Name: Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie homogene Zellen mit erhöhter Produktivität in mehrschichtigen BD Falcon Multi-Flasks kultivieren. Diese Methode liefert drei- bis fünfmal höhere Zellausbeuten als herkömmliche T175-Flaschen.

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1. Protokoll zum Multi-Flaschen für die Zellkultur Einsatz <ol><li> Vorbereitung der Schiffe und das Hinzufügen von Zellsuspension <ol><li> Bereiten Sie das Zellwachstum Medium, wie gebraucht. </li><li> Line up Multi-Flask vertikal auf die Seite mit der Kappe nach oben auf die Arbeitsfläche (sterile Laminarströmungshaube). <ol><li> Diese Kolben sind in 3 und 5-Schicht-Formate und verwenden ein ähnliches Work-Flow-Muster als T-175 Kolben. </li></ol></li><li> Lösen und entfernen Sie caps. Fügen Sie benötigte Menge an vorgewärmten Medium in Kolben mit einem 50 oder 100 mL Pipette oder durch Ausgießen. <ol><li> Pipetten sind, die ≤ 10 ml kann der Boden des Gefäßes zu erreichen, wenn Multi-Flaschen vertikal mit Kappe nach oben gelegt werden. Pipetten ≥ 10 ml in das Gefäß sofort erreichen vergangenen Logo auf der Multi-Flask, wodurch eine komfortable Portal größere Mengen an Medien Schiff hinzuzufügen. </li></ol></li><li> Zur Vermeidung von Blasenbildung des Mediums erlauben Flüssigkeitsstrom zu flow entlang der Innenwand des Multi-Flask Deckel (logo-Seite). </li><li> Add Zellsuspension aus einer konzentrierten Zelle Lager in Wachstumsmedium durch die obere Schicht mit einem 10-ml-Pipette und Kappe Flaschen. Tipps: - Transport Multi-Flaschen auf einem Wagen zum Inkubator Ort und führen verbleibenden Schritte. - Die Zelle Aussaatdichte variiert je nach Zelltyp, mittel-und Kultur Dauer benötigen. Beginnen Sie mit der Aussaatdichte und Medien Lautstärke auf, dass im Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format verwendet. </li></ol></li><li> Mischen der Zellen <ol><li> Mix Position: Halten Sie den Multi-Flask aufrecht mit dem Logo nach Ihnen und wiederum gegen einen 45 °-Winkel im Uhrzeigersinn mit Mix-Anschluss nach oben ein. </li><li> Halten unter dem gleichen Winkel, sanft kippen Multi-Flask von vorne nach hinten (Hals von Ihnen weg), bis die Flüssigkeit in der oberen Schicht fließt vollständig downwards durch den Mix-Port. Pivot auf Mix-Port-Seite. </li><li> Ebenso sanft Rock Multi-Flask von hinten nach vorne (Hals nach dir) bis mittleren Abflüsse in vollem Umfang von der unteren Schicht nach oben hin durch den Mix-Port. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 ein weiteres Mal, um die ordnungsgemäße Durchmischung sicherzustellen. </li><li> Bringen Sie Multi-Flask zurück zur Mix-Position (Schritt 1.2.1) und fahren bis 1,3 Schritt </li><li> Alternativ können Zellsuspension extern aus dem Multi-Kolben hergestellt werden und Zellsuspension kann das Schiff mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Gießen aufgenommen werden. <ol><li> Mix-Port ermöglicht in-vessel Mischen von Zellen mit Medien und beseitigt die Notwendigkeit, große Mengen von Zellsuspensionen extern zu machen. </li><li> Es ermöglicht auch Medien Ausgleich über die Schichten des Multi-Flask </li></ol></li></ol></li><li> Äquilibrierung von Flüssigkeit <ol><li> Nach dem Mischen / Zugabe der Zellsuspension, um Platz Multi-Flask senkrecht auf einer ebenen Arbeitsfläche auszugleichen Flüssigkeitsvolumen Gleichunglly in allen Schichten. </li></ol></li><li> Partition Flüssigkeit in jeder