Name: MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Erfahren Sie MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Analyse von Neuropeptiden in Rattenhirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die räumliche Kartierung behandlungsinduzierter Veränderungen bei Parkinson-Dyskinesie mit hoher molekularer Spezifität.

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Wir bedanken uns bei Hanna Warner für einen Beitrag die Daten für die Abbildung 3 und Prof. Jonas Bergquist für wertvolle Anregungen. Schwedischer Forschungsrat (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); der AKE Wiberg Stiftung (MA, JH), Die Königlich Schwedische Akademie der Wissenschaften (MA, JH), und die schwedische Chemical Society (JH) sind dankbar für finanzielle Unterstützung.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere Vorteile des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie Bildgebung in der Studie von Neuropeptiden. Eine unvoreingenommene Analyse der MS-Daten können zeigen, dass nur bestimmte Gehirnkernen oder wie in den Ergebnissen hier, wo nur in den dorsolateralen Teil des Striatums mit einer bestimmten pathophysiologischen Zustands zugeordnet ist dargestellt. Durch die Beibehaltung des räumlichen Informationen ist es dann möglich, Regions of Interest neu zu definieren, um statistische Analysen mit höherer Empfindlichkeit und geringere Variabilität im Vergleich mit der Analyse des gesamten Gehirns Teile oder mit traditionellen Peptidomics Studien über Peptid-Extrakte durchzuführen. Darüber hinaus ist es wichtig zu erkennen, MALDI IMS ohne weiteres bisher unbekannte post-translationale Modifikationen erkennen, aber Strukturanalysen folgen, um die genauen Aminosäurepositionen, die sich ändern zu bestimmen. Häufige Probleme bei der Visualisierung der MALDI IMS-Daten umfassen Abbilden der maximale Peak-Intensität zu einer linearen optischen Skala von black (0%) der Farbe (100%) für jeden Abschnitt in der Versuchsreihe (3) anstelle des Abbildens alle auf eine gemeinsame Absolutskala wobei 100% die maximale Peak-Intensität aller Abschnitte (5) . Die letztere Methode erlaubt den Vergleich der Gruppe Daten und die Visualisierung der Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Ein großes Hindernis bei der MALDI-IMS-Analyse ist die Zuordnung von Peptiden auf bestimmte Massenpeaks. On-Gewebe-Tandem-Massenspektrometrie ist es manchmal möglich, aber erweist sich oft als recht schwierig 13,14. Wir finden, dass eine herkömmliche Ansatz mit einer präparativen Fraktionierung auf einer starken Kationenaustauschchromatographie, durch Umkehrphasen-LC-MS/MS gefolgt erfolgreich Sequenz vielen Neuropeptiden und insbesondere Opioid Peptide können verwendet werden. Es ist noch nicht ungewöhnlich, dass gute Qualität MS / MS-Spektren, die nicht übereinstimmen alle Datenbankeinträge mit gängigen Suchmaschinen wie MASCOT zu erhalten. In diesen Fällen De-novo-Sequenzierung von Hand ist die ONLy-Option. Der endgültige Beweis für Peak Identität kann durch MALDI IMS von Gewebeschnitten aus der entsprechenden Knockout-Maus erhalten werden, aber dies ist nicht immer verfügbar oder möglich ist. Eine Alternative ist, um die Ergebnisse durch eine diametral andere Methode zu validieren, zum Beispiel durch Western Immunoblotting oder Immunhistochemie. Diese können oft von Antikörpern und eine erhebliche Menge an Arbeit Validierung der neuen Antikörper. Die allgemeine Strategie in diesem Protokoll vorgestellt wird, für groß angelegte Neuropeptid MALDI IMS Experimente, darunter mehrere Abschnitte und experimentellen Bedingungen optimiert. Das Protokoll wurde speziell für Opioidpeptide optimiert worden und wird große Auswirkungen in zukünftigen Studien haben, wie es in den unterschiedlichsten Bereichen der Forschung, einschließlich der Mechanismen, die Schmerzen und die körpereigene Reaktion auf Medikamente von Sucht beschäftigt.

