Name: Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie drei komplementäre Wachstums-Assays zur Beurteilung der Polyglutamin-Toxizität in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methoden ermöglichen quantitative Analysen von Proteinfehlfaltung und neurodegenerativen Mechanismen.

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Die Arbeit im Labor Duennwald wird durch Zuschüsse aus dem American Federation für Alternsforschung (Afar), der Erbkrankheit Stiftung (HDF) und der William Wood-Stiftung unterstützt.

1. Expression von toxischen PolyQ-Erweiterung Proteine ​​in Hefe Eine systematische Analyse der genauen Aminosäuresequenz eines Proteins Polyglutamindomänen-Erweiterung, die erforderlich ist, um Toxizität in Hefe 7 erzeugen hergestellt wird. Diese toxische Polyglutamindomänen-Expansion-Protein enthält eine Amino-terminalen FLAG-Tag durch 17 Aminosäuren von der ursprünglichen Sequenz des Huntingtin-Protein, einem Polyglutamindomänen Region und eine Carboxy-terminale Fusion mit einem fluoreszierenden Protein (GFP oder entweder GFP gefolgt, siehe Abbildung 1 a). Die Expression von Proteinen mit Polyglutamindomänen Erweiterungen von 46 Glutaminen oder mehr (z. B. 72 und 103 Glutaminen) erzeugt Toxizität in Hefe, wenn sie unter der Kontrolle des induzierbaren und relativ starke GAL1-Promotor 7, 9 ausgedrückt. Wie zuvor beschrieben, ist Polyglutamindomänen Toxizität in Hefe nur scheinbar in Zellen, die das Protein in seiner Durchführung Rnq1p Prion-Konformation, [RnQ +], zB die Hefe-Stamm W303 9. Die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein recapitulates zentrale Aspekte der Polyglutamindomänen-Biologie in Hefe, wie Polyglutamindomänen Länge-abhängige Toxizität (siehe unten) und Aggregation (Abbildung 1 b). Bemerkenswert ist, müssen toxische Proteine ​​Polyglutamindomänen-Erweiterung nicht töten Hefezellen sofort, sondern eher beeinträchtigen oder die Festnahme des Zellzyklus und der Zell-Devision, was zu einer Verlangsamung oder Hemmung des Wachstums von Hefe-Kolonien auf Platten oder flüssigen Kulturen (eigene unveröffentlichte Daten). 2. Potenzielle Probleme mit Hefezellen, Toxic PolyQ-Erweiterung Proteine Hefezellen, die sonst giftige Polyglutamindomänen Expansion Proteine ​​dürfen keine Fehler Wachstum 9. Die genetische Beschaffenheit dieser Suppressoren Polyglutamindomänen-Toxizität scheint nicht auf einfachen Mendelschen Mutationen beruhen und somit mit relativ hoher Frequenz (eigene unveröffentlichte Ergebnisse) auftreten. Wir spekulieren, dass diese spontanen Unterdrücker durch die Härtung von nicht identifizierten Prionen, die ähnlich wie in [RnQ +] bei der Bestimmung Polyglutamindomänen toxicity.Thes funktionieren verursacht werdene spontane Suppressoren Polyglutamindomänen Toxizität kann gefährden den erfolgreichen Ausgang eines Experiments, das zu charakterisieren Polyglutamindomänen Toxizität oder zur Identifizierung und Charakterisierung von Modifikatoren Polyglutamindomänen Toxizität zielt. Um das häufige Vorkommen dieser spontanen Unterdrücker zu vermeiden, befolgen Sie die unten aufgeführten Vorsichtsmaßnahmen, die sich als sehr wirksam sind: <ol><li> Verwenden Sie frische Hefe-Zellen für Experimente Toxizität. Lagern Hefe für längere Zeiträume. Häufig abrufen frische Hefe-Kolonien aus gefrorenen Beständen. </li><li> Häufig beobachten die Expression und Aggregation von toxischen Proteinen Polyglutamindomänen-Expansion durch Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Halten der Hefezellen in Medien, die die Expression des toxischen Polyglutamindomänen Toxizität zu allen Zeiten (dh in selektiven Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle) unterdrücken, bevor keine Toxizität Messungen. </li><li> Verwenden Sie mindestens drei unabhängigen Transformanten für jedes Polyglutamindomänen-Toxizität Experiment. