Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die subnukleäre Organisation in Hefezellen quantitativ zu messen und zu untersuchen, wie sie durch Veränderungen der Wachstumsbedingungen oder Mutationen beeinflusst wird. Dies wird erreicht, indem Hefezellen so gezüchtet werden, dass sie die Phase unter Bedingungen protokollieren, die die Autofluoreszenz minimieren. Anschließend werden die Zellen in eine Wachstumskammer gelegt, um sie unter dem Mikroskop zu betrachten.

Dann werden Bilder aufgenommen, um den Abstand zwischen verschiedenen fluoreszenzmarkierten Strukturen in der Zelle zu messen. Es werden Ergebnisse erzielt, die Unterschiede in der nichtnuklearen Organisation zeigen, die von der Veränderung der Ernährungsbedingungen während des Wachstums der Hefekultur abhängt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Epie-Bereich über das Zusammenspiel zwischen Subar-Organisation oder Chromatin und Genregulation zu beantworten.

Toul Fisch und Hefe beginnen mit der Zubereitung von Edinburgh Minimal Medium oder EMM und EMM mit Ammoniumchlorid, um die Autofluoreszenz zu reduzieren, anstatt zu autoklaven. Verwenden Sie einen 0,2-Mikron-Filter, um die Glukoselösung zu sterilisieren und in das Autoklavenmedium zu geben. Beimpfen Sie drei Milliliter EMM in 30-Milliliter-Röhrchen mit Fisch- und Hefezellen.

Frisch gezüchtet auf einer Agarplatte im reichhaltigen Medium, verschließt YEA die Röhrchen leicht und inkubiert die Zellen in einem Schüttler bei 225 U/min und 30 Grad Celsius. Halten Sie die Zellen zwei Tage lang in logarithmischen Phasen, indem Sie sie jeden Morgen und Abend mit einer Birka-Kammer zählen und auf die entsprechende Dichte verdünnen. Am Tag des Experiments.

Die Zellen sollten in einer frühen logarithmischen Phase für das Stickstoffpersonal sein. Die Zellen beziehen sich auf das in dem schriftlichen Protokoll beschriebene Verfahren, um die Zellen in einem Pellet am Boden einer Röhrchenzentrifuge zu sammeln, 1,5 Milliliter Zellen in einem Eend-Orph-Röhrchen bei einem Maximum von 1,5 RCF, indem das Röhrchen zuerst zwei Minuten lang gedreht und dann für eine weitere zweiminütige Drehung um 180 Grad gedreht wird. Bis auf 10 bis 15 Mikroliter des Überstands werden alle Zellen entfernt und die Zellen im verbleibenden Medium resuspendiert, wobei ein Aliquot von einem Milligramm pro Milliliter durch den Filter sterilisiertes Lektin erfolgt.

Geben Sie fünf Mikroliter Lektinlösung in die Ecke des Deckglases und geben Sie fünf Mikroliter Kultur in den Lektintropfen. Um eine Wachstumskammer aus S-Pom-Basiszellen zu schaffen, pipettieren Sie fünf Mikroliter EMM auf einen sauberen Objektträger und drehen Sie das Deckglas mit der Kultur in einem 70-Grad-Winkel über das Medium um und lassen Sie es von oben nach unten auf das EMM fallen, um die Ränder mit Silikonfett zu versiegeln. Schneiden Sie das breite Ende einer 200-Mikroliter-Spitze ab und befestigen Sie das schmale Ende an einer Zwei-Milliliter-Spritze.

Füllen Sie die Spritze mit etwa einem Milliliter Silikonfett. Tragen Sie eine feine Linie Silikon auf die Ränder des Deckglases auf, indem Sie den Kolben der Spritze leicht drücken, um die Wachstumskammer abzubilden. Beginnen Sie mit der Verwendung von Hellfeld-Bildgebung, um die Zellen zu lokalisieren und zu graben.

Verschaffen Sie sich ein scharfes Bild für die konfokale Mikroskopie. Wir verwenden ein Zeiss LSM 700 Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Plan-Apoch-Chromat-63-fach-Ölobjektive und einer durchschnittlichen Plane-Scan-Einstellung von 16 Zeilen. Stellen Sie die Flächeneinheiten auf eins bis 1,1 ein, um eine optische Schicht von 0,8 Mikrometern zu erhalten.

Scannen Sie die Zellen mit Lasern, die Alexa 4, 88 und mCherry oder GFP erkennen. Nehmen Sie genügend Bilder auf, um Messungen in 60 Zellen für jeden Abfluss durchzuführen. Wechseln Sie zu einer neuen Wachstumskammer mit frischen Zellen.

Öffnen Sie nach 60 Minuten Bildgebung ein Bild im Zeen Light Edition-Programm, um den Abstand zwischen den Signalen verschiedener Fluorophore in derselben Fokusebene zu messen. Öffnen Sie das Messwerkzeug und passen Sie die Lichtintensität und den Kontrast an, um das Zentrum jedes Fluoreszenzsignals zu identifizieren, z. B. den Spindelpolkörper und die Kernmembran, und messen Sie den Abstand zwischen ihnen. Übertragen Sie die Daten auf ein Notepad-Blatt.

Vergleichen Sie die mittleren oder mittleren subzellulären Abstände zwischen verschiedenen Stämmen und Behandlungen mit statistischer Software oder Tests wie dem T-Test oder dem Man Whitney Rank Summentest. In diesem Beispielstamm wurde PJ 1 18 5 in EMM gezüchtet und eine Probe zur Bildgebung in eine Wachstumskammer gegeben. Dann ein Aliquot von PJ 1 18 5.

Die Kultur wurde in EMMN überführt und 15 Minuten lang inkubiert, bevor eine Probe zur Bildgebung in eine Wachstumskammer gegeben wurde. Mit dem Messgerät wurde der Abstand zwischen dem Locus und dem Spindelpolkörper sowie zwischen dem Locus und der Kernmembran gemessen. Wie hier gezeigt, gab es einen statistisch signifikanten Unterschied in der Entfernung des Genclusters, der sich von der Kernmembran weg zum Spindelpolkörper bewegte, bei den stickstoffarmen Zellen im Vergleich zu Zellen, die in Stickstoff gezüchtet wurden.

Die Daten, die den Abstand zwischen dem GFP und dem SBP messen, hatten eine Normalverteilung, so dass die mittleren Entfernungen mit einem T-Test verglichen werden konnten. Es zeigte sich eine signifikante Differenz zwischen den beiden Mittelwerten. Die Daten, die den Abstand zwischen GFP und NM maßen, hatten keine Normalverteilung, und daher wurden die Medianabstände mit einem Man-Whitney-Ranglistensummentest verglichen.

Nach diesem Verfahren gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Medianwerten. Andere Methoden, wie z.B. die real-time PCR, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie das Genexpressionsniveau mit den Veränderungen in der subnukleären Organisation korreliert.