Schicht <ol><li> Halten Sie den Multi-Flasche mit dem Logo nach Ihnen und einem 45 ° Winkel zu partitionieren die Flüssigkeit in jeder der Schichten im Uhrzeigersinn drehen. Tipp: - Für beste Ergebnisse ist es wichtig, eine ebene Arbeitsfläche für Steps 1,3-1,4 verwenden </li></ol></li><li> Transport <ol><li> Sobald Medien mit Zellsuspension wird partitioniert, Transport Multi-Flask gleichzeitig Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn) wie in Schritt 1.4.1 mit den Medien vom Mix-Port in Inkubator. Diese Position eignet sich auch bei der Entfernung von Flaschen aus Inkubator für die Wiedergabe auf einem Mikroskop. </li></ol></li><li> Platzieren Multi-Flask auf Inkubator Regal <ol><li> Halten Multi-Flask im Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn, weg von Mix-Port), drehen Sie ihn leicht nach unten waagerecht auf dem Inkubator Oberfläche (unter Verwendung der Ecke weg von der Mix-Port alsPivot). Lay Multi-Kolben mit Logo nach oben zeigt. <ol><li> Falcon Multi-Flask Design ermöglicht Schiffen gestapelt werden und hält sie an ihrem Platz durch ein robustes Stacking Rippe. </li></ol></li></ol></li><li> Verteilung von Zellen und Reagenzien <ol><li> Nach der Platzierung Multi-Flask flach auf Arbeitsfläche, sanft hin und her Rock-und Seiten-und her, um Zellen gleichmäßig zu verteilen auf Kultur Oberflächen dabei nicht um Flüssigkeit aus jeder Schicht zu verschütten. Stack-Flaschen. <ol><li> Dieser Kolben wird von optisch klaren Material und Zellen auf der letzten Schicht kann leicht an einem Mikroskop betrachtet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Medien Austausch <ol><li> Saugen Sie beim Kippen der Multi-Flask auf der linken Seite (mix-Port-Seite) mit dem Logo zu Ihnen zeigt. </li><li> Dann kippen, die Multi-Flask nach rechts, weiterhin alle restlichen Medien absaugen. </li><li> Fügen Sie entsprechende Menge an Medien und führen Sie die Schritte 1,3-1,7 </li></ol></li></ol> 2.Ernten von Zellen aus Multi-Flaschen <ol><li> Um Zellen, line up Multi-Flaschen senkrecht distanzieren und bringen jeden in die Position (Schritt 1.2.1) Mix. Vorsichtig auf den Kopf Flaschen mit dem Hals nach oben ein, um damit Medien auf die oberste Schicht der Multi-Flask abtropfen lassen. </li><li> Legen Sie eine 5 oder 10 mL Absaugen Spitze durch den Hals, bis Sie Flüssigkeitsstand in der Nähe des Mix-Anschluss zu erreichen. Saugen Sie erschöpft Medium. </li><li> Add Dissoziation Reagenz / Waschpuffer und bringen zu positionieren, wie in Schritt 1.2.1 Mix, dann gehen Sie und folgen Sie den Schritten von 1,3 bis 1,7. Neutralisieren mit Wachstumsmedium / Neutralisationsmittel und gießen Zellsuspension in ein Aufnahmerohr oder Invertzucker Kolben, so dass Zellen ablaufen die obere Schicht des Schiffes und sammeln Zellen mit Hilfe einer 10 ml Pipette. Tipp: Um Rückgewinnung von Zellen oder Reagenzien zu verbessern, bringen Multi-Flask zu positionieren (Schritt 1.2.1) mischen, kehren mit dem Hals in Richtung Bediener komplette Entwässerung von Medien aus al erlauben l Schichten auf die oberste Schicht. Dann kippen Multi-Flask zu 45 °-Winkel (weg von der Mix-Port) im Uhrzeigersinn drehen, während der Multi-Flask bleibt invertiert. Mit einer Pipette (1-10 mL), um alle verbleibenden Reagenzien sammeln. </li></ol> 3. Empf. Arbeitsvolumen in Falcon Multi-Flaschen Nährmedien 3-Schicht: 75-150 ml pro Multi-Flask 5-Schicht: 125-250 ml pro Multi-Flask Dissoziation Agent 3-Layer: ≥ 15 ml pro Multi-Flask 5-Schicht: ≥ 25 ml pro Multi-Flask Tipp: Beginnen Sie mit mittlerer Lautstärke in Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 mal in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format ausgewertet, so dass mL pro Flächeneinheit gleich bleibt. 