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Wachstums-Assays <ol><li> Für jede experimentelle Bedingung, eine Kolonie beimpft jeweils aus drei unabhängigen Transformanten von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Expansion Proteins in 3 ml Hefe-selektive Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle. </li><li> Inkubieren Sie diese Kulturen über Nacht bei 30 ° C. Unter diesen Bedingungen werden die Zellen nicht exprimiert polyglutamine-Expansion Protein, da die Glucose im Medium verdrängt ihre Expression. Lassen Sie sich nicht diese Kulturen überwuchern, halten Sie die OD 600 (Absorption von Licht der Wellenlänge 600 nm) der Übernacht-Kulturen unter 1. </li><li> Wir verwenden routinemäßig drei verschiedenen Assays, um die Mängel Wachstum von Hefe-Zellen, die das toxische Protein Polyglutamindomänen-Erweiterung zu überwachen: </li></ol> 3,1 Wachstum auf Platten <ol><li> Verdünnen Sie die Nacht Hefekulturen (aufgewachsen mit 220 rpm geschüttelt) auf eine OD 600 von 0,0005 (dh eine 1:1000 Verdünnung eines OD600 = 0,5 Kultur) in selektiver michØ 7 mit Glucose. </li><li> Gleichmäßig verteilt 50 ul (was ca.. 700 Kolonien pro Platte) der verdünnten Kultur auf einer Platte (10 cm Durchmesser) mit selektiven Medium, das Glucose als einzige Kohlenstoffquelle und eine Platte mit selektiven Medium, das Galactose als einziger Kohlenstoffquelle. </li><li> Die Inkubation erfolgt während drei bis vier Tage bei 30 ° C Nach der Inkubation, um Aufnahmen von jeder Platte und die Anzahl der Kolonien auf dem Glucose und die Anzahl der Kolonien auf den Platten Galactose. Unter idealen Bedingungen, sollte es keine oder nur sehr wenige Kolonien auf der Platte sein Galactose bei der Verwendung von Hefe-Zellen, eine hochgiftige Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein (103q, Abbildung 2a). </li></ol> 3,2 Spotting-Assays Dieser Assay ist quantitativ als die Plattierung Assay oben beschrieben, und kann somit offenbaren auch feine Unterschiede in Polyglutamindomänen Toxizität mit dem gleichen Experiment auf der gleichen Platte. <ol><li> Verdünnen Sie die ÜNight Kulturen in Medium mit Glukose zu einer OD 600 von 0,1 gezüchtet. </li><li> Je 200 ul dieser verdünnten Kulturen in sterile 96-well Platten und bereiten fünf Fünffache serielle Verdünnungen in sterilem Wasser unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette. </li><li> Verwendung eines frogger, (auch als ein Spotter, mit 8 x 6 Pins für die Übertragung von Zellsuspensionen) übertragen Zellsuspensionen auf Platten, die selektive Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle und Platten, die selektive Medien mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle. </li><li> Die Platten vor Inkubation bei 30 ° C für drei bis vier Tage trocknen. </li><li> Nach der Inkubationszeit, machen Fotos von jeder Platte (Abb. 2b). </li></ol> 3.3. Die Überwachung Polyglutamindomänen Toxizität in Hefe durch das Wachstum der Flüssigkulturen Dieses Protokoll ist die quantitative (OD600-Nummern) der drei beschriebenen Tests hier und kann sogar erkennen, sehr feine Unterschiede in Polyglutamindomänen Toxizität. Die vorgenannten ocCurrence spontane Suppressoren kann jedoch potenziell