Name: Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Entfernung oberflächlicher Lymphknoten bei Mäusen zur Analyse immunologischer Reaktionen. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung vitaler Lymphozyten für Durchflusszytometrie-Studien.

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Wir bedanken uns bei Sylvie Lesage und alle Labor-Mitglieder für die kritische Durchsicht des Protokolls. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (MOP-77545) von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. Nathalie Labrecque wird durch ein Stipendium unterstützt FRSQ Senioren und Mélissa Mathieu erhielt eine NSERC Alexander Graham Bell Kanada Graduate Scholarship.

1. Vorbereitung Vor der Operation Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Rat am Animal Care-Richtlinien behandelt. <ol><li> Anästhesieren Mäusen durch Injektion von Ketamin / Xylazin (150/300 mg / kg, ip) oder durch Inhalation von Isofluran (2%, 1L Sauerstoff). Sofern vorhanden, sollte Isofluran verwendet, da es für eine bessere Kontrolle der Narkose Zeit und Tiefe ermöglicht werden. Auch wird der Sauerstoff zur gleichen Zeit, die die physiologischen Funktionen des Tieres verabreicht unterstützt. Darüber hinaus ist Isofluran direkt von den Lungen eliminiert und erfordert daher keine Leber oder Niere Stoffwechsel. </li><li> Inject Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) oder ein anderes Analgetikum. </li><li> Anwenden Salbe auf die Mausaugen vor der Operation Augentrockenheit zu vermeiden (wenn Isofluran verwendet wird). </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus schläft durch Kneifen der Pfote und rollen mit dem Schwanz. Wenn die Maus nicht reagiert, mit der Operation fortzufahren. </li></ol> 2. Die Chirurgie <pclass es ist m von den oberfl lymphknoten durch eine operation zu entfernen: die leisten-und brachialis. isolierung der ln einfacher in jungen schlanken wochen da das vorhandensein fettgewebe bei kann mit st allerdings wird diese einschr wiederholter f komfort ernten wir ein maximum lns einer zeit und wenn zeit-gang-experimente durchzuf jeden zweiten tag. auch infektion verhindern k antibiotika zur maus gegeben werden aber tun nicht wunden heilen just fine. man muss beachten dass abh experimentellen design verwendung eines antibiotikums beeinflussen ergebnis beobachtet b. antwort auf bakterium gemessen sie alle instrumente nach jedem gebrauch sterilisiert aseptischen bedingungen w verfahren beibehalten.><ol><li> Legen Sie die Maus auf die Seite. </li><li> Lokalisieren Sie die Region, wo Sie eine incisio durchführen wirdn in Abhängigkeit von der LN Sie ernten. (Abbildung 1). </li><li> Bewerben Chlorhexidin oder ein anderes Desinfektionsmittel, für diese Region. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere (ca. 5 mm) entweder auf der Rückseite der Vorderbeine oder oberhalb der Hinterpfote in der Nähe des Bauches (Abbildung 1). </li><li> Entfernen Sie die lose Haare du mit der Zange abgeschnitten haben. Wenn Sie möchten, können Sie die Maus vor dem Schnitt zu rasieren. Allerdings verlängert er das Verfahren und wir finden, dass es nicht notwendig, da, wie hier gezeigt, es zu keiner Verbesserung Heilung oder Abnahme Infektion, die beide sind sehr selten. </li><li> Dehnen Sie den Schnitt mit 2 Zangen, um die LN zu sehen. Der Schnitt könnte erreichen 