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Design von Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/&gt; . Abbildung 1: Multi-Flask Zellkulturgefäße werden in einem 3 - und 5-Schicht-stapelbar Format für Scale-up von Zellen bieten 525 und 875 cm 2 Wachstum Oberfläche, bzw.. Pipette Zugang erleichtert Hinzufügen und Entfernen von Zellen und Reagenzien in-und außerhalb des Schiffes. Anwesenheit von Mix-Anschluss erlaubt eine schnelle in-vessel Misch-und Ausgleichsbecken von Medien in allen Schichten der Multi-Flask. . 2 Cell Yield mit Multi-Flask: Diese Schiffe sind im 3-Schicht-und 5-Schicht-Formate, die bis 3 entsprechen und 5-mal die Fläche des T-175 Flaschen zur Verfügung. Dementsprechend ≥ 3 und 5-mal (130 ± 6,8 x 10 6 und 218 ± 23,6 x 10 6 Zellen, bzw.) die Anzahl der BHK-21 (baby hamster kidney) Zellen wurden gezüchtet und erholte sich von Multi-Flask im Vergleich zu T-175 Flaschen (43,2 ± 3,5 x 10 6 Zellen; Abb.2a). Zell-Ertrag pro unit Oberfläche wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP (menschlichen Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie), Hep-G2 (human Hepatokarzinom Zelllinie), EcoPack 2-293 (human Nieren-Zelllinie) für einen Zeitraum von 48-96h (Abb.2b) in Nährmedien (35 ml pro Schicht), wie Zelle Anbieter (ATCC, Sigma und / oder Clontech) empfohlen kultiviert. Die Zellen wurden auf einem automatischen Vi-CELL-Zähler (1) aufgezählt. <img alt="2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg"> Abbildung 2A: Drei bis fünf mal die Anzahl der BHK-21 Zellen wurden gezüchtet und von 3 erholt - und 5-Schicht-Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen. Erwartete Rendite wurde mit meinen Zellausbeute von der Steuerung T-175 Flaschen von drei und fünf Mal für die 3 multipliziert - und 5-Schicht-Multi-Flaschen bzw. (n = 4 Flaschen / Format). <img alt="2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg"> 2B: Cell Ertrag pro cm 2 wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP, HepG2 und EcoPack2-293-Zellen. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 4 bis 6 Flaschen. BHK-21-Zellen (11.000 Zellen/cm2) wurden für 72 Stunden, LNCaP-Zellen (20.000 Zellen/cm2) und EcoPack2-293-Zellen (~ 35.000 Zellen/cm2) kultiviert wurden für 96 Stunden und HepG2-Zellen (25.000 Zellen / cm 2 kultiviert ) wurden 48 Stunden vor der Ernte kultiviert. 3. Medienverteiler unter Schichten von Multi-Flask Zellkulturmedium (DMEM; Invitrogen) wurde auf 5-Schicht-Multi-Flaschen (250 mL/5-layer Schiff) zugegeben und partitioniert in Schichten nach oben beschriebenen Protokoll. Medien Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Medien aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Gewicht von Flüssigkeit aus jeder Schicht wieder erwies sich als relativ einheitlich von Schicht zu Schicht, wie in Abb. 3 dargestellt. Sie sind wie folgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg"> Abbildung 3. Uniform Medien Verteilung in jeder der fünf Schichten eines 5-Schicht-Multi-Flask. Zellkulturmedium wurde Multi-Flaschen (250 ml/5-layer Schiff), äquilibriert und partitioniert werden, um einzelne Schichten aufgenommen. Die Medien wurde durch die Löcher in einzelne Schichten und Flüssigkeit Gewicht gebohrt gepumpt wurde aus jeder Schicht (n = 6 Flaschen) aufgenommen. 