irreführende Ergebnisse zur Folge. Ich empfehlen daher die Kombination dieser Assay mit mindestens einer der beiden oben beschriebenen Assays Plattieren. Wir schlagen vor, den BioscreenC Instrument für diese Experimente zu verwenden. Die BioscreenC ist ein Instrument, misst automatisch die optische Dichte von Hefezellen in 100-Well-Platten, während bei bestimmten Temperaturen mit definierten Bewegung inkubiert. Andere Verfahren zum Züchten von Hefezellen und Messung ihrer optischen Dichte kann ebenfalls Anwendung finden. <ol><li> Waschen der Hefezellen aus Minimalmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle dreimal in 3 ml sterilem Wasser. </li><li> Verdünnen Sie die Übernacht-Kulturen in Medium mit Galactose zu einer OD 600 von 0,1 gezüchtet. </li><li> Füllen Sie jede Position auf der 100-Well-Platte BioscreenC mit 300 ul der Hefekulturen. </li><li> Öffnen Sie das Programm einfach Bioscreen Experiment. Bestimmen Sie die Anzahl der Proben Sie überwachen möchten (einschließlich Leerzeichen und nur mittel-Kontrollen), die Temperatur auf 30 ° C, muss die Länge der Versuche zu 3 Tage, setzen Sie die Mess-Intervalle bis 15 Minuten, setzen Sie den Filter bis 600 nm / Brown, und stellen Sie den Modus Schütteln bis 15 Sekunden vor jeder Messung an mittlerer Stärke. </li><li> Die BioscreenC Instrument und der beigefügten Software produziert Excel-Tabellen von jedem Datenpunkt während des Experiments übernommen. </li><li> Bereiten Wachstumskurven mit Excel für jede Probe und vergleichen Wachstum von verschiedenen Proben (Abbildung 2c). Eine detaillierte Beschreibung der Analyse von Daten, BioscreenC Experimenten hergestellt wurde vor dem 10. vorgesehen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Hefe Polyglutamindomänen Modell. a) Schematische Darstellung des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion-Protein. b) Fluoreszenzmikroskopie zeigt Hefe-Zellen, die eine kurze, nicht-toxische PolyglutamindomänenExpansion Protein (25Q, linkes Bild) und Hefe-Zellen, die eine lange, giftige Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein (103q, rechtes Bild). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der Wachstums-Assays von Hefezellen, die Polyglutamindomänen-Expansion Proteine. a) Plating-Assay. Rund 700 Hefezellen wurden auf Platten verteilt und für drei Tage bei 30 ° C. Das obere Feld zeigt eine Platte mit Glucose-Medium, dh die Expression des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) nicht induziert. Das untere Feld zeigt eine Hefe Platte mit Galactose Medium, dh die Expression des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion Protein induziert wird. Beachten Sie, dass in dem Experiment hier dargestellt, traten keine spontane Suppressor. B) Spotting-Assay. Fünf serielle fünf Verdünnungen von Hefe-Zellen, die entweder ein nicht-toxisches Protein Polyglutamindomänen (25Q) oder eine toxische Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) wurden auf Glucose-Platten, die die Expression der Proteine ​​(linkes Feld) oder auf Galactose Platten, die ihre Expression zu induzieren unterdrücken entdeckt. Die Platten wurden dann für drei Tage bei 30 ° C inkubiert c) BioscreenC Experiment. Das Wachstum von Hefe-Zellen, die entweder ein nicht-toxisches Protein Polyglutamindomänen (25Q) oder eine toxische Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) durch die überwacht wurden, BioscreenC Instrument. Die experimentellen Bedingungen und die Analyse der BioscreenC Experimente sind in den Haupttext beschrieben.

