Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lymphknoten bei einer anästhesierten Maus chirurgisch zu entfernen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lymphknoten lokalisiert werden. Die Lymphknoten werden entnommen und dann wird der Schnitt verschlossen.

Schließlich kann eine Einzelzellsuspension für die experimentelle Analyse erhalten werden. Letztendlich können lebensfähige Lymphozytenpopulationen mittels Durchflusszytometrie bewertet werden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Lokalisierung und Entfernung von Lymphknoten betrachtet werden muss, um sie zu beherrschen.

Nachdem Sie die Maus betäubt haben, tragen Sie Augensalbe auf, injizieren Sie Buprenorphin und bestätigen Sie die Sedierung durch Zehenkneifen, dann drehen Sie die Maus auf die Seite. Lokalisieren Sie zunächst den brachialen Lymphknoten und rasieren Sie dann die zu präparierende Region. Nachdem Sie alle losen Haare weggebürstet haben, tragen Sie ein Desinfektionsmittel auf die Region auf und machen Sie dann einen winzigen Schnitt von etwa fünf Millimetern auf der Rückseite der vier Beine.

Dehnen Sie den Schnitt mit zwei Pinzetten, bis der brachiale Lymphknoten zu sehen ist, der gräulich oder dunkler erscheinen kann als das umgebende Fett. Kneifen Sie dann die Faszie, die den Lymphknoten bedeckt, mit einer Pinzette zusammen. Platzieren Sie die zweite Pinzette so weit wie möglich unter dem Lymphknoten und ziehen Sie leicht an der Membran, ohne das umliegende Gewebe zu verletzen.

Lösen Sie dann mit der ersten Pinzette die Faszie und entfernen Sie den Lymphknoten. Wenn der Lymphknoten erfolgreich entnommen wurde, erscheint ein Blutfleck an der Stelle, an der sich der Lymphknoten zuvor befand. Legen Sie den herausgeschnittenen Lymphknoten in eine isotonische Lösung, wenn er absinkt, dies bestätigt, dass es sich bei dem entnommenen Gewebe um einen Lymphknoten und nicht um Fett handelt.

Vergewissern Sie sich anschließend, dass sich keine Haare in der Wunde befinden, und schließen Sie den Schnitt, indem Sie die beiden Innenseiten der Haut zusammenkleben und je nach Größe des Schnitts mit ein bis zwei Klammern festheften. Lokalisieren Sie nun einen Leistenlymphknoten und rasieren Sie die zu präparierende Region. Nachdem Sie alle losen Haare weggebürstet haben, tragen Sie ein Desinfektionsmittel auf die Region auf und machen Sie dann einen winzigen Schnitt von etwa fünf Millimetern über der Hinterpfote in der Nähe des Bauches.

Nachdem Sie den Schnitt mit zwei Pinzettenpaaren geöffnet haben, wie gerade für den brachialen Lymphknoten gezeigt, identifizieren Sie den Leistenlymphknoten, der sich im umgebenden Fettgewebe befindet. Entfernen Sie dann den Lymphknoten mit den beiden Pinzettenpaaren, wie gerade gezeigt. Bestätigen Sie erneut die erfolgreiche Entnahme des Lymphknotens, indem Sie den Blutfleck notieren, der dort auftritt, wo sich der Lymphknoten zuvor befand, und lassen Sie dann den Leistenlymphknoten in einen separaten Behälter mit isotonischer Lösung fallen.

Nachdem alle Lymphknoten entnommen wurden, setzen Sie die Maus in einen Käfig und fügen Sie Nassfutter hinzu, damit die Maus leicht fressen kann. Nach der Operation etwa sechs bis acht Stunden später überprüfen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen hat. Beobachten Sie genau, dass die Haltung, der Gang, die Interaktion mit dem Futter und das Aussehen des Fells dem einer normalen gesunden Maus ähneln.

Zum Schluss dissoziieren Sie den Lymphknoten, indem Sie ihn gegen frostige Objektträger in einer Petrischale drücken und dann in ein Röhrchen übertragen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nachdem Sie die Zellen auf die interessierenden Zelloberflächenantigene gefärbt haben, analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Hier sind Streudiagramme für Lymphknoten dargestellt, die entweder von anästhesierten oder getöteten Tieren entnommen wurden.

Die Profile und Prozentsätze der Zellen in den lebenden Lymphozytentoren der beiden Scatterplots sind identisch. Zeigen, dass die Lymphknotenoperation eine geeignete Technik zur Entnahme von Zellen ist: Einmal gemeistert, kann die Lymphknotenoperation in fünf bis 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.