4. Zellverteilung zwischen Lagen von Multi-Flask Die Zellen können hinzugefügt und gemischt werden innerhalb des Multi-Flask. Wir simulierten Verteilung der Zellen zwischen den Schichten des Multi-Flask mit Perlen (10 um; Polysciences Inc.) eine ähnliche Größe wie Zellen. Bead Suspension wurde in Multi-Flask Schiff mit einer 10 ml Pipette durch die obere Schicht zugegeben und vermischt mit den Medien in das Schiff als described in das Protokoll über. Bead Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Flüssigkeit mit Bead-Suspension erfolgte aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Bead-Konzentration aus jeder Schicht wieder auf einem Coulter Counter abgelesen und notiert. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen im 3-Schicht Multi-Flaschen (Abb. 4a). Der Mix-Anschluss ermöglicht die homogene Verteilung der Zellen und Reagenzien zwischen Multi-Flask Schichten. <img alt="Abbildung 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg"> Abbildung 4A: Bead Verteilung in jeder der drei Schichten eines 3-Schicht-Multi-Flask. Eine Suspension von Perlen (3,6 x10 6 / ml) wurde auf Medium in Multi-Flaschen verzichtet hinzugefügt (Bead-Suspension: media Volumen beträgt 1:10, vol: vol) und gemischt, gefolgt von Gleichgewichts-und-Trennung mit Hilfe des Protokolls beschrieben. Bead-Konzentration aus jeder Schicht (Medium, durch Löcher auf jeder Schicht gebohrt gepumpt wird) wieder auf einem Coulter Count lesener und aufgezeichnet. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen in 3 - Schicht Multi-Flaschen (n = 5 Flaschen) Hier findest du repräsentative Bilder von Ecopack 2-293 Färbungsmuster von Zellen gezüchtet, um&gt; 80% Konfluenz auf 3-Schicht-Multi-Flaschen in ergänzt das Wachstum Medien. Zellmonoschichten wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt und Multi-Flask Schichten wurden dann abgeschnitten und Bilder gescannt (2). Beachten Sie, Zelle Musterung war homogen auf alle Schichten der Multi-Flask (Abb.4b). Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen Zelltypen untersucht (Daten nicht gezeigt). <img alt="4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg"> 4B: Diese Abbildung zeigt homogene Zellwachstum zwischen den Schichten des Multi-Flaschen. Ecopack-2-293 Zellen gezüchtet, um&gt; 80% Konfluenz in 3-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Multi-Flask Schiffe wurden geschnitten und jedes gefärbte Schicht wurde durchsucht. 5 Air Supply in Multi-Flask.: Analyse verbracht Medien mit BioProfile FLEX-Analysator (3,4) (Nova Biomedical) aus EcoPack2-293-Zellen für 96 Stunden kultiviert zeigten keinen Unterschied in der Sättigung der Zellen in 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen (81,03 gestiegen ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% Umgebungstemperatur O 2). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg"> Abbildung 5: Air-Sättigung (% Umgebungstemperatur O 2) von verbrauchten Medien waren in pre-mixed media aus 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen. EcoPack2-293-Zellen wurden in einer Dichte von 35.000 Zellen / cm 2 ausgesät und kultiviert für 96 Stunden vor der Media-Analyse (n = 3 Flaschen).

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</ol>

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.

