MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

Das Hauptziel dieses Verfahrens ist es, die räumliche Verteilung von Neuropeptiden, insbesondere von Opioidpeptiden, direkt in dünnen Hirnschnitten mittels schimmeliger bildgebender Massenspektrometrie aufzuklären. Dazu werden zunächst 12 Mikrometer dünne Gewebeschnitte von schockgefrorenen Rattengehirnen entnommen und auf leitfähige Objektträger montiert. Der zweite Schritt besteht darin, schimmeliges Matrixx mit einem chemischen Tintenstrahldrucker in Arrays über die Schnitte aufzutragen und dann ein Massenspektrum von jedem Matrixpunkt zu erfassen.

Als nächstes werden mehrere Peptidpeaks visualisiert, um den Gesamterfolg des Experiments sicherzustellen. Es folgen die Inspektion und Verarbeitung der Massenspektren, der Export und die Nachbearbeitung der Peptiddaten sowie die statistische Auswertung. Der letzte Schritt besteht darin, die Peptiddaten zu analysieren und zu validieren, die durch die Massenspektrometrie mit schimmeliger Bildgebung gewonnen wurden.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse signifikante Unterschiede in den relativen Opioidpeptidspiegeln in verschiedenen Bereichen des Gehirns zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Radioimmuno-SAO-Gel-basierten Ansätzen besteht darin, dass die Multi-Bildgebung die Lokalisierung von behandlungsinduzierten Veränderungen bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen molekularen Spezifität ermöglicht. Dies wiederum gibt uns die Möglichkeit, wie zuvor nicht erkannte Kürzung von Änderungen nach der Übersetzung zu erkennen.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden am Anfang Schwierigkeiten haben, da die Technik eine gründliche Probenvorbereitung und Datenverarbeitung erfordert. Hier liegt der Fokus auf der Qualität des Gewebes, der Matrix, dem Applikationsprotokoll, der Datenauswertung und den anschließenden Validierungsexperimenten. Es ist wichtig, während der Gewebedissektion schnell und sorgfältig zu arbeiten, um einen proteolytischen Abbau zu vermeiden.

Nachdem Sie die Ratte nach genehmigten Protokollen geopfert haben, entfernen Sie sofort das Gehirn, übertragen Sie es in pulverisiertes Trockeneis und lassen Sie das Gehirn relativ langsam einfrieren, lagern Sie das Gehirn im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Ganze Gehirne können mehrere Jahre gelagert werden, bevor sie geschnitten werden, ohne dass die MS-Signalqualität verloren geht. Wenn Sie bereit sind, mit dem Eingriff zu beginnen, montieren Sie das Gehirn mit Tissue Tech Einbettungsmedien auf den Halter, um eine Kontamination des zu schneidenden Teils des Gehirns zu vermeiden, da das Einbettungsmedium die Ionisation und Desorption von Peptiden stört.

Schneiden Sie gefrorenes Gewebe auf einem Kryostat-Mikrotom auf 12-Mikrometer-Scheiben und montieren Sie Gewebeschnitte auf leitfähigen Maldi-Glasobjektträgern. An dieser Stelle kann die Färbung von Gewebeschnitten durchgeführt und die Qualität des Gewebes untersucht werden. Diese Abbildung zeigt eine krestale violette Färbung von Hirngewebe, das in flüssigem Stickstoff schockgefroren war und dazu führte, dass das Gewebe rissig und rissig wurde.

Dieses Gewebe wäre nicht für die hochauflösende moldige bildgebende Massenspektrometrie geeignet, da sich die Matrix ausbreitet und nicht gleichmäßig kristallisiert. Trocknen Sie die Schnitte 15 Minuten lang unter einem Vakuum und lagern Sie die Objektträger bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Der Gewebeschnitt sollte innerhalb kürzester Zeit nach dem Schnitt analysiert werden, auch wenn er bei minus 80 Grad Celsius gelagert wird. Tauen Sie zuerst die Abschnitte eine Stunde lang in einem Trockenmittel auf, waschen Sie dann die Objektträger mit den Abschnitten in 70 % Ethanol bei Raumtemperatur für 10 Sekunden, gefolgt von zwei Wäschen in 95 % Ethanol bei Raumtemperatur für jeweils 10 Sekunden. Trocknen Sie die Objektträger nach dem Waschen 10 Minuten lang in einem Trockenmittel.