1,1 Probengewinnung und-vorbereitung <ol><li> Isofluran (Apoteksbolaget AB, Schweden) </li><li> Chirurgische Instrumente; zwei Scheren, ein Rongeur, Spachtel </li><li> Fein gemahlen Trockeneis </li><li> Alufolie und Plastiktüten für die Lagerung </li><li> Kryostaten (Microm, Heidelberg, Deutschland) </li><li> Indium-Zinnoxid (ITO) beschichteten Folien MALDI (Bruker Daltonics, Deutschland) </li><li> optimale Schnittleistung Temperatur Medium (Oktober) (Sakura Finetek Europa, Niederlande) </li><li> Vakuumexsikkator </li></ol> 1,2 Matrix-Anwendung <ol><li> Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH), Ethanol (EtOH) von pro-Analysen Sorte (Merck, Deutschland). </li><li> Trifluoressigsäure (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> Wasser wurde mit einem Milli-Q-Reinigungssystem (Millipore, Bedford, MA) gereinigt. </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japan) oder Portrait 630 Spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1,3 Massenspektrometrie <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging Software (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Peptid oder Protein Kalibrier-Standard (Bruker Daltonics) </li></ol> 1,4 Datenverarbeitung <ol><li> Origin V.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab Version 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1,5 Neuropeptid-Identifikation <ol><li> Ultraschall Ultraschallgerät </li><li> 10 kDa Molekulargewicht-Cut-Off-Filter (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25-Gel (Sigma, Deutschland) </li><li> Hypersil Spalte (ThermoFisher) </li><li> Pyridin, Ameisensäure (FA), Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH), Ethanol (EtOH) von pro-Analyse Grad (Merck, Deutschland). </li><li> Trifluoressigsäure (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). </li><li> Agilent 1100 LC Nanoflow, microWPS, C18-Säule (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip Zieltafel (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools Software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio Works-Software (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Mascot Software (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep Datenbank ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi-imaging-massenspektrometrie von neuropeptiden bei parkinsonpatienten

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie (IMS) ist eine leistungsfähige Methode, die die räumliche Analyse von Molekülen in biologischen Gewebeproben 2 (Abb. 1) erleichtert. Ein 12 um dünne Gewebeschnitt mit einer MALDI-Matrix die Desorption und Ionisation von intakten Peptiden und Proteinen, die mit einem Massenanalysator detektiert werden, kann typischerweise unter Verwendung eines MALDI-TOF / TOF-Massenspektrometer ermöglicht bedeckt. Im Allgemeinen Hunderte von Peaks in einem einzigen Rattenhirngewebe Abschnitt bewertet werden. Im Gegensatz zu den häufig verwendeten bildgebenden Verfahren geht diese Vorgehensweise nicht erforderlich, eine vorherige Kenntnis der interessierenden Moleküle und erlaubt für den unüberwachten und umfassende Analyse von mehreren molekularen Spezies unter Beibehaltung der hohen molekularen Spezifität und Sensitivität 2. Hier beschreiben wir ein MALDI IMS basierenden Ansatz für die Aufklärung Region-spezifische Verteilung Profile von Neuropeptiden im Gehirn der Ratte von einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit (PD). PD ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung mit einer Prävalenz von 1% für Personen über 65 Jahre alt 3,4. Die häufigste symptomatische Behandlung basiert auf Dopamin-Ersatz mit L-DOPA-5 basiert. Dies wird jedoch durch schwere Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnorme Bewegungen, genannt