10 mm. Der LN erscheint grau oder dunkler als die umgebende Fett. </li><li> Drücken Sie den Faszien (die dünne Membran, die den Fett-und Gewebe) auf der Oberseite der LN mit einer Zange und ziehen leicht, ohne das umliegende Gewebe. </li><li> Platzieren der zweiten Zange so weit wie möglich underneath den LN. Mit den ersten Pinzette, brechen die Faszie und entfernen Sie den LN. Wenn Sie erfolgreich die LN haben geerntet, sollte ein Blutfleck an der Stelle, wo die LN zuvor befand erscheinen. Beachten Sie, dass die LN versinkt in isotonischer Lösung. Dieser einfache Test erlaubt es zu prüfen, dass Sie ein LN und nicht das Fettgewebe extrahiert. </li><li> Stellen Sie sicher, dass keine Haare in der Wunde sind. </li><li> Die Inzision durch Kleben die 2 Teile der Haut zusammen (die Innenseite der Haut) und durch das Eintreiben sie mit einem Clip. Wir verwenden einige Michel Clip mit den Anlegezange. Installieren eines oder 2 Clips in Abhängigkeit von der Größe des Einschnitts. Meistens fallen die Clips aus, wenn das Gewebe heilt. </li></ol> 3. Postoperative Pflege <ol><li> Fügen Sie etwas Nassfutter an den Boden des Käfigs, so dass die Mäuse leicht aufnehmen können nach der Operation. </li><li> Über 6 bis 8 Stunden nach der Operation, überprüfen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen. Beachten Sie sorgfältig ihr Verhalten (Haltung, Gang, inInteraktion mit der Aromabestandteile und Aussehen des Fells). Wenn das allgemeine Erscheinungsbild der Mäuse ist schlecht, verwalten eine zweite Dosis von Buprenorphin. Am nächsten Tag sollten die Mäuse ihr normales Verhalten sonst wieder weiter die Verabreichung von Buprenorphin. Die Mäuse sollten nie erreichen die Endpunkte zuvor ermittelten und akzeptiert von Ihrer Animal Care Council. Vielleicht möchten Sie beraten zu lassen und dabei die Hilfe eines Technikers Tierpflege Vivarium. </li></ol> 4. Lymph Node Handhabung <ol><li> Im Labor, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, distanzieren die LN nach Ihren üblichen Verfahren. Wir drücken LN gegen gefrostet Dias und routinemäßig erhalten 1-2 x 10 6 Zellen pro LN. Alternativ bereiten wir den LN zur RNA-Extraktion. </li><li> Stain die Zellen wie pro Ihre übliche Protokoll. Sie sollten erhalten erwartet LN Durchflusszytometrie Profile. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht pCharge wird LNs von einem anästhesierten Maus durch eine Operation oder von einer Maus getötet (2) geerntet gezeigt. Das Profil und die Prozentsätze der Zellen in der Live-Lymphozyten sind die gleichen Gate zeigt, dass LN Operation eine geeignete Technik zum Ernten der Zellen ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Leistenbruch und brachialis LN Lokalisation in der Maus. A. Die inguinalen LN wird knapp oberhalb der Hinterpfote gelegen, leicht in Richtung Bauch. B. Die brachialis LN befindet sich hinter dem Vorderbein entfernt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Durchflusszytometrie Profil von Lymphozyten nach LN Chirurgie erhalten. Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profile werden für LNS aus einer Anesth geerntet gezeigtetized Maus durch eine Operation (A) oder von einer Maus getötet (B). LNs wurden geerntet, dissoziiert und analysiert mit einem Durchflusszytometer. Prozentsätze der Zellen in der Live-Lymphozyten Gate dargestellt. </pclass>