Die aktuelle Studie zeigt die Steigerung der Produktivität, dass die Multi-Flask Design Forschern bietet. Zwar ist es wichtig, dass die oben genannten Schritte für eine optimale Leistung skizzierte bei der Verwendung von Multi-Flaschen folgen, gibt es nur wenige kritische Schritte in diesem Protokoll, das als wichtigste sind. Dazu gehören (i) Mischen von Zellen und Reagenzien mit dem Mix-Port innerhalb des Gefäßes (ii) den Transport von Multi-Kolben bei 45 °-Winkel nach Partitionierung Flüssigkeit in jeder der Schichten (iii) zur Multi-Flask flachen post Aufteilung in Uhrzeigersinn Inkubator. Der richtige Einsatz von Multi-Flask führt zur Produktion eines homogenen Zellpopulation innerhalb jedes Schiff, das in einer Umgebung, die kongruent zu T-175 Flaschen (5) ist kultiviert wird. Diese Schiffe verfügen über 3 und 5 mal mehr Zellen in einem ähnlichen Abmessungen wie der T-175 Kolben. Die 3 und 5-Schicht-Schiff bietet 525 und 875cm 2 von Wachstum-, respektive und bieten sowohl Platz als auch Arbeits-savings für die Nutzer. Tissue Culture Oberflächenbehandlung ist vergleichbar mit Standard-Flaschen so dass Scale-up, ohne die Notwendigkeit einer erneuten Optimierung der bestehenden Kultur Bedingungen oder Kompromisse bei der Qualität, Homogenität oder die Leistung der Zellen (6, 7). Dies bietet auch für die Vergleichbarkeit mit den zuvor gesammelten Daten. Diese Schiffe können auch mit Reagenzien wie Kollagen beschichtet werden, Fibronectin, Poly-D-Lysin an einen spezialisierten Substrat für den Anbau, Wachstum und Differenzierung von bestimmten Zelltypen wie Leberzellen 8, kertainocytes 9, Stammzellen in serum-freiem Medium gezüchtet bieten Formulierungen. Coating-Lösungen können mit minimal residual Flüssigkeitsretention entfernt werden, um Verschwendung von wertvollen Reagenzien sowie eine effektive Entfernung der Beschichtung Lösung vor der Kultivierung von Zellen zu reduzieren. Die empfohlene optimale Datenträger zur Kultivierung von Zellen in Multi-Kolben Bereich von 0,142 bis 0,287 ml / cm 2, die mit 25-50 ml pro Schicht zu übersetzen. Im Gegensatz zu anderen vielschichtigen Kolben, tseinem Produkt bietet eine Mischung-Port in das Gefäß, das eine schnelle in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe ermöglicht. Diverse Zelllinien, primären Kulturen und Stammzellen wurden bis effizient skaliert mit Multi-Flaschen. Diese Schiffe sind besonders vorteilhaft für Anwendungen, die eine große Zahl von Zellen, wie im High-Throughput-Screening, zur Herstellung von Impfstoffen, viraler Vektor Transfektionen und Zelltherapie zu verlangen. Einsparungen in Zeit, Raum, Arbeit und verringert das Abfallaufkommen sind der Schlüssel Gewinne der Multi-Flask im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen in einschichtigen Behältern. Wir können Kultur etwa das Dreifache der Zahl der Zellen ab 5 geerntet, T-175 Flaschen im gleichen Raum mit 3, 5-Schicht-Multi-Flaschen. Dieser Vorteil in platzsparender ist nicht nur auf T-175 beschränkt, sondern kann auch auf andere Schiffe ausgedehnt werden: ein Standard Rollflasche Apparat, der in gemeinsamen Labor Inkubatoren Häusern passt ~ 4 roller Flaschen (2200 ml), die jeweils 850cm 2-Oberfläche zur Verfügung stellt. In der gleichen Gegend, kann ~ 20, 5-Schicht-Multi-Flaschen untergebracht wodurch fünfmal das Wachstum Oberfläche zur Kultivierung von Zellen sein. Darüber hinaus mit einem Anstieg in der &quot;Go-Green&quot; Bewusstsein ist Optionen, um das Abfallaufkommen zu reduzieren höchst wünschenswert. In dieser Hinsicht gibt es einen 38% (5, T-175 Flaschen wiegen ~ 640g, während einer, 5-Schicht-Multi-Flask wiegt ~ 400g) Rückgang des Abfallaufkommens mit Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen und diese Vorteile führen in Abfällen Lager-und Entsorgungskosten und führen zu wirtschaftlichen Einsparungen für den Benutzer zu verringern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 3-Schicht-Tissue Culture-behandelten 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Cell