L-DOPA-induzierten Dyskinesien (LID) 1,3,6 begleitet. Einer der prominentesten molekulare Veränderung in LID ist ein Hochregulation der Opioid-Vorläufer Prodynorphin mRNA-7. Die Dynorphin Peptide modulieren Neurotransmission im Gehirn Bereiche, die im Wesentlichen in Bewegungssteuerung 7,8 beteiligt sind. Allerdings sind die genauen Opioid-Peptide, die aus der Verarbeitung von dem Neuropeptid Vorläufer stammen bisher nicht charakterisiert worden. Daher verwendeten wir MALDI IMS in einem Tiermodell experimenteller Parkinson-Krankheit und L-DOPA induzierter Dyskinesie. MALDI-Imaging-Massenspektrometrie erwiesen sich als besonders vorteilhaft im Hinblick auf Neuropeptid Charakterisierungtion, da häufig verwendete Antikörper Ansätze zielt bekannten Peptid-Sequenzen und zuvor beobachtet post-translationale Modifikationen. Im Gegensatz MALDI IMS kann entwirren neuartige Peptid-Processing-Produkten und damit zeigen neue molekulare Mechanismen der Neuropeptid Modulation der neuronalen Übertragung. Während die absolute Höhe der Neuropeptide können nicht durch MALDI IMS, bestimmt die relative Häufigkeit von Peptid-Ionen aus den Massenspektren abgegrenzt werden, geben Einblicke über das Ändern von Ebenen in Gesundheit und Krankheit. In den hier vorgestellten Beispielen wurden die Intensitäten von Dynorphin B, alpha-neoendorphin und Substanz P vor, signifikant in den dorsolateralen erhöht werden, aber nicht die dorsomedialen, Striatum von Tieren mit schwerer Dyskinesie mit Gesichts, des Rumpfes und orolingual Muskeln (Abb. 5). Darüber hinaus ergab MALDI IMS eine Korrelation zwischen Schweregrad und Dyskinesie Ebenen des-Tyrosin-alpha-neoendorphin, was einen bisher unbekannten Mechanismus der funktionellen Inaktivierungvation der Dynorphine im Striatum als die Entfernung von N-terminalen Tyrosin reduziert die Dynorphin der Opioid-Rezeptor-Bindung Kapazität 9. Dies ist die erste Studie über Neuropeptid Charakterisierung mittels MALDI LID in IMS und die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der Technik für die Anwendung in allen Bereichen der biomedizinischen Forschung.

Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie begleitet<sup&gt; 1</sup&gt;. Hier wird ein Protokoll für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie vorgestellt, erkennt Änderungen im Rattenhirn Neuropeptid Ebenen in Bezug auf Dyskinesie.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

Die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie (IMS) ist ein leistungsfähiger Ansatz, der die räumliche Analyse molekularer Spezies in biologischen Gewebeproben ermöglicht2 ...

Das Hauptziel dieses Verfahrens besteht darin, die räumliche Verteilung von Neuropeptiden, insbesondere von Opioidpeptiden, direkt in dünnen Gehirnschnitten mittels moldy-Bildgebungsmassenspektrometrie aufzuklären. Dies wird erreicht, indem zunächst 12 Mikrometer dünne Gewebeschnitte aus schockgefrorenem Rattenhirn gewonnen und anschließend auf leitfähige Glasscheiben aufgebracht werden. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe eines chemischen Tintenstrahldruckers moldy Matrixx in Form von Arrays über die Schnitte aufzutragen und danach ein Massenspektrum von jedem Matrixpunkt aufzuzeichnen.Anschließend werden mehrere Peptidspitzen visualisiert, um den Gesamterfolg des Experiments sicherzustellen. Danach folgen die Inspektion und Verarbeit游戏副本Letztendlich zeigen die Ergebnisse signifikante Unterschiede in den relativen Opioidpeptidkonzentrationen in verschiedenen Bereichen des Gehirns zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie radioimmunologischen SAO-Gel-basierten Ansätzen besteht darin, dass die Multibildgebung die Lokalisierung behandlungsbedingter Veränderungen ermöglicht, während gleichzeitig eine hohe molekulare Spezifität erhalten bleibt. Dies wiederum eröffnet uns die Möglichkeit, bisher nicht nachgewiesene Trunkierungen von posttranslationalen Modifikationen zu detektieren.Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, werden am Anfang Schwierigkeiten haben, da die Technik eine gründliche Probenvorbereitung und Datenauswertung erfordert. Im Mittelpunkt stehen hier die Qualität des Gewebes, der Matrix, des Applikationsprotokolls, die Datenauswertung sowie die anschließenden Validierungsexperimente. Es ist entscheidend, während der Gewebedissektion schnell und sorgfältig zu arbeiten, um proteolytischen Abbau zu vermeiden.Nachdem die Ratte gemäß den genehmigten Protokollen getötet wurde, entfernen Sie sofort das Gehirn, überführen Sie es in pulverisierte Trockeneis und lassen Sie das Gehirn relativ langsam einfrieren; lagern Sie das Gehirn anschließend im Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank. Ganze Gehirne können mehrere Jahre vor der Schnittführung gelagert werden, ohne dass die Qualität des MS-Signals beeinträchtigt wird. Wenn Sie bereit sind, mit dem Verfahren zu beginnen, befestigen Sie das Gehirn mithilfe von Tissue Tech und Einbettmedium am Halter; vermeiden Sie Kontaminationen des Gehirnbereichs, der geschnitten werden soll, da das Einbettmedium die Ionisierung und Desorption von Peptiden stören kann.Schneiden Sie gefrorenes Gewebe an einem Kryostatmikrotom auf 12&nbsp;Mikrometer dicke Schnitte und bringen Sie die Gewebeschnitte auf leitfähigen MALDI-Glasmikroskopen auf. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Färbung der Gewebeschnitte durchgeführt und die Gewebequalität überprüft werden. Diese Abbildung zeigt eine Cresylviolett-Färbung von im flüssigen Stickstoff schockgefrorenem Hirngewebe, wodurch das Gewebe Risse und Einrisse aufwies.Dieses Gewebe eignet sich nicht für die hochauflösende massenspektrometrische Abbildung mit Matrix, da die Matrix sich ausbreiten und nicht gleichmäßig kristallisieren würde. Trocknen Sie die Schnitte 15 Minuten lang unter Vakuum und lagern Sie die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius, bis sie weiterverwendet werden. Die Gewebeschnitte sollten möglichst zeitnah nach dem Schneiden analysiert werden, selbst wenn sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Erst entfrosten Sie die Schnitte eine Stunde lang in einem Exsikkator, anschließend waschen Sie die Objektträger mit den Schnitten bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang mit 70 %igem Ethanol, gefolgt von zwei Waschungen mit 95 %igem Ethanol bei Raumtemperatur, jeweils 10 Sekunden lang. Nach dem Waschen trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in einem Exsikkator.Untersuchen Sie die Schnitte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte von guter Qualität sind und keine Gewebeverformungen, Mikrorisse oder feinen Risse aufweisen, die die Qualität der Form-EMS beeinträchtigen könnten. Bereiten Sie anschließend eine frische Matrixlösung bestehend aus 50 Milligramm pro Milliliter DHB und 50 % Methanol, 10 % 150 Millimolar Ammoniumacetat sowie 0,3 % Trifluoressigsäure in Wasser vor. Scannen Sie den Objektträgerhalter mit dem Gewebeschnitt und richten Sie den Halter mithilfe der Bildanalysefunktion in der Chip-Software an den jeweiligen Referenzpunkten aus.Danach wählen Sie die geeigneten Matrixanwendungsparameter sowohl für die Hirnregion als auch für die Zielanalyten aus. Anschließend legen Sie die räumliche Auflösung fest. Tragen Sie nun die Matrix mithilfe des optimierten Protokolls auf dem chemischen Link Jett-Drucker auf.Scannen Sie die endgültigen, mit Matrix beschichteten Schnitte und speichern Sie das Bild vor der Mehrfachdatenerfassung. Dieses wird später verwendet, um die Matrixablagerungen mit den