Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast
23. Januar 2012
Die Spalthefe, Schizosaccharomyces pombe Ist ein gutes Modellsystem zur grundlegenden zellulären Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Analyse der lebenden Zelle Spalthefe durchzuführen. In diesem speziellen Experiment, das wir über die Organisation des Genoms im Zellkern zu konzentrieren, aber die Methode kann auch verwendet werden, um cytosolische Faktoren zu studieren.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die subnukleäre Organisation in Hefezellen quantitativ zu messen und zu untersuchen, wie sie durch Veränderungen der Wachstumsbedingungen oder durch Mutationen beeinflusst wird. Dies wird erreicht, indem Hefezellen in der Log-Phase unter Bedingungen kultiviert werden, die die Autofluoreszenz minimieren. Anschließend werden die Zellen in eine Wachstumskammer gegeben, um sie unter dem Mikroskop zu beobachten.
Anschließend werden Bilder aufgenommen, um den Abstand zwischen verschiedenen fluoreszenzmarkierten Strukturen in der Zelle zu messen. Es werden Ergebnisse erhalten, die Unterschiede in der nicht-nukleären Organisation zeigen, die von der Änderung der Nährbedingungen während des Wachstums der Hefekultur abhängen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Epie-Bereich bezüglich des Zusammenspiels zwischen subarer Organisation oder Chromatin und der Genregulation zu beantworten.
Fisch- und Hefezellen beginnen damit, Edinburgh-Minimalmedium oder EMM sowie EMM mit zusätzlichem Ammoniumchlorid vorzubereiten, um die Autofluoreszenz zu verringern, anstatt es zu autoklavieren. Sterilisieren Sie die Glucoselösung mithilfe eines 0,2-Mikron-Filters und geben Sie sie dem autoklavierten Medium hinzu. Inokulieren Sie drei Milliliter EMM in 30-Milliliter-Röhrchen mit Fisch- und Hefezellen.
Frisch auf einer Agarplatte im reichhaltigen Medium YEA gezüchtet, die Röhrchen leicht verschließen und die Zellen in einem Schüttelinkubator bei 225 U/min und 30 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen zwei Tage lang in der logarithmischen Wachstumsphase halten, indem sie jeden Morgen und Abend mit einer Bürker-Kammer gezählt und auf die geeignete Dichte verdünnt werden. Am Tag des Experiments.
Die Zellen sollten sich in der frühen logarithmischen Phase befinden, um stickstoffarm zu sein. Beziehen Sie sich auf das in der schriftlichen Anleitung beschriebene Verfahren, um die Zellen durch Zentrifugation in einem Röhrchen zu einem Pellet am Boden eines 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchens bei maximal 1,5 RCF zu sammeln, indem das Röhrchen zunächst zwei Minuten lang zentrifugiert wird und anschließend um 180 Grad gedreht und weitere zwei Minuten zentrifugiert wird. Entfernen Sie die gesamte Überstände bis auf 10 bis 15 Mikroliter und resuspendieren Sie die Zellen in dem verbleibenden Medium mit einem Aliquot eines filtersterilisierten Lektins mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter.
Geben Sie fünf Mikroliter Lektinlösung in die Ecke des Deckglases und fügen Sie fünf Mikroliter Kultur dem Lektintropfen hinzu. Um eine Wachstumskammer für S pom base-Zellen herzustellen, pipettieren Sie fünf Mikroliter EMM auf einen sauberen Objektträger und setzen Sie das Deckglas mit der Kultur im 70-Grad-Winkel über das Medium umgekehrt auf das EMM, sodass es nach oben gerichtet auf das EMM fällt, um die Ränder mit Silikonfett abzudichten. Schneiden Sie das breite Ende einer 200-Mikroliter-Spitze ab und befestigen Sie das schmale Ende an einer Zwei-Milliliter-Spritze.
Füllen Sie die Spritze mit etwa einem Milliliter Silikonfett. Tragen Sie einen feinen Strich Silikon an den Rändern des Deckgläschens auf, indem Sie vorsichtig den Kolben der Spritze betätigen, um die Wachstumskammer abzubilden. Beginnen Sie mit der Hellfeldmikroskopie, um die Zellen zu lokalisieren und zu graben.