Culture - BD Falcon Multi-Flaschen</a> </td></tr><tr><td> 5-Schicht-Tissue Culture-behandelten 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml Pipette </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipette </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml Pipette abgesaugt </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ml Polypropylen-konischen Rohr </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 Kolben Tissue Culture-behandelten </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Kristallviolett </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose Phosphat-Bouillon </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK-21 Zellen </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Polystyrolkugel </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Profile Analyzer </td><td> Nova Biomedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up von mammalian cell culture mit einem new mehrschichtige flask

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Eine wachsende Zahl von Zell-basierte Anwendungen erfordern eine große Anzahl von Zellen. Verwendung von Single Layer T-Flaschen, die ausreichend sind während der kleinen Erweiterung kann schwerfällig, umständlich und zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Um diesen Bedarf, die Leistung eines neuen mehrschichtigen Zellkulturgefäß eine einfache Skala Erleichterung der Gründung von Zellen aus einschichtigen T-Flaschen werden diskutiert. Die Kolben getestet werden in 3 - und 5-Schicht-Format und damit Kultur und vollständige Wiederherstellung der drei-bis fünfmal die Anzahl der Zellen im Vergleich zur T-175 Flaschen. Ein wesentliches Merkmal der BD Multi-Flask ist eine Mischung / Equilibrierung Port, schneller ermöglicht in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe und konsequent zu produzieren Zellen, die in einer Umgebung, die kultiviert werden können ist kongruent zu T-175 Flaschen. Das Design dieser Multi-Flaschen ermöglicht auch convenient Pipette Zugang zur Zugabe von Reagenzien und Zellen direkt in den Kolben sowie eine effiziente Rückgewinnung von wertvollen Zellen und Reagenzien und reduziert das Risiko der Kontamination durch Gießen. Für Anwendungen, bei denen Gießen über Pipettieren bevorzugt wird, kann das Design für minimal residual Flüssigkeitsretention, um Verschwendung von wertvollen Zellen und Reagenzien zu reduzieren.

Zellen spielen eine instrumentale und wachsende Rolle in der Forschung und der Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika. Mit diesem steigenden Bedarf an größeren Anzahl von Zellen brauchen wir effizientere und effektivere Wege für den Anbau und die Ernte Anlage abhängigen Zellen. Eine mehrschichtige Kolben mit den richtigen Features können diesem Zweck dienen.

Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask

Eine wachsende Zahl zellbasierter Anwendungen erfordert große Zellmengen. Die Verwendung von einschichtigen T-Flasks, die im kleinen Maßstab ausreichend sind ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie homogene Zellen mit erhöhter Produktivität unter Verwendung von BD Falcon Multi-Flasks mit drei oder fünf Schichten kultiviert werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst Medium in die Flasche gegeben und diese mit einer Zellsuspension beimpft wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Inhalt zu mischen und zu äquilibrieren, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.Der dritte Schritt besteht darin, den Transport aufzuteilen und das Gefäß flach in den Inkubator zu stellen. Der letzte Schritt ist die Gewinnung der in der Multiflasche gezüchteten Zellen. Letztendlich kann im Vergleich zu T175-Flaschen das Dreifache bis Fünffache an Zellausbeute gewonnen werden, da ein gleichmäßiges Zellwachstum in allen Schichten der Multiflasche vorliegt, weil ein neues Zellkulturgerät verwendet wird.Die visuelle Demonstration dieser Methode wird dringend empfohlen, da die Handhabungsschritte