Motorkoordinaten der MALDI-Stage zu verknüpfen. Falls die mit Matrix beschichteten Schnitte nicht sofort verwendet werden, können sie unter Vakuum in einem Exsikkator aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden.Für die meisten Experimente werden mehrere Schnitte gleichzeitig analysiert, wie hier gezeigt. Jeder Objektträgerhalter fasst zwei Glasobjektträger, daher müssen mehrere Paare analysiert werden, um alle Halter abzudecken. Die Methoden und Parameter für die Form-TOF-Datenaufnahme sollten identisch sein; die Peptidmassenkalibrierung sollte jedoch für jeden Objektträger überprüft werden.Danach optimieren Sie die Erfassungsparameter an der Gewebeprobe, einschließlich der Laserfokussierung und Laserintensität. Geben Sie anschließend die Anzahl der Schüsse ein, die erforderlich sind, um ein optimales MS-Signal zu erzielen, ohne den Grundrauschenpegel anzuheben und die Peakauflösung zu verringern. Vermeiden Sie eine Sättigung des Detektors oder das Ablationen der Matrix aus benachbarten Matrixablagerungen, und wählen Sie die Laserbewegung aus.Schätzen Sie die maximale Anzahl von Aufnahmen pro Matrixpunkt ab, bis nur noch Rauschen detektiert wird. Es werden 600 Aufnahmen von jeder Matrixdeposition in Schritten von 25 Aufnahmen gesammelt, insgesamt 24 Schritte, unter Verwendung eines zufälligen Bewegungsmusters. Vergleichen Sie die Scans aller aufgetragenen Bereiche mittels der flex imaging-Software mit den Motor­koordinaten des MALDI-Targets.Danach mithilfe einer Software für die automatische Ausführung im Stapelmodus die Datenaufnahme im Batch-Modus durchführen. Mit Visualisierungstools wie Flex Imaging die Maori-IMS-Bilder visuell überprüfen, um die Verteilung der Peakintensitäten zu bewerten, und ermitteln, ob die Verteilungsmuster der Peakintensitäten mit Gewebemerkmale, der Qualität der Probenauftragung oder Normalisierungseffekten zusammenhängen. Dieses Beispiel zeigt die Verteilung von 10 verschiedenen Peptidpeaks in neun verschiedenen Tieren.Der für die Normalisierung verwendete Gesamteisenstrom oder TIC wird in Weiß dargestellt. Der TIC ist die Summe aller Intensitätswerte in einem Massenspektrum. Der TIC-Wert ist bei Tier drei sehr niedrig, und die Peptidbilder zeigen mehr Rauschen als spezifische Informationen.Das Gehirn des Tieres Nummer sechs zeigt einen Bereich am unteren Rand des Schnitts mit sehr hohen TIC-Werten. Dies spiegelt sich in diesem Bereich der Peptidbilder C und D als abnorm hohe Intensitäten wider. Dies ist ein potenzieller Übernormalisierungseffekt, der die Datenanalyse beeinflussen kann. Übernormalisierungseffekte können zu ungenauen Ergebnissen führen, wenn sie spezifisch nur in einer Behandlungsgruppe auftreten.In diesem Beispiel ist die Gesamtionenchromatogramm-Intensität (TIC) für Gruppe C deutlich höher, was die individuellen Peakintensitäten abnormal beeinflussen kann. Beispielsweise ist die durchschnittliche Peakintensität für Cytochrom C in den Rohdaten für Gruppe C höher als für Gruppe B, nach der Normalisierung ist die Peakintensität jedoch nun niedriger. Für Gruppe C kann dies zu schwerwiegenden Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen.Es ist wichtig, vor dem Fortfahren mit umfangreichen Datenvalidierungen immer den durchschnittlichen TIC für jede Behandlungsgruppe zu berechnen. Als Nächstes ist zu beachten, dass die Boten-RNA von Pro Dinorphin in das 14 Kilodalton schwere Pro Dinorphin-Propeptid übersetzt wird. In striären Neuronen wird Pro Dinorphin in Vesikel verpackt, die entlang der Dendriten transportiert werden, um entweder andere striäre Neuronen anzusteuern, oder entlang der Axone zur Substantia nigra, mehrere Millimeter vom Zellkörper entfernt.Die Vesikel enthalten Enzyme, die das Propeptid weiter zu Dinorphin-Peptiden verarbeiten, wie