung zu fördern und zusätzlich laden die T-Tubuli mit ~ 500 uM Ca 2 +. FCCP befindet sich im TT / SR-loading-Lösung und der SR-abbauenden Lösung, um die Effekte aus den Mitochondrien eliminieren enthalten.

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte: <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham &#39;s F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Dish </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, Dichtung eng, vor Licht geschützt, in DMSO gelöst </td></tr><tr><td> Fluo-5N Uhr </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, Dichtung dicht, von l geschütztight </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, Dichtung eng, vor Licht geschützt </td></tr><tr><td> Quarzküvette </td><td> Starna Cells </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase Typ I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Ausstattung: <ol><li> Ein Spektrofluorometer (Photon Technology International, New Jersey): Xenon-Bogenlampe, computergesteuerten High-Speed-Random-Access-Monochromator, Küvetten-basierte Emissionsmonochromator, Nikon TE-200 invertierte Fluoreszenz-MikroskopE, S Fluor 40x/1.30 Öl-Objektiv, PMT-Detektoren. </li><li> Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (BioRad Radiance2100): 453/477/488/514 Argonlaser, HeNe-Laser 543nm, Nikon TE2000 inversen Mikroskop, 60x Objektiv (NA 1.4, Öl). </li><li> Ein Stereomikroskop mit einer Vergrößerungsleistung&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

fluoreszenz-basierte messung von calcium-shop-eintrag in lebenden zellen: aus kultivierten krebszelle zu skelettmuskelfaser

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Shop betrieben Ca 2 +-Eintrag (SOCE), früher nannte kapazitiven Ca 2 +-Eintrag, ist ein stark regulierter Mechanismus zum Einstrom von extrazellulären Ca 2 + in Zellen mit abgereichertem Endoplasmatischen Retikulum (ER) oder sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Ca 2 + wieder aufzufüllen 1,2. Da Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges second messenger, ist es nicht überraschend zu sehen, dass SOCE spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Proliferation, Apoptose, Gen-Transkription und Motilität. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung in nahezu allen Zelltypen, einschließlich Epithelzellen und Skelettmuskulatur, hat dieser Signalweg großes Interesse 3,4 erhielt. Allerdings sind die Heterogenität der SOCE Eigenschaften in verschiedenen Zelltypen und die physiologische Funktion noch nicht klar, 5-7. Die funktionellen Eigenschaften von Kanal SOCE kann durch Patch-Clamp-Studien enthüllt werden, während ein großer Teil der Kenntnisse über this-Mechanismus wurde durch Fluoreszenz-basierten intrazellulärer Ca 2 +-Messungen wegen seiner Bequemlichkeit und Machbarkeit für das Hochdurchsatz-Screening gewonnen werden. Das Ziel dieses Berichtes ist es, ein paar Fluoreszenz-basierten Methoden zusammenfassen, um die Aktivierung von SOCE in Monolayer-Zellen, suspendierten Zellen und Muskelfasern 5,8-10 messen. Die am häufigsten von dieser Fluoreszenz-Methoden verwendet, ist die direkte Überwachung der Dynamik der intrazellulären Ca 2 + aus dem Verhältnis von F und F 340 nm 380 nm (510 nm für die Emissions-Wellenlänge) des ratiometrische Ca 2 +-Indikator Fura-2. Um die Aktivität von unidirektionalen SOCE von intrazellulärer Ca 2 +-Freisetzung und Ca 2 +-Extrusion zu isolieren, wird ein Mn 2 +-Quenching-Assay häufig verwendet. Mn 2 + ist bekannt, können in die Zellen über SOCE Permeat während es undurchlässig für die Oberflächenmembran Extrusionsverfahren oder ER Aufnahme von Ca 2 + Pumpen aufgrund seiner sehr hohen Affinität nämlichh Fura-2. Als Ergebnis stellt das Abschrecken Fura-2 Fluoreszenz durch den Eintrag von extrazellulärem Mn 2 + in den Zellen induziert eine Messung der Aktivität von SOCE 9. Quotientenmeßschaltung und die Mn +2 Abschrecken Assays können auf einer Küvette-basierten Spektrofluorometer in einer Zellpopulation Modus oder in einem Mikroskop-System, um einzelne Zellen zu visualisieren durchgeführt werden. Der Vorteil einer einzigen Zelle Messungen ist, dass einzelne Zellen unterzogen, um Gen-Manipulationen ausgewählt werden unter Verwendung von GFP oder RFP-Reporter, so dass Studien in genetisch modifizierten oder mutierten Zellen werden. Diese räumliche Merkmale SOCE strukturell spezialisierten Skelettmuskel in Haut Muskelfasern durch gleichzeitiges Überwachen der Fluoreszenz von zwei geringe Affinität Ca 2 +-Indikatoren erreicht werden und gezielt auf die Abteile der Muskelfaser, wie zB Fluo-5N in der SR und Rhod- 5N im transversalen Tubuli 9,11,12.