Untersuchen Sie die Schnitte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte von guter Qualität sind, ohne Gewebeverzerrungen, Mikrorisse oder kleine Risse, die die EMS-Qualität der Form beeinträchtigen könnten. Bereiten Sie als nächstes eine frische Matrixlösung vor, die aus 50 Milligramm pro Milliliter, DHB und 50 % Methanol, 10 % 150 Millimolar Ammoniumacetat und 0,3 % Trifluoressigsäure in Wasser besteht. Scannen Sie den Objektträgerglas mit dem Gewebeschnitt und richten Sie den Halter mithilfe der Bildanalysefunktion in der Chip-Software auf die jeweiligen Referenzpunkte aus.

Wählen Sie dann die geeigneten Matrixanwendungsparameter sowohl für die Gehirnregion als auch für die Zielanalyten aus. Geben Sie als Nächstes die räumliche Auflösung an. Tragen Sie nun die Matrix mit dem optimierten Protokoll auf den Chemical Link Jett-Drucker auf.

Scannen Sie die endgültigen Matrix-Spot-Abschnitte und speichern Sie das Bild vor der Mehrfachdatenanforderung. Dies wird später verwendet, um die Matrixablagerungen mit den motorischen Koordinaten des Maldi-Stadiums zu vergleichen. Wenn sie nicht sofort verwendet werden, können die gefleckten Matrizenabschnitte bis zur Verwendung in einem Trockenmittel unter Vakuum gelagert werden.

Bei den meisten Experimenten werden mehrere Schnitte gleichzeitig analysiert, wie hier zu sehen. Jeder Objektträgerhalter passt auf zwei Objektträger, so dass für alle Halter mehrere Zweiersätze analysiert werden müssen. Die Methoden und Parameter der TOF-Erfassung der Form sollten gleich sein, jedoch sollten die Peptidmassenkalibrierungen für jeden Objektträger überprüft werden.

Optimieren Sie dann die Erfassungsparameter an der Gewebeprobe, einschließlich des Laserfokus und der Laserintensität. Geben Sie dann die Anzahl der Aufnahmen ein, die erforderlich sind, um ein optimales MS-Signal zu erzielen, ohne die Basislinie zu erhöhen und die Spitzenauflösung zu verringern. Sättigung des Detektors oder Abtragen der Matrix von benachbarten Matrixablagerungen und Auswahl der Laserbewegung.

Schätzen Sie die maximale Anzahl von Schüssen, die pro Matrixpunkt abgegeben werden können, bis hier das einzige Rauschen erkannt wird. 600 Schüsse werden von jeder Matrixablagerung in 25 Schussschritten für eine Gesamtanzahl von 24 Schritten unter Verwendung eines zufälligen Bewegungsmusters kumuliert. Vergleichen Sie die Scans aller gefleckten Abschnitte mit den Motorkoordinaten des MALDI-Tisches mit der Flex-Imaging-Software.

Führen Sie dann mit der Batch-Runner-Software für die automatische Ausführung die Datenerfassung im Batch-Modus durch. Verwenden Sie Datenvisualisierungstools wie Flex Imaging, um die Māori IMS-Bilder visuell zu inspizieren, um Peak-Intensitätsverteilungen zu bewerten und festzustellen, ob Peak-Intensitätsverteilungen mit Gewebemerkmalen, Fleckenqualität oder Normalisierungseffekten zusammenhängen. Dieses Beispiel zeigt die Verteilung von 10 verschiedenen Peptidpeaks in neun verschiedenen Tieren.

Der gesamte Eisenstrom oder TIC, der für die Normalisierung verwendet wird, wird weiß angezeigt. Der TIC ist die Summe aller Intensitätswerte in einem Massenspektrum. Der TIC-Wert ist bei Tier drei sehr niedrig, und die Peptidbilder zeigen mehr Rauschen als spezifische Informationen.

Das Gehirn von Tier Nummer sechs zeigt einen Bereich am unteren Rand des Abschnitts mit sehr hohen TIC-Werten. Dies spiegelt sich in ungewöhnlich hohen Intensitäten in dem Bereich der Peptidbilder, C und D, wider. Dies ist ein potenzieller Übernormalisierungseffekt, der die Datenanalyse beeinflussen kann. Übernormalisierungseffekte können zu ungenauen Ergebnissen führen, wenn sie nur in einer Behandlungsgruppe spezifisch vorhanden sind.

In diesem Beispiel ist der TIC für Gruppe C signifikant höher, was sich abnormal auf einzelne Spitzenintensitäten auswirken kann. Zum Beispiel ist die durchschnittliche Peakintensität für Cytochrom C für Gruppe C in den Rohdaten höher als für Gruppe B, aber nach der Normalisierung ist die Peakintensität jetzt niedriger. Für Gruppe C kann dies zu schwerwiegenden Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen.