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<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzende experimentelle Ansätze zu Polyglutamindomänen-Toxizität in der Modell-Organismus Hefe zu vermindertem Wachstum von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung der Basis von Proteinen zu messen. Work in Hefe hat tiefe Einblicke in die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Fehlfaltung und dessen entsprechend Toxizität, einschließlich der Fehlfaltung und Toxizität von Polyglutamindomänen-Erweiterung Proteine ​​9,11,12 angeboten. V...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Instruments </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 Pins) </td><td> V &amp; P Scientific, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves USA </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-Well-Wabenplatten </td><td> Growthcurves USA </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

wachstums-assays zur beurteilung polyglutamin toxizität in hefe

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Fehlfaltung mit vielen Krankheiten, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit 1 zugeordnet ist. Huntington-Krankheit (HD) durch die anormalen Entwicklung eines Polyglutamin (Polyglutamindomänen) Bereich innerhalb des Proteins Huntingtin verursacht. Die Polyglutamindomänen-expanded Huntingtin-Protein erreicht eine anomale Konformation (dh es misfolds) und verursacht zelluläre Toxizität 2. Mindestens acht weiteren neurodegenerativen Krankheiten werden durch Polyglutamindomänen-Erweiterungen, einschließlich der Spinozerebelläre Ataxien und Kennedy-Syndrom 3 verursacht. Der Modellorganismus Hefe hat wesentliche Einblicke in die zellulären und molekularen Grundlagen der Polyglutamindomänen-Toxizität erleichtert, einschließlich der Auswirkungen von intra-und inter-molekularen Faktoren der Polyglutamindomänen-Toxizität und die Identifizierung von zellulären Signalwegen, die in Zellen beeinträchtigt sind Ausdruck Polyglutamindomänen-Expansion Proteine ​​8.3. Wichtigly, wurden viele Aspekte der Polyglutamindomänen-Toxizität, die in der Hefe gefunden wurden, in anderen experimentellen Systemen und in gewissem Maße in Proben von HD-Patienten reproduziert und bewiesen damit, die Bedeutung des Hefe-Modell für die Entdeckung der grundlegenden Mechanismen zugrunde Polyglutamindomänen-Toxizität. Eine direkte und relativ einfachen Weg, um Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe zu bestimmen ist, um das Wachstum von Hefe-Defekte Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion zu messen. Dieses Manuskript beschreibt drei komplementäre experimentelle Ansätze zur Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe durch Messung bestimmen das Wachstum von Hefe-Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion. Die ersten zwei experimentelle Ansätze verfolgen das Wachstum der Hefe auf Tellern, überwacht der dritte Ansatz, das Wachstum von flüssigen Hefekulturen mit dem BioscreenC Instrument. Darüber hinaus beschreibt diese Handschrift experimentellen Schwierigkeiten, die auftreten beim Umgang mit Hefe Polyglutamindomänen Modelle können und skizziert Strategien, die helfen, oder zu vermeiden wirddiese Schwierigkeiten zu minimieren. Die Protokolle können die hier beschriebenen zu identifizieren und zu genetischen Wegen und kleinen Molekülen, die Polyglutamindomänen-Toxizität modulieren zu charakterisieren. Darüber hinaus können die beschriebenen Assays als Template für eine genaue Analyse der Toxizität von anderen Krankheit assoziierte fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe verursacht Modelle dienen.

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzenden Protokolle zur Beurteilung der Toxizität von Polyglutamin (Polyglutamindomänen)-Expansion Proteinen in der Hefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Diese Protokolle können einfach modifiziert, um die Toxizität von anderen fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe zu überwachen.