Das Ausmaß der store-betriebenen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Eintrag (SOCE) kann überwacht werden, unter Verwendung von fluoreszierenden Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatoren. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Löschung solcher Indikatoren Assays SOCE in kultivierten Zellen und Fasern der Skelettmuskulatur. Eine Technik, so dass räumliche und zeitliche Auflösung von SOCE durch konfokale Bildgebung von mechanisch gehäutet Muskelfasern wird ebenfalls beschrieben.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Der speichergesteuerte Ca2+-Einstrom (Store operated Ca2+ entry, SOCE), früher als kapazitativer Ca2+-Einstrom bezeichnet, ist ein eng regulierter Mechanismus für den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ in Zellen, um ...

Diese experimentelle Methode dient zur Aufklärung der Eigenschaften der speicherbetriebenen Kalziumaufnahme oder SOCE in Krebs- und Skelettmuskelzellen mithilfe fluoreszenzbasierter Verfahren. Dies wird erreicht, indem die Fluoreszenz von URA zwei in lebenden Zellen aufgezeichnet wird, die auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration empfindlich reagiert. Zusätzlich wird die Fluoreszenzlöschungsrate durch Zugabe von Mangan bei einer kalziumkonzentrationsunempfindlichen Wellenlänge gemessen, was direkt die Aktivierung der SOCE widerspiegelt und somit die Untersuchung der SOCE ermöglicht.In strukturell spezialisierten Skelettmuskelzellen werden Muskeln präpariert und enthäutet. Muskel­fasern werden hergestellt. Anschließend werden die Fasern mit Kalziumindikatoren geringer Affinität behandelt und deren interne Fluoreszenz überwacht.Diese Methoden zeigen, dass SOCE sowohl in nicht erregbaren Zellen als auch in Skelettmuskeln mit gestufter Aktivierung und enger Kopplung an den Gehalt der intrazellulären Kalziumspeicher existiert. Der Hauptvorteil dieser auf Fluorescein basierenden Technik gegenüber anderen Methoden wie der Elektrophysiologie oder dem Patch-Clamp-Verfahren besteht darin, dass sie einfach anzuwenden ist und sich für Studien an Zellpopulationen oder für Hochdurchsatz-Screenings eignet. Es ist wichtig, die richtige Ästhetikerin S für das rituelle metrische Umfeld und den Mag-Coning-Assay zu verwenden.Daher ist die Kalibrierung einzelner Geräte entscheidend, da jedes Gerät unterschiedlich ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist unerlässlich, da das manuelle Auslösen einzelner Muskel­fasern schwer zu erlernen ist, weil sie eine spezielle praktische Schulung, ein tiefes Verständnis und das Erlernen von Mikrodissektionstechniken, sorgfältige Beobachtung sowie eine große Portion Geduld erfordert. Vor Beginn kalibrieren Sie den Mikroskop-Setup zur Messung von URA zwei Fluoreszenz. Obwohl die Anregungs­wellenlängen für die Calciumbindung und Calcium drei URA zwei drei 40 und drei 80 Nanometer betragen, kann der optimale Dynamikbereich des URA-zwei-Verhältnisses für die Calciummessung bei anderen Wellenlängen in einem bestimmten Mikroskopsystem auftreten.Derartige Verschiebungen der Wellenlängen beruhen auf Änderungen des optischen Pfads durch zusätzliche verschiedene optische Komponenten. Ebenso variiert der ISO-spastische Punkt für jedes System. Daher ist es wichtig, diese Wellenlängen durch Spektralscannen zu bestimmen.Alternativ kann der Ming-Screening durch eine bloß fluoreszierende Aufnahme bei zwei beliebigen Wellenlängen erfasst werden, sodass der Endwert unabhängig von der Calciumkonzentration ist. Beginnen Sie damit, kultivierte K Ys SE eine 50 Zellen mit Plasmiden zu durchschneiden, die RFP exprimieren und entweder HRNA spezifisch gegen oder I eine oder eine zufällige Sequenz für 48 Stunden enthalten. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen in Schalen mit Glasboden.Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen mit einer isotonischen Salzlösung oder BSS ab. Nach der Spülung geben Sie ein Milliliter BSS mit zwei Mikromolar RA 2:00 AM hinzu und inkubieren die Schale 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie die Zellen anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Umwandlung der intrazellulären URA 2:00 AM-Form in URA zwei zu ermöglichen.Waschen Sie die Platte anschließend zweimal unter dem Mikroskop mit BSS. Wählen Sie im Visualisierungsmodus die Zellen aus, die RFP exprimieren. Wählen Sie den Anregungsverhältnis-Modus mit der Emissionswellenlänge von 510 Nanometern und den Anregungs­wellenlängen bei 350 und 390 Nanometern.Das Verhältnis wird im dritten Fenster angezeigt. Danach aufzeichnen. Die Fluoreszenz der ausgewählten Zellen bei vorbestimmten Wellenlängen, während die Zellen mit vier verschiedenen Lösungen perfundiert werden.Ebenso werden KYSE 150-Zellen mit Fura-2 beladen und der Aufnahme unterzogen. Im Anregungsverhältnis-Modus wird im Gegensatz zum vorherigen Verfahren eine Anregungswellenlänge von 360 Nanometern gewählt. Anschließend wird die Fluoreszenz bei 360 und 390 Nanometern gleichzeitig aufgezeichnet, während die Zellen mit fünf verschiedenen BSS-Lösungen perfundiert werden.Für dieses Protokoll müssen C2C12-Zellen, eine murine myogene Zelllinie, auf Glasbodenkulturschalen bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend in Differenzierungsmedium mit 2,5 % Pferdeserum zu Myotuben differenziert werden. Beladen Sie die C2C12-Myotuben mit einer Endkonzentration von fünf µM RA200AM in BSS-Lösung und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang. Geben Sie danach eine Endkonzentration von 20 µM Benzothiazolamin (BTS) zu, um Muskelkontraktionen und die dadurch verursachten Bewegungsartefakte zu hemmen.Die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und BTS in allen Lösungen beibehalten. Danach vier ausgewogene Salzlösungen in das Perfusionsystem geben.Wie zuvor beschrieben. Registrieren Sie während jedes Perfusionsvorgangs die Fluoreszenz ausgewählter Zellen bei 360 und 390 Nanometern. In dieser Serie werden Magnesium und Thap-Argen gemeinsam appliziert, um die Quenchung durch Magnesiumionen zu überwachen.Während die Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums abgebaut werden. Um den Musculus extensor digitorum longus oder EDL-Muskel zu präparieren, positionieren Sie das Bein einer euthanasierten Maus seitlich und entfernen Sie die Haut vom Knöchelbereich bis zum Knie. Schneiden Sie die oberflächlichen Muskelgewebeschichten durch, um den EDL freizulegen, und durchtrennen Sie sowohl die obere als auch die untere Sehne, um den intakten EDL-Muskel zu lösen.Es ist wichtig, die Länge der Sehnen so lang wie möglich zu halten. Um Kontraktionen zu verhindern, überführen Sie nun den EDL unter einem Stereomikroskop in eine T-Road-Lösung, die 0,1 Millimolar EGTA und kein Calcium enthält. Drücken Sie die Sehnenansätze am Knie in zwei Hälften und teilen Sie den EDL-Muskel in zwei Bündel auf.Wiederholen Sie den Vorgang, bis acht Bündel erhalten sind. Falls Sehnen aus einem Bündel verloren gehen, entsorgen Sie das Bündel. Greifen Sie