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben ein Protokoll von LN Operation, die zu vielen experimentellen Systemen anwenden können, beschrieben. Obwohl sehr nützlich, um Immunantworten oder Immunzellen Homöostase zu folgen, hat diese Technik einige Einschränkungen. Erstens kann nur vier LNs geerntet werden. Zweitens muss die Immunantwort untersucht werden systemische oder treten in den oberflächlichen Leisten-oder Arm-(Haut-Entleerung) LNS. Schließlich wird die Anzahl der Zellen geerntet von der Qualität des LN Entfernung, eine technische Beschränkung, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz Namen </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Graefe Feine Muster Premium-Zange </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-2144 </td><td> Stark gebogen, 10 cm (4 Zoll), 0,8 mm Spitze </td></tr><tr><td> Michel Clip Anwenden und Entfernen von Pinzetten </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 Zoll) </td></tr><tr><td> Michel Clip 100 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3746 </td><td> 7,5 bis 1,75 mm </td></tr><tr><td> Temgesic (Buprenorphin-Hydrochlorid) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (Ketamin Hydrochlorid) </td><td> Boniche Animal Healthcare </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (Xylazin) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears Augensalbe </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (Chlorhexidin Gluconat 2% in Isopropylalkohol 70%) </td><td> Omega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

murine oberflächliche lymphknoten chirurgie

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Auf dem Gebiet der Immunologie, um das Fortschreiten einer Immunantwort gegen ein Impfstoff, einer Infektion oder eines Tumors zu verstehen, wird die Antwort oft über die Zeit verfolgt. In ähnlicher Weise erfordert die Untersuchung von Lymphozyten Homöostase Zeitverlauf Experimenten. Durchführung dieser Untersuchungen innerhalb der gleichen Maus ist ideal, um die experimentellen Variabilität sowie die Anzahl der Mäuse zu verringern. Blutentnahmesystem ermöglicht Leistung Zeitverlauf Versuche, aber es gibt nur Informationen über zirkulierenden Lymphozyten und eine begrenzte Anzahl von Zellen 1-4. Da Lymphozyten durch den Körper zirkuliert und die ihren Wohnsitz in den Lymphknoten unterschiedliche Eigenschaften haben, ist es wichtig, beide Standorte zu untersuchen. Die sequentielle Entfernung der Lymphknoten durch eine Operation bietet eine einzigartige Gelegenheit, um eine Immunantwort oder Immunzellen Expansion in der gleichen Maus über die Zeit zu folgen. Darüber hinaus liefert diese Technik zwischen 1-2x10 6 Zellen pro Lymphknoten, die ausreicht, EWrform phänotypischen Charakterisierung und / oder funktionellen Assays. Sequential Lymphknoten Operation oder Lymphadenektomie wurde erfolgreich von uns und anderen 5-11 verwendet. Hier beschreiben wir, wie die brachialen und inguinalen Lymphknoten indem Sie einen kleinen Schnitt in der Haut eines anästhesierten Maus entfernt werden kann. Seit der Operation ist oberflächlich und schnell erledigt, die Maus sehr schnell erholt, heilt gut und nicht die Erfahrung, übermäßige Schmerzen. Alle zwei Tage, ist es möglich, ein oder zwei Lymphknoten Berücksichtigung Zeitverlauf Versuche ernten. Diese Technik eignet sich somit, um die Eigenschaften von Lymphknoten-Lymphozyten Wohnsitz im Laufe der Zeit zu untersuchen. Dieser Ansatz ist geeignet, um verschiedene experimentelle Designs und wir glauben, dass viele Labors würden von der Durchführung sequentieller Lymphknoten-Operationen profitieren können.

Um den Verlauf einer Immunantwort im Laufe der Zeit innerhalb der gleichen Maus folgen, können Lymphknoten sequentiell durch eine Operation entfernt werden. Hier beschreiben wir, wie diese Technik durchgeführt werden kann.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