beispielsweise Alpha-Neo-Endorphin Dinorphin A oder Dinorphin B. Jedes dieser Peptide kann unterschiedliche Opioidrezeptoren aktivieren, nachdem es die Zielstruktur, die Substantia nigra, erreicht hat. Die Dinorphine werden anschließend durch Endo- und Exopeptidasen weiterverarbeitet und abgebaut. Einige dieser Peptide können nur mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden, da existierende Antikörper lediglich das C-terminale Ende der Peptide und nicht das N-terminale Ende erkennen. Die Y-G-G-F-L-Sequenz, die für die Aktivierung der Opioidrezeptoren verantwortlich ist, findet sich in den Dinorphin-bildenden Zellen, die im Areal A11 (AUM) lokalisiert sind und Projektionen zur Substantia nigra aufweisen.Daher wurden im folgenden Experiment sowohl die Streu-AUM als auch die Substantia nigra mit schimmeligem IMS analysiert, wobei die Spektren aus jedem interessierenden Bereich erfasst wurden. Die dorsonmediale und dorsolaterale striatale AUM sowie die mediale und laterale Nigra wurden in der Flex-Analyse-Software definiert und zur Datenanalyse exportiert. Zur Datenreduktion führen Sie die Peakdetektion mit den in verschiedenen Softwareprogrammen enthaltenen Peakfindungswerkzeugen durch.Beispielsweise die Peak-Analyse in Origin oder MS Peaks in Matlab verwenden. Die Peak-Liste aus allen Spektren als eine einzige tabulatorgetrennte Textdatei exportieren, die Start- und Endgrenzen der Peaks mithilfe einer Software wie dem Freeway P bin bestimmen, die Fläche unter der Kurve zwischen den Peak-Grenzen berechnen und diese für die statistische Analyse verwenden. Die MS-Reproduzierbarkeit zwischen Behandlungsgruppen kann durch Berechnung der durchschnittlichen MS-Spur und des Standardfehlers für jeden Massewert beurteilt werden.In diesem Beispiel werden die durchschnittlichen Spektren der intakten Kontrollnigra verwendet, um die Variabilität über den analysierten Massenbereich hinweg zu beurteilen. Eine gute Reproduzierbarkeit zeigt sich darin, dass die Peakintensitäten in beiden Kontrollgruppen gleich sind und die Standardabweichung gering ist. Dies gewährleistet eine valide statistische Analyse.Wenn die Datensätze ein hohes Maß an Variabilität aufweisen, ist es nahezu immer notwendig, das Maori-IMS-Experiment zu wiederholen und dabei die experimentellen Variationsquellen so weit wie möglich zu reduzieren. Typischerweise verarbeiten wir so viele Schnitte und Tiere wie möglich in einer einzigen Sitzung, manchmal mit mehreren Personen, die im Schichtbetrieb arbeiten. In einigen Fällen reicht dies jedoch immer noch nicht aus, und es können andere Strategien angewandt werden.Beispielsweise können, wenn einige Spektren nur Rauschen enthalten, diese durch Auftragen der Häufigkeitsverteilung des TIC identifiziert und mithilfe eines Cutoff-Schwellenwerts eliminiert werden, um suboptimale Daten auszuschließen. Eine andere Möglichkeit zur Datenauswertung besteht darin, alle Peaks zweier Tiere derselben Gruppe gegeneinander aufzutragen. Wenn die Peakintensitäten bei beiden Tieren gleich sind, zeigt das Intensitäts-Intensitäts-Diagramm eine gerade, schmale Linie.Wenn ein Tier spektrale Daten von geringer Qualität enthält, zeigt das Diagramm typischerweise asymmetrische Abweichungen von der Geraden, wie rechts zu sehen ist. Zur Identifizierung von Peptidsequenzen führen Sie eine Peptid-Dominic-Analyse an Rattenhirn-Extrakten mittels mehrdimensionaler Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt an Massenspektrometrie mit hoher Auflösung, durch. Kurz gesagt, werden Neuropeptide aus Rattenhirnschnitten extrahiert und mittels Kationenaustauschchromatographie vorfraktioniert.Die verschiedenen Fraktionen werden anschließend mithilfe der Nano-Fluss-umgekehrten-phase-HPLC weiter getrennt. Danach charakterisieren