danach beide Sehnen eines EDL-Bündelstreifens und dehnen Sie den Streifen vorsichtig, bis drei oder vier getrennte einzelne Muskel­fasern mit Sehnengewebe an beiden Enden erhalten bleiben.Geben Sie einen Tropfen kalziumfreies Tyro-Puffer in eine Glasboden-Schale. Legen Sie die EDL-Streifen gerade in die Schale und entfernen Sie schnellstmöglich so viel Lösung wie möglich. Anschließend befestigen Sie beide Sehnen mit wasserfester Tesafilm fest auf der Schale.Waschen Sie die Faser zuerst mit der calciumfreien Lösung und anschließend zweimal mit einer 2,5 Millimolar Calciumlösung. Falls eine Hyperkontraktion der Faser und Schäden bemerkt werden, entsorgen Sie die Faser, waschen die ausgewählten gesunden Muskel­fasern dreimal mit Waschlösung Nummer eins und geben sie danach für fünf Minuten in eine modifizierte intrazelluläre, der Hautung ähnliche Lösung. Entfernen Sie mechanisch die Umhüllung der Faser unter einem Stereomikroskop mit einer an einen Nadelführer befestigten Wolframnadel; die Fasern verschließen sich wieder und speichern so Road 5 n, konjugiert mit Calcium, in den Querkanälchen ein.Das Gewinnen gesunder, einzelner, intakter Muskel­fasern oder zumindest Bündel solcher Fasern, an denen noch etwas Sehne angeheftet ist, ist meiner Ansicht nach einer der schwierigsten Schritte, dem stets die sehr anspruchsvolle Übertragung dieser Fasern in die endgültige Versuchs­kammer folgt. Während dieses Vorgangs können die Fasern übermäßig kontrahieren oder sogar reißen. Wenn Sie daher gesunde Fasern haben, wird das mechanische Beladen des SR deutlich einfacher. Inkubieren Sie die Fasern in der Auf­skinnungs­lösung mit 20 µM Fluo-5N AM.Im Anschluss an die Inkubation erfolgen ausgiebige Wäschen und eine zusätzliche 30-minütige Inkubation mit Waschlösung Nummer zwei, um eine vollständige Deesterifizierung des Farbstoffs zu ermöglichen. Die Fasern können anschließend mithilfe eines konfokalen Mikroskops mit einem 60×-Objektiv aus interessierenden Bereichen visualisiert werden. Gleichzeitig wird die Fluoreszenz jedes Farbstoffs aufgezeichnet, während die Faser mit SR-Lade- und SR-Depletionslösungen perfundiert wird.Die SOCE-Aktivität in KYS-, SE- und 50-Zellen wurde mittels intrazellulärer Kalziummessung untersucht. Die Zellen wurden ko-transfiziert mit RFP und einem kurzen Haarnadel-RNA gegen das OR-I-1-Gen, das den A-S-O-C-E-Kanal kodiert, verglichen mit Kontrollen, dargestellt durch die schwarze Spur. Die Herunterregulierung der I-1-Expression führte zu einer verminderten SOCE-Aktivität. SOCE in KYC-1-50-Zellen wurde ebenfalls mit dem Mangan-Quenching-Assay bestätigt. Nachdem TG die Kalziumspeicher des ER vollständig erschöpft hatte, führte die Zufuhr von Mangan zu einer signifikanten Abnahme der Fluoreszenz.Die steilere Abnahme der URA-Signalintensität weist auf eine aktivere SOCE hin. Somit deutet die langsame Abnahme der Fluoreszenz in zwei mit A PB behandelten Zellen darauf hin, dass die SOCE-Aktivität durch diese Verbindung blockiert wurde. Die Mangan-Quenchraten wurden aus den ersten 10 Sekunden bestimmt, in denen das Quenching noch im linearen Bereich ohne Sättigung lag; ein ähnlicher Mangan-Quench-Assay wurde in kultivierten Muskelzellen durchgeführt.In diesem Fall wurde Mangan zusammen mit TG appliziert. Während TG die Kalziumspeicher des SR leerte, änderte sich die Steigung der Fluoreszenzlöschung allmählich, bis sie ihre maximale Rate erreichte. Die sigmoide Kurve zeigte die gestufte Aktivierung der SOCE unter diesen experimentellen