schwer vorstellbar sind. Mehrflaschen-Zellkulturgefäße sind in stapelbaren Ausführungen mit drei oder fünf Schichten erhältlich, um die Zellkultur zu vergrößern, und bieten jeweils Wachstumsflächen von 525 und 875 Quadratzentimetern, Pipettenzugang sowie die Möglichkeit, Zellen und Reagenzien einfach hinzuzufügen und aus dem Gefäß zu entnehmen. Der integrierte Mischanschluss ermöglicht eine schnelle Vermischung und gleichmäßige Verteilung des Kulturmediums in allen Schichten des Mehrflaschengefäßes.Um einen Multi-Flaschenkolben für die Zellkultur zu verwenden, stellen Sie das Gefäß zunächst senkrecht auf die Seite in eine sterile laminare Luftströmungshaube. Mit dem Verschlussende nach oben beschriften Sie den Multi-Flaschenkolben in dieser Position, bevor noch Inhalte hinzugefügt wurden, lösen und entfernen den Verschluss. Führen Sie eine 50 bis 100 Milliliter Pipette ein.Übergeben Sie das Logo unverzüglich, um pro Ebene 35 Milliliter vorgewärmtes Zellwachstumsmedium direkt in den Multiflasche zuzugeben. Um Blasenbildung im Medium zu vermeiden, lassen Sie den Flüssigkeitsstrom entlang der inneren Seitenwand der Multiflasche eintreten. Schließlich verwenden Sie eine Pipette mit einem Fassungsvermögen von weniger als oder gleich 10 Milliliter.Geben Sie die experimentelle Zellsuspension aus einer konzentrierten Zellkultur über die obere Schicht in das Wachstumsmedium und verschließen Sie den Kolben, um eine gleichmäßige Durchmischung der Zellen mit dem Medium zu ermöglichen und die Notwendigkeit zu vermeiden, große Volumina von Zellsuspensionen extern herzustellen. Heben Sie den Multiflask auf und halten Sie ihn aufrecht mit dem Logo zu Ihnen hin gerichtet, und drehen Sie das Gefäß gegen den Uhrzeigersinn in einen 45-Grad-Winkel. Halten Sie das Gefäß dann in diesem Winkel fest.Kippen Sie den Multiflakon vorsichtig von vorne nach hinten, wobei der Hals nach außen zeigt, bis die Flüssigkeit der oberen Schicht vollständig durch die Mischöffnung nach unten abfließt. Drehen Sie das Gefäß um die Mischöffnung und wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine ausreichende Vermischung der Zellen mit dem Medium zu ermöglichen. Bringen Sie den Multiflakon anschließend wieder in die gemischte Position zurück.Nach dem Mischen der Zellsuspension das Multiflasche senkrecht auf eine ebene Arbeitsfläche stellen, um das Flüssigkeitsvolumen gleichmäßig in allen Schichten zu verteilen. Um die Flüssigkeit schließlich in jede Schicht zu verteilen, halten Sie die Multiflasche mit dem Logo wie zuvor zu Ihnen hin ausgerichtet und drehen das Gefäß im Uhrzeigersinn um 45 Grad.Dabei darauf achten, dass die Flüssigkeit vom Mischanschluss ferngehalten wird. Sobald die Zellsuspension aufgeteilt wurde, das Multiflasche unter Beibehaltung des gleichen 45-Grad-Winkels im Uhrzeigersinn mit der Nährlösung vom Mischanschluss weg in den Inkubator transportieren, wobei das Gefäß in diesem Winkel gehalten wird. Anschließend die Multiflasche vorsichtig horizontal mit der Aufschrift nach oben auf die Oberfläche des Inkubators absenken, wobei die Ecke gegenüber dem Mischanschluss als Drehpunkt dient. Danach das Gefäß sanft vor und zurück sowie seitlich hin und her schaukeln, um die Zellen gleichmäßig auf den Kulturoberflächen zu verteilen.Darauf achten, dass beim Stapeln der Gefäße keine Flüssigkeit aus den einzelnen Schichten verschüttet wird. Sobald sie im Inkubator platziert sind, sicherstellen, dass das Medium weiterhin getrennt bleibt und vom Mischanschluss ferngehalten wird, wenn das Gefäß flach auf das andere aufgelegt wird. Zunächst den Multiflasche aufrecht halten, wobei das Logo nach innen zeigt.Danach eine fünf Milliliter-Aspirationspipette einsetzen und das erschöpfte Medium vollständig abziehen, um die Aspiration abzuschließen. Das Multiflasche im 45-Grad-Winkel gegen den Uhrzeigersinn haltend nach innen umkippen und die Aspiration zur maximalen Rückgewinnung fortsetzen. Während die Flasche nach innen gekippt ist, diese im Uhrzeigersinn neigen