Erhalten Sie ein scharfes Bild für die konfokale Mikroskopie. Wir verwenden ein Zeiss LSM 700 Laser-Scanning-Mikroskop mit einem planapochromatischen 63-fach Ölimmersions-Objektiv und einer 16-fachen Liniendurchschnitts-Scan-Einstellung. Stellen Sie die Bereichseinheiten auf 1:1,1 ein, um eine optische Schichtdicke von 0,8 Mikrometern zu erhalten.
Scannen Sie die Zellen mit Lasern, die Alexa 488 und mCherry oder GFP detektieren. Zeichnen Sie genügend Bilder auf, um bei 60 Zellen pro Drain Messungen vornehmen zu können. Wechseln Sie zu einer neuen Wachstumskammer mit frischen Zellen.
Nach 60 Minuten der Bildgebung öffnen Sie ein Bild im Programm Zeen Light Edition, um den Abstand zwischen Signalen verschiedener Fluorophore in derselben Fokalebene zu messen. Öffnen Sie das Messwerkzeug und passen Sie die Lichtintensität und den Kontrast an, um die Mitte jedes fluoreszierenden Signals zu identifizieren, beispielsweise den Spindelpolkörper und die Kernmembran, und messen Sie den Abstand zwischen ihnen. Übertragen Sie die Daten auf ein Notizblatt.
Vergleichen Sie die mittleren oder medianen subzellulären Abstände zwischen verschiedenen Stämmen und Behandlungen mithilfe von statistischer Software oder Tests wie dem T-Test oder dem Mann-Whitney-Rangsummentest. In diesem Beispielstamm wurde PJ 1 18 5 in EMM kultiviert, und eine Probe wurde zur Bildgebung in eine Wachstumskammer gegeben. Anschließend wurde ein Aliquot von PJ 1 18 5 entnommen.
Die Kultur wurde in EMMN überführt und für 15 Minuten inkubiert, bevor eine Probe zur Bildgebung in eine Wachstumskammer gegeben wurde. Mit dem Messwerkzeug wurde der Abstand zwischen dem Locus und dem Spindelpolkörper sowie zwischen dem Locus und der Kernmembran gemessen. Wie hier gezeigt, bestand ein statistisch signifikanter Unterschied im Abstand des Genclusters, das sich von der Kernmembran in Richtung des Spindelpolkörpers bewegte, zwischen stickstoffverhungerten Zellen und Zellen, die in Stickstoff kultiviert wurden.
Die Daten zur Messung des Abstands zwischen GFP und SBP wiesen eine normale Verteilung auf, daher konnten die mittleren Abstände mit einem T-Test verglichen werden. Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Mittelwerten. Die Daten zur Messung des Abstands zwischen GFP und NM wiesen keine normale Verteilung auf, daher wurden die medianen Abstände mit einem Mann-Whitney-Rangsummentest verglichen.
Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Medianwerten nach Durchführung dieses Verfahrens. Andere Methoden, wie die Echtzeit-PCR, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen dazu zu beantworten, wie die Genexpressionsstufe mit den Veränderungen in der subnukleären Organisation korreliert.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur quantitativen Lebendzellanalyse der Spalthefe, Schizosaccharomyces pombe, vor, die auf die Organisation des Genoms im Zellkern fokussiert. Die Methode ermöglicht es Forschenden, zu untersuchen, wie die subnukleäre Organisation durch Wachstumsbedingungen und Mutationen beeinflusst wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Genetik
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Schizosaccharomyces pombe dient als Modellorganismus zur Untersuchung zellulärer Prozesse.
- Das Verständnis der Genomorganisation ist entscheidend für Erkenntnisse zur Genregulation.
- Lebendzell-Bildgebungstechniken können dynamische zelluläre Strukturen sichtbar machen.
- Änderungen der Wachstumsbedingungen können die zelluläre Organisation beeinflussen.
Zweck der Studie
- Die quantitative Messung der subnukleären Organisation in Hefezellen.
- Die Beurteilung des Einflusses ernährungsbedingter Faktoren und Mutationen auf die Genomorganisation.
- Die Bereitstellung einer Methode zur Untersuchung der Chromatindynamik und Genregulation.