Es ist wichtig, immer den durchschnittlichen TIC für jede Behandlungsgruppe zu berechnen, bevor mit einer umfassenden Datenvalidierung fortgefahren wird. Um die interessierende Region zu definieren, ist es wichtig zu erkennen, dass die Pro-Di-Norphin-Boten-RNA in das 14-Kilodalton-Propeptid pro Norphin übersetzt wird. In Streifen oder Neuronen ist der Prod Norphin in Vesikel verpackt, die durch Dendriten transportiert werden, um entweder andere Streifen oder Neuronen zu erreichen, und durch Axone zu den substanziellen Nigra, die mehrere Millimeter vom Zellkörper entfernt sind.

Die Vesikel enthalten Enzyme, die das Propeptid zu Di-Norphin-Peptiden weiterverarbeiten, wie z.B. Alpha-Neo-Endorphin Di-Norphin A oder DI-Norphin B. Jeder kann bei der Freisetzung der Zielstruktur, das substantielle Nigra, verschiedene Opiatrezeptoren aktivieren, die Dinorphine werden durch Endo- und Exo-Peptidase weiterverarbeitet und abgebaut. Einige dieser Peptide können nur durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, da vorhandene Antikörper nur auf das C-terminale Ende der Peptide und nicht auf das Endende abzielen. Die für die Aktivierung des Opioidrezeptors verantwortlichen Y-G-G-F-L-Sequenz befindet sich im streunenden AUM und projiziert auf das substantielle Nigra.

Daher wurden im folgenden Experiment sowohl das streunende AUM als auch das Subs nigra mit schimmeligem IMS analysiert, d. h. die Spektren aus jeder interessierenden Region. Das dorsonale mediale und dorsale laterale Stri aum sowie das mediale und laterale Nigra wurden in einer Flex-Analysesoftware definiert und zur Datenanalyse exportiert. Um die Daten zu reduzieren, führen Sie die Peak-Erkennung mit Peak-Finding-Tools durch, die in verschiedenen Softwares enthalten sind.

Verwenden Sie zum Beispiel die Peak-Analyse in origin oder MS Peaks in matlab. Exportieren Sie die Peakliste aus allen Spektren als eine einzige tabulatorgetrennte Textdatei, bestimmen Sie die Start- und Stoppgrenzen des Peaks Berechnen Sie mit Software wie dem Freeway P bin den Bereich unter der Kurve zwischen den Peakgrenzen und verwenden Sie diese für statistische Analysen. FRAU. Die Reproduzierbarkeit zwischen den Behandlungsgruppen kann durch die Berechnung der durchschnittlichen MS-Spur und des Standardfehlers für jeden Massenwert beurteilt werden.

In diesem Beispiel werden die durchschnittlichen Spektren für die intakte Kontrollnigra verwendet, um die Variabilität über den analysierten Massenbereich zu bewerten. Eine gute Reproduzierbarkeit ist daran zu erkennen, dass die Peakintensitäten in beiden Kontrollgruppen gleich sind und die Standardabweichung gering ist. Dies gewährleistet eine valide statistische Analyse.

Wenn die Datensätze einen hohen Grad an Variation aufweisen, ist es fast immer notwendig, das Maori-IMS-Experiment zu wiederholen, um die experimentellen Variationsquellen so weit wie möglich zu reduzieren. In der Regel bearbeiten wir so viele Schnitte und Tiere wie möglich in einer einzigen Sitzung, manchmal mit mehreren Personen, die in Schichten arbeiten. In einigen Fällen reicht dies jedoch immer noch nicht aus und es können andere Strategien angewendet werden.

Wenn beispielsweise einige Spektren aus Rauschen bestehen, können diese durch Plotten der Frequenzverteilung des TIC und einen Cutoff-Schwellenwert verwendet werden, um suboptimale Daten zu eliminieren. Eine andere Möglichkeit, Daten auszuwerten, besteht darin, alle Peaks für zwei Tiere innerhalb derselben Gruppe gegeneinander darzustellen. Wenn die Spitzenintensitäten bei beiden Tieren gleich sind, zeigt das Diagramm der Intensitätsintensität eine gerade schmale Linie an.

Wenn ein Tier Spektraldaten von geringer Qualität enthält, zeigt das Diagramm in der Regel asymmetrische Verschiebungen von der Geraden an, wie auf der rechten Seite zu sehen. Zur Identifizierung von Peptidsequenzen führen Sie eine Peptid-Dominic-Analyse an Gewebeextrakten des Rattenhirns mittels mehrdimensionaler Flüssigkeitschromatographie durch, die mit hochauflösender Massenspektrometrie gekoppelt ist. Kurz gesagt, werden Neuropeptide aus Hirnschnitten von Ratten extrahiert und mittels starker Kationenchromatographie vorfraktioniert.