und das Restvolumen in der Ecke gegenüber dem Mischanschluss vor der Dissoziation abziehen.Falls erforderlich können die Zellmonolagen mit PBS gespült und in einen Abfallbehälter abgesaugt werden. Geben Sie nun den tripsin-EDTA-Dissociationsreagenz hinzu und bringen Sie das Gefäß wieder in die Mischposition. Nachdem, wie zuvor gezeigt, die Verteilung des Reagenzes gleichmäßig auf alle Schichten eingestellt wurde, inkubieren Sie die Flasche bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeitdauer.Nach der Neutralisierung der Lösung im Inaktivierungsreagenz und Wiederholung der Misch-, Equilibrierungs- und Phasentrennungsschritte die Zellsuspension in ein Aufnahmeröhrchen gießen. Zum Schluss das Multiflasche im Uhrzeigersinn auf einen Winkel von 45 Grad von dem Mischanschluss wegdrehen. Dabei das Gefäß invertiert halten.Verwenden Sie eine Pipette, um alle verbleibenden Reagenzien zu sammeln. Entnehmen Sie eine Aliquotportion der Zellen zur Bestimmung der Zellkonzentration. Bei Verwendung von Wachstumsmedium in einem dreischichtigen Multiflasche wird ein Zellkulturmediumvolumen von 75 bis 150 Milliliter empfohlen.Bei Verwendung eines Mehrflaschenkolbens mit fünf Schichten können pro Gefäß bis zu 125 bis 250 Milliliter inkubiert werden. Für Dissoziationsmittel können pro Dreischicht-Mehrflaschenkolben 15 Milliliter oder mehr zugegeben werden, bei Fünfschicht-Gefäßen 25 Milliliter oder mehr, wenn Dreischicht- und Fünfschicht-Mehrflaschenkolben verwendet werden. Drei- bis Fünfmal so viele Baby-Hamster-Nierenzellen wurden in den Mehrflaschenkolben gezüchtet und gewonnen im Vergleich zu T175-Flaschen, wie in diesem Balkendiagramm dargestellt.In dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Zellausbeute pro Flächeneinheit bei drei- und fünflagigen Multiflasks sowie T175-Flasks für Babyhamster-Nierenzellen gleich ist. Eine humane Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie, eine humane hepatische Karzinom-Zelllinie und eine humane Nierenzelllinie Eco Pack 293, alle in den geeigneten Wachstumsmedien für diese Daten kultiviert. Zellkultur.Dem Medium wurde zu fünf Schichten bestehenden Mehrfach-Flasks hinzugefügt und in Schichten aufgeteilt. Gemäß dem gerade demonstrierten Protokoll wurden anschließend Löcher in die einzelnen Schichten gebohrt, und das Medium aus jeder Schicht wurde abgepumpt und gemessen. Das Gewicht der aus jeder Schicht gewonnenen Flüssigkeit war relativ einheitlich von Schicht zu Schicht, was eine gleichmäßige Verteilung des Mediums im gesamten Gefäß bestätigt.Nach der Aufteilung in dieser Abbildung wurde eine simulierte Verteilung von Zellen zwischen den Schichten eines Mehrfachkolbens mithilfe von Kügelchen, die in ihrer Größe Zellen ähneln, durchgeführt, wie durch die hier dargestellten Daten belegt, die die pro Schicht gezählten Kügelchen zeigen. Der Mischanschluss ermöglichte eine homogene Verteilung der Kügelchen und Reagenzien zwischen den Schichten des Mehrfachkolbens. Hier sind repräsentative Bilder von Färbemustern von Zellen, die auf dreischichtigen Mehrfachkolben bis zu einer Konfluenz von mehr als 80 % kultiviert wurden.In ergänzten Wachstumsmedien wurden die Zellmonolagen fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die mehrschichtigen Flaschen wurden zerschnitten und die Bilder wurden gescannt. Beachten Sie die homogene Zellanordnung in allen Schichten der Mehrschichtflasche.Diese letzte Abbildung zeigt Daten aus einer Analyse von verbrauchtem Kulturmedium, das nach 96 Stunden aus Kulturen menschlicher embryonaler Nierenzellen mittels eines Bio Profile Flex-Analysators gewonnen wurde. Es wurde kein Unterschied in der Luftsättigung des aus den einzelnen Schichten von Fünfschicht-Mehrfachflaschen im Vergleich zu T175-Flaschen isolierten Mediums festgestellt. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Multiflasche verwendet, um die Produktivität zu steigern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

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