Bedingungen an.Bei der konfokalen Bildgebung zeigte die Überlappung von markierten Fasern im TT-Kompartiment mit Road Five und Die im roten Kanal das charakteristische Doppelpuls-Muster der Säugetiere. Nach der Beladung des SR mit Flow Five NM war im grünen Kanal nach der Perfusionsbehandlung der enthauteten Faser mit der TTSR-Ladelösung das typische punktförmige SR-Muster sichtbar. Die Fluoreszenzintensität sowohl von Road Five N als auch von Flow Five N stieg nach der Perfusionsbehandlung mit der SR-Depletionslösung an. Die Fluoreszenzwerte im SR-Kompartiment und im TT-Kompartiment begannen abzunehmen. Dies deutete auf eine Kopplung zwischen der Depletion der SR-Calciumspeicher und der SOCE-Aktivierung hin.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man zunächst lebensfähige, wirklich gesunde und intakte Muskel­fasern gewinnt. Diese müssen an ihren Enden ausreichend Sehnen­gewebe aufweisen, um einen effektiven Hautprozess zu ermöglichen, wodurch letztendlich dem Experimentator eine physiologisch relevante Präparation mit einem erstaunlichen Vorteil zur Verfügung steht. Vergessen Sie nicht, dass alle in dieser Studie verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe in der Regel lichtempfindlich sind, und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Beladen im abgedunkelten Gefäß sowie das Waschen im Dunkelraum stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.Wenn diese Technik beherrscht wird, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Wir empfehlen, zunächst mehrere intakte Fasern zu gewinnen, um eine höhere Erfolgsquote bei den mechanischen Dünnschneitschritten zu erreichen, und falls gewünscht, diese Fasern über Nacht zu kultivieren, nachdem die Methode etabliert wurde. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Kalziumsignalisierung, um die Rolle der speicherbetätigten Kalziumaufnahme beim Wachstum und beim Absterben von Krebszellen zu untersuchen.Die physiologische und pathologische Funktion im Muskel.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Quelle: Heredia, D. J., et. al. ex vivo Bildgebung des zellspezifischen Calcium-Signalwegs an der dreigliedrigen Synapse des Maus-Zwerchfells. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Calciumdynamik an neuromuskulären Junktionen (NMJs) in einer transgenen Maus, die genetisch kodierte Calciumindikatoren exprimiert. Eine NJM wird durch fluoreszenzmarkierte Acetylcholinrezeptoren im Zwerchfell mit dem Nervus phrenicus identifiziert. Ein Bildsplitter wird verwendet, um...

Fluoreszenzbildgebung der Kalziumdynamik an neuromuskulären Verbindungen im Zwerchfell einer transgenen Maus

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Der vorliegende Artikel beschreibt die Durchführung eines intravitalen Bildgebungsansatzes zur Beobachtung der mechanisch induzierten Kalziumsignalisierung von eingebetteten Osteozyten in vivo in Echtzeit als Reaktion auf die mechanische Belastung des dritten Mittelfußknochens auf Gewebeebene.

Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca2+) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2+ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Erfahren Sie, wie Sie den Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) in lebenden Krebs- und Skelettmuskelzellen mit fluoreszenzbasierten Methoden messen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Calciumdynamiken mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

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