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Proteinfehlfaltungen stehen mit vielen menschlichen Erkrankungen in Zusammenhang, insbesondere mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, dem Parkinson-Syndrom ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefe als experimentelle Plattform zu nutzen, um die mit polyglutaminen Expansionen assoziierte Toxizität zu bewerten und zu analysieren. Expression der polyglutaminen Expansionsproteine nach Wachstum der Hefe unter Bedingungen, die die Expression von Polyglutamin unterdrücken. Drei komplementäre Wachstumsassays von Hefezellen, die ein toxisches polyglutamines Expansionsprotein exprimieren, werden durchgeführt, um die Toxizität im ersten dargestellten Wachstumsassay zuverlässig zu bewerten.Hier wird die Polyglutamin-Toxizität mittels eines Plattenassays überwacht. Als zweiter ergänzender Wachstumsassay kommt ein Spotting-Assay zum Einsatz, um auch feine Unterschiede im Zellwachstum nachweisen zu können. Der quantitativste Ansatz wird im dritten Assay gezeigt, bei dem Hefezellen in flüssigen Kulturen kultiviert werden und die Toxizität durch Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern verfolgt wird; auf diese Weise können letztlich reproduzierbare und quantitative Ergebnisse erzielt werden.Dieses Dokument beschreibt die Toxizität von Polyglutamin in Hefezellen durch sorgfältige Untersuchung ihres Wachstums auf Platten und in flüssigen Kulturen. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Entstehung von Proteinfehlfaltungserkrankungen beantworten, beispielsweise die genetischen und zellulären Grundlagen der Toxizität, die mit fehlgefalteten Proteinen – einschließlich Polyglutamin-Proteinen – assoziiert ist. Eine systematische Analyse hat die genaue Aminosäuresequenz eines Poly-Q-Expansionsproteins ermittelt, die notwendig ist, um Toxizität in Hefe hervorzurufen.Dieses toxische Poly-Q-Expansionsprotein enthält einen amino-terminalen Flag-Tag, gefolgt von 17 Aminosäuren aus der ursprünglichen Sequenz des Huntingtin-Proteins, einer Poly-Q-Region und einer carboxy-terminalen Fusion mit einem fluoreszierenden Protein. Hefe-Zellen, die die ansonsten toxischen Poly-Q-Expansionsproteine exprimieren, zeigen möglicherweise keinerlei Wachstumsdefekt aufgrund spontaner Suppressor von Poly-Q-Toxizität, was das erfolgreiche Ergebnis jedes Experiments, das darauf abzielt, die Poly-Q-Toxizität oder deren Modifikatoren zu charakterisieren, gefährden kann. Um das häufige Auftreten dieser spontanen Suppressor zu vermeiden, sollten vorbeugende Maßnahmen ergriffen werden, darunter die Verwendung frischer Hefe-Zellen für Toxizitätsexperimente. Vermeiden Sie es, Hefe über längere Zeiträume zu lagern, und entnehmen Sie regelmäßig frische Hefe-Kolonien aus gefrorenen Stämmen.Überwachen Sie regelmäßig die Expression und Aggregation toxischer Poly-Q-Expansionsproteine mittels Fluoreszenzmikroskopie. Halten Sie die Hefezellen stets in einem Medium, das die Expression der toxischen Proteine unterdrückt. Vor Beginn jeglicher Toxizitätsmessungen.Als letzte vorbeugende Maßnahme verwenden Sie mehrere unabhängige Transformanten für jedes Experiment. Zunächst werden in den Wachstumsassays, die in diesem Protokoll dargestellt werden, Hefezellen verwendet, die für die Expression der Poly-Q-Expansionsproteine kodieren, und zwar mit drei Millilitern selektivem Hefemedium mit Glukose. Inokulieren Sie drei Kulturen aus drei unabhängigen Transformanten, wobei Glukose als einzige Kohlenstoffquelle dient, und inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius.Unter diesen Bedingungen exprimieren die Zellen das Poly-Q-Expansionsprotein nicht, da es durch Glukose reprimiert wird. Vermeiden Sie ein Überwachsen der Übernachtkulturen, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern unter eins halten, um Defekte durch Wachstum auf Platten zu überwachen. Führen Sie zunächst eine 1:1000-Verdünnung einer Übernachthefe-Kultur mit einem OD 600 von 0,5 in selektivem Medium mit Glukose durch und geben Sie jeweils 50 Mikroliter jeder verdünnten Kultur gleichmäßig auf eine Platte mit selektivem Medium, das Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, um pro Platte etwa 700 Kolonien für jede verdünnte Kultur zu erhalten.Plattieren Sie zusätzlich auf einem selektiven Medium, das Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Inkubieren Sie die Platten nach der Inkubation drei bis vier Tage bei 30 Grad Celsius. Machen Sie Aufnahmen jeder Platte und zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf den Glucose- und Galactose-Platten.Unter idealen Bedingungen sollten keine oder nur sehr