Verwendete Methoden
- Hefe-Zellen werden in einem Minimalmedium bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert.
- Die Zellen werden zur Bildgebung mittels einer Wachstumskammer und konfokaler Mikroskopie vorbereitet.
- Fluoreszenzmarkierte Strukturen werden abgebildet, um die Abstände zwischen ihnen zu messen.
- Es wird eine statistische Analyse durchgeführt, um die Abstände unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
Hauptergebnisse
- Unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen wurden signifikante Unterschiede in der subnukleären Organisation beobachtet.
- Abstandsmessungen zwischen fluoreszierenden Signalen zeigten Veränderungen in der Chromatinpositionierung an.
- Statistische Tests bestätigten die Signifikanz der beobachteten Unterschiede.
- Die Methode liefert Einblicke in den Zusammenhang zwischen subnukleärer Organisation und Genexpression.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode eignet sich zur Untersuchung der Genomorganisation in der Spalthefe.
- Die Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss umweltbedingter Faktoren auf die Chromatindynamik.
- Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Mechanismen der Genregulation weiter zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen der Spalthefe ermöglicht präzise Messungen der subnukleären Organisation und ihrer dynamischen Reaktion auf Umweltveränderungen. Diese Fähigkeit ist entscheidend, um frühe Entdeckungshypothesen bezüglich der Chromatinarchitektur und Genregulation abzusichern. Die Methode unterstützt eine vorhersagende Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung und leitet Portfolioentscheidungen an der Schnittstelle von Zellbiologie und funktioneller Genomik.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Chromatinorganisation und deren Einfluss auf die Genregulation unter definierten Bedingungen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung räumlicher Genomdynamiken als Reaktion auf Störungen.
- Bietet eine mechanistische Ent风险bewertung für Hypothesen, die die nukleäre Architektur mit Veränderungen der Genexpression verbinden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Live-Cell-Bildgebungssysteme zur reproduzierbaren Messung subzellulärer Distanzen.
- Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch quantitative, statistisch auswertbare Ergebnisse.
- Ermöglicht das Screening von genetischen oder umweltbedingten Modifikatoren, die die Kernorganisation beeinflussen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Veränderungen der subnukleären Lokalisation mit Geninduktionsereignissen, die für Krankheitsmodelle relevant sind.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Chromatindynamiken mit funktionellen Endpunkten verknüpft werden.
- Ermöglicht eine prädiktive Entschärfung von Risiken bei der Entwicklung translationsbezogener Biomarker, wenn die Chromatinpositionierung eine Rolle spielt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese quantitative Bildgebungsmethode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Hypothesenprüfung bis hin zur Validierung präklinischer Modelle und unterstützt sowohl mechanistische Untersuchungen als auch translationsmedizinische Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen bezüglich der Beziehungen zwischen Chromatinorganisation und Genregulation.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Messgrößen zum Vergleich genetischer oder umweltbedingter Zustände.
- Analytik: Liefert statistisch fundierte Messwerte (Mittelwert, mediane Distanzen) für die Analyse über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Verknüpft Veränderungen der nuklearen Architektur mit der Geninduktion, die für die Krankheitsmodellierung relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Plattform für die Live-Cell-Abbildung und quantitative Analyse über mehrere Projekte hinweg bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und verringert mechanistische Unklarheiten in Studien zur Genregulation.
- Operativer Wert: Standardisiert Workflows für die Live-Cell-Bildgebung und gewährleistet die Reproduzierbarkeit quantitativer Ergebnisse.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch robuste Daten zu Chromatindynamik und Genexpressionszusammenhängen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Signalwegen basierend auf quantitativen Daten zur nuklearen Organisation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Live-Cell-Bildgebung, Fluoreszenzmikroskopie und quantitativer Bildanalyse.
- Setzt Zugang zu konfokaler Mikroskopie und kompatibler Analyse-Software für Abstandsmessungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei den Bildgebungsprotokollen und statistischen Analysemethoden.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Hefe-Stämme oder Modellsysteme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund notwendig.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Handhabung von Autofluoreszenz und die Sicherstellung einer ausreichenden Stichprobengröße für ausreichende statistische Aussagekraft.