Sie die Neuropeptide mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines hybriden linearen Ionenfallen-Ria-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Instruments. Schließlich erfolgt die Peptidsequenzidentifizierung durch Datenbankabgleich. Für einige Neuropeptide sind spezifische Antikörper verfügbar, und Immunhistochemie-Experimente können sowohl die Peptididentifizierung als auch experimentelle Ergebnisse bestätigen. Die Auflösung ist höher als bei Maori-Bildgebungs-Massenspektrometrie, und zusätzliche Informationen können gewonnen werden.In diesem Beispiel sind Dior-Biene-immunreaktive Nervenfasern im Hippocampus, oberes linkes Feld, und im Substantia-nigra-Gebiet, unteres linkes Feld, zu sehen, während das Maori-IMS-Bild rechts unten die Lokalisation auf der Ebene verschiedener Hirnareale zeigt. Der endgültige Beweis dafür, dass ein Peak-Mass eindeutig einem spezifischen Peptid zugeordnet werden kann, besteht darin, modifizierte IMS an Peptid-Knockout-Tieren im Pronin-Knockout-Mausmodell durchzuführen. Mehrere, durch Pfeile markierte Peaks fehlen im Knockout, nicht jedoch in der Wildtyp-Kontrolle.Tiere Unbezogene Peptidspitzen wie Substanz P und P ink zeigen keinen Unterschied zwischen Knockout- und Kontrolltieren. Die Spitzenintensitäten von Dinorphin B und Alpha-neo-Endorphin sind in der Sechs-Hydroxydopamin-Läsion signifikant erhöht. Parkinsonisches Striatum stark dyskinetischer Tiere, wie durch die Pfeile angezeigt, im Vergleich zur Gruppe mit geringer Dyskinesie und Läsionskontrolle.Die statistische Analyse zeigte außerdem einen signifikanten Anstieg einer Peptidmasse, die einem abgekürzten alpha-Neo-Endorphin entspricht, bei dem die terminale Tyrosin-Gruppe entfernt wurde. Tatsächlich zeigt die visuelle Inspektion der Abbildungsergebnisse eine hohe Kolokalisation der übergeordneten Di-Norphin-Peptide, dargestellt in Grün, und der damit verbundenen DES-Tyrosin-Metabolite, dargestellt in Rot; Gelb kennzeichnet regionale Überschneidungen im Überlagerungspanel rechts. Das große Potenzial dieser Technik wird durch die Erkenntnisse zur selektiven Peptidverarbeitung in verschiedenen Hirnstrukturen unterstrichen, die mit anderen Methoden nicht nachweisbar sind.Hier zeigten sich spezifische Tyrosin-Metabolite von DES, die in Rot dargestellt sind, koinzident mit dem Vorläuferpeptid, das in Grün dargestellt ist, und wurden nur im Striatum, nicht jedoch im Substantia-nigra-Gebiet dyskinetischer Ratten beobachtet. Bei der Bildanalyse des Substantia-nigra-Gebiets zeigte sich, dass das Abbauprodukt Lu und Kelinarch, in Rot dargestellt, invers zu Dinorphin B, in Grün dargestellt, lokalisiert war. Dies weist darauf hin, dass während der Dyskinesie Dinorphin B lokal im lateralen Substantia nigra freigesetzt und anschließend zu Lu und Careful in AR One abgebaut wurde. Ein einzelnes Experiment unter Verwendung der Mold-Bildgebung kann innerhalb eines Tages oder bei zwei Tagen für die Probenvorbereitung und Datenerfassung durchgeführt werden.Darauf folgen dann ein oder zwei weitere Tage für die Datenauswertung. Je nach Probengröße erfordern die Validierungsexperimente, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden, weitere ein bis zwei Tage praktische Arbeit im Labor. Bei den folgenden Schritten ist besondere Sorgfalt erforderlich.Die Gewebedissektion und das Einfrieren müssen schnell durchgeführt werden, um einen Abbau von Pep zu vermeiden; die Wasch- und Matrixapplikationsprotokolle müssen für jedes Experiment optimiert werden. Die Datenauswertung und statistische Analyse müssen sorgfältig vorgenommen werden, um falsch positive Ergebnisse aufgrund übermäßiger Normalisierungseffekte oder schlechter Peak-Detektionen zu vermeiden.

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