wenige Kolonien auf der Galactoseplatte auftreten, wenn Hefe-Zellen verwendet werden, die ein stark toxisches Poly-Q-Expansionsprotein exprimieren. Der Spotting-Assay ist quantitativer als der Platten-Assay und kann daher sogar subtile Unterschiede in der Poly-Q-Toxizität aufzeigen. Innerhalb desselben Experiments auf derselben Platte, um Spotting-Assays in Medium mit Glukose zu beginnen, verdünnen Sie die Übernachtkulturen, die auf einen OD 600 von 0,1 gewachsen sind, indem Sie jeweils 200 Mikroliter jeder verdünnten Kultur in sterile 96-Well-Platten pipettieren und mit einer Mehrkanalpipette unter Verwendung eines Froggers fünf fünffache serielle Verdünnungen in sterilem Wasser herstellen.Die Zellsuspensionen auf Platten mit selektivem Medium, das Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Zusätzlich die Zellen auf Platten mit selektivem Medium überführen, das Galaktose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, die Platten trocknen lassen und dann drei bis vier Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren, bevor von jeder Platte Fotografien angefertigt werden. Der flüssige Wachstumsassay ist der quantitativste der hier beschriebenen drei Assays zur Überwachung der Poly-Q-Toxizität in Hefe.Der Bio Screen C ist ein Gerät, das automatisch die optische Dichte von Hefekulturen in 100-Loch-Platten misst, während diese bei definierten Temperaturen mit definierter Agitation inkubiert werden. Andere Methoden zum Kultivieren von Hefezellen und zur Messung ihrer optischen Dichte können ebenfalls verwendet werden, um die Hefezellen, die über Nacht in Minimalmedium mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden, abzuzentrifugieren. Nach der Zentrifugation waschen Sie die Zellen mit drei Milliliter sterilen Wassers. Wiederholen Sie die Waschung zweimal, wobei die Zellen zwischen jeder Waschung durch Zentrifugation mit Medium mit Galactose sedimentiert werden. Verdünnen Sie die gewaschenen Zellen auf einen OD 600 von 0,1. Füllen Sie dann jedes der 100 Wells der BioScreen C-Platte mit 300 Mikrolitern der verdünnten Hefe-Kulturen und setzen Sie die Platte in das Gerät ein.Öffnen Sie das Experimentierprogramm easy bio screen. Bestimmen Sie die Anzahl der zu überwachenden Proben. Stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein.Stellen Sie die Dauer der Experimente auf drei Tage ein und legen Sie die Messintervalle auf 15 Minuten fest. Stellen Sie außerdem den Filter auf 600 Nanometer Braun ein und aktivieren Sie den Schüttelmodus mit 15 Sekunden vor jeder Messung bei mittlerer Intensität. Nach der Parametereinstellung beginnen Sie das Experiment.Der Bio-Scanner, siehe Instrument, und die beigefügte Software erzeugen Excel-Tabellen mit jedem während des Experiments aufgezeichneten Datenpunkt. Mit Excel können Wachstumskurven für jede Probe erstellt und das Wachstum verschiedener Proben verglichen werden. Hier gezeigt sind die Ergebnisse aus dem Ausstrich-Assay.Etwa 700 Hefe-Zellen wurden auf Platten ausgestrichen und für drei Tage bei 30 Grad Celsius auf der Platte mit Glucose-Medium inkubiert. Die Expression des toxischen poly Q-Expansionsproteins wird nicht induziert. Umgekehrt wird die Expression des toxischen poly Q-Expansionsproteins induziert, wenn die Hefe-Zellen auf Galactose-Medium ausgestrichen werden.Beachten Sie, dass im hier gezeigten Experiment keine spontane Suppression auftrat. Ebenso wird im Spotting-Assay die Expression des toxischen Poly-Q-Expansionsproteins auf Galactose, nicht jedoch auf Glucose beobachtet. Medium fünf, serielle Fünffachverdünnung von Hefezellen, die entweder ein nicht-toxisches Poly-Q-Protein oder ein toxisches Poly-Q-Expansionsprotein enthalten, wurden auf Glucose-Platten, die die Expression der Proteine unterdrücken, oder auf Galactose-Platten, die deren Expression im Bio-Screen-C-Experiment induzieren, aufgetragen.Das Wachstum von Hefezellkulturen, die entweder ein nicht-toxisches Poly-Q-Protein oder ein toxisches Poly-Q-Expansionsprotein exprimieren, wurde mit dem BioScreen C-Gerät wie in diesem Video beschrieben überwacht. Die Wirkung der Expression des toxischen Poly-Q-Expansionsproteins auf das Zellwachstum ist hier deutlich erkennbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Toxizität von Polyglutaminproteinen in Hefe überwacht. Der flüssige Wachstumsassay