Die verschiedenen Fraktionen werden dann mit Hilfe der Nanofluss-Umkehrphasen-HPLC weiter getrennt. Als nächstes charakterisieren Sie die Neuropeptide mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung einer hybriden linearen Ionenfalle, Ria-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanzinstrumente, führen schließlich die Identifizierung von Peptidsequenzen durch Datenbankabgleich durch, für einige Neuropeptide stehen spezifische Antikörper zur Verfügung, und immunhistochemische Experimente können die Peptididentifikation sowie experimentelle Ergebnisse validieren. Die Auflösung ist höher als bei der bildgebenden Massenspektrometrie der Maori und es können zusätzliche Informationen gewonnen werden.

In diesem Beispiel sind immunreaktive Nervenfasern der Dior-Biene im Hippocampus (oben links) und im unteren linken Bereich der Substanz zu sehen, während das Maori-IMS-Bild unten rechts die Lokalisation auf der Ebene verschiedener Gehirnbereiche zeigt. Der ultimative Beweis dafür, dass eine Peakmasse eindeutig einem bestimmten Peptid zugeordnet werden kann, ist die Durchführung von schimmeligem IMS an Peptid-Knockout-Tieren in der Pronin-Knockout-Maus. Mehrere Peaks, wie durch die Pfeile angedeutet, fehlen im Knockout, aber keine Wildtype-Kontrolle.

Tiere Nicht verwandte Peptidpeaks wie Substanz P und P-Tinte zeigen keinen Unterschied zwischen Knockouts und Kontrolltieren. Die Peakintensitäten von Dinorphin, B und Alpha-Neo-Endorphin sind in der Läsion mit sechs Hydroxydopamin signifikant erhöht. Parkinson-Stri-AUM von Tieren mit hoher Dyskinesie, wie durch die Pfeile angezeigt, im Vergleich zur Kontrollgruppe mit niedriger Dyskinese und Läsionen.

Die statistische Analyse ergab auch einen signifikanten Anstieg für eine Peptidmasse, die verkürztem Alpha-Neo-Endorphin entsprach, wobei das endterminale Tyrosin entfernt wurde. In der Tat zeigen die Bildergebnisse bei der visuellen Inspektion eine hohe Kolokalisation der in Grün dargestellten Di-Norphin-Peptide, und der verwandten DES-Tyrosin-Metaboliten, die in Rot und Gelb dargestellt sind, deutet auf eine regionale Überlappung im Overlay-Panel auf der rechten Seite hin. Das große Potenzial dieser Technik wird durch die Erkenntnisse zur selektiven Peptidprozessierung in verschiedenen Hirnstrukturen unterstrichen, die mit anderen Methoden nicht nachgewiesen werden können.

Hier waren spezifische DES-Tyrosin-Metaboliten, die in Rot dargestellt sind, mit dem grün gezeigten Elternpeptid co-lokalisiert und wurden nur im Striatum beobachtet, nicht aber in der substanziellen Nigra dyskinetischer Ratten. In der Sub-Nigra-Bildanalyse zeigte sich, dass das Abbauprodukt lu und der Kelinbogen, die in rot dargestellt sind, umgekehrt zu di Norphin B in grün lokalisiert waren, was darauf hindeutet, dass während der Dyskinesie das DI Norphin B lokal in den lateralen Subs, Nigra, freigesetzt und dann zu lu metabolisiert und in AR One vorsichtig aufgebaut wurde. Ein einzelnes Experiment mit Mold Imaging kann in ein oder zwei Tagen für die Probenvorbereitung und Datenerfassung durchgeführt werden.

Es folgten dann noch ein bis zwei Tage für die Datenauswertung. Je nach Stichprobengröße würden die Validierungsexperimente bei ordnungsgemäßer Durchführung weitere Tage oder zwei praktische Experimente im Labor erfordern. Es ist wichtig, bei den folgenden Schritten besondere Vorsicht walten zu lassen.

Das Diszieren und Einfrieren des Gewebes muss schnell durchgeführt werden, um eine Pep-Degradation zu vermeiden, das Wasch- und Matrixapplikationsprotokoll muss für jedes Experiment optimiert werden. Die Datenauswertung und die statistische Analyse müssen sorgfältig ausgewertet werden, um False Positives aufgrund von Übernormalisierungseffekten oder schlechten Peak-Detektionen zu vermeiden.