Im Bereich der Immunologie wird zur Untersuchung des Verlaufs einer Immunantwort auf einen Impfstoff, eine Infektion oder einen Tumor die Antwort häufig ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lymphknoten von einer anästhesierten Maus chirurgisch zu entfernen. Dies wird erreicht, indem die Lymphknoten zuerst lokalisiert werden. Anschließend werden die Lymphknoten gewonnen und die Inzision wird verschlossen.Schließlich kann eine Einzelzell-Suspension für die experimentelle Analyse gewonnen werden. Letztendlich können lebensfähige Lymphozytenpopulationen mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Lokalisation und Entfernung von Lymphknoten angesehen werden müssen, um sie zu beherrschen.Nachdem die Maus anästhesiert wurde, Augensalbe auftragen, Buprenorphin injizieren und die Sedierung durch Zehenquetschung überprüfen, dann die Maus auf die Seite drehen. Zuerst den brachialen Lymphknoten lokalisieren und anschließend die zu dissezierende Region rasieren. Nachdem lose Haare abgebürstet wurden, die Region mit einem Desinfektionsmittel behandeln und dann einen kleinen Schnitt von etwa fünf Millimetern Länge an der Rückseite des vierbeinigen Beins vornehmen.Verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um den Schnitt so lange zu dehnen, bis der brachiale Lymphknoten sichtbar ist, der graulich oder dunkler als das umgebende Fett erscheinen kann. Dann zwicken Sie die den Lymphknoten bedeckende Faszie mit einem Pinzettenpaar. Platzieren Sie das zweite Pinzettenpaar so tief wie möglich unterhalb des Lymphknotens und ziehen Sie leicht an der Membran, ohne das umgebende Gewebe zu verletzen.Verwenden Sie dann das erste Paar Pinzetten, um die Faszie zu durchtrennen und den Lymphknoten zu entfernen. Wenn der Lymphknoten erfolgreich gewonnen wurde, erscheint eine Blutverfärbung an der Stelle, an der sich zuvor der Lymphknoten befand. Legen Sie den entfernten Lymphknoten in eine isotonische Lösung; wenn er sinkt, bestätigt dies, dass das gewonnene Gewebe ein Lymphknoten und kein Fettgewebe ist.Als Nächstes überprüfen, ob sich keine Haare in der Wunde befinden, und die Inzision schließen, indem man die beiden Innenseiten der Haut zusammenfügt und mit ein bis zwei Klammern verschließt, abhängig von der Größe der Inzision. Danach einen inguinalen Lymphknoten lokalisieren und die zu dissezierende Region rasieren. Nach dem Entfernen eventuell locker sitzender Haare einen Desinfektionsmittel auf die Region auftragen und anschließend einen kleinen Schnitt von etwa fünf Millimetern Länge oberhalb der Hinterpfote in Bauchnähe anlegen.Nachdem der Schnitt mit zwei Pinzetten, wie zuvor für den brachialen Lymphknoten gezeigt, geöffnet wurde, identifizieren Sie den inguinalen Lymphknoten, der sich in dem umgebenden Fettgewebe befindet. Entfernen Sie anschließend den Lymphknoten mit den beiden Pinzetten, wie gerade demonstriert. Bestätigen Sie erneut die erfolgreiche Entnahme des Lymphknotens, indem Sie die Blutung bemerken, die an der Stelle auftritt, an der sich der Lymphknoten zuvor befand, und geben Sie den inguinalen Lymphknoten danach in einen separaten Behälter mit isotonischer Lösung.Nachdem alle Lymphknoten entnommen wurden, das Mäuschen in einen Käfig setzen und Nassfutter hinzufügen, damit es leicht fressen kann. Etwa sechs bis acht Stunden nach der Operation das Mäuschen überprüfen, um sicherzustellen, dass es keine Schmerzen hat. Sorgfältig beobachten, ob Haltung, Gangbild, Interaktion mit Artgenossen und das Aussehen des Fells denen einer normalen, gesunden Maus entsprechen.Schließlich wird der Lymphknoten durch Andrücken gegen mattierte Objektträger in einer Petrischale dissoziiert und anschließend in ein Reagenzglas überführt, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Nach der Färbung der Zellen für die gewünschten Oberflächenantigene werden diese mittels Durchflusszytometrie analysiert. Hier sind beispielhafte Vorwärts- und Seitenstreu-Diagramme für Lymphknoten dargestellt, die von entweder anästhesierten oder getöteten Tieren gewonnen wurden.Die Profile und Prozentsätze der Zellen in den lebenden Lymphozyten-Toren der beiden Streudiagramme sind identisch. Dies zeigt, dass die Lymphknotenchirurgie eine geeignete Technik zur Gewinnung von Zellen ist. Sobald die Lymphknotenchirurgie beherrscht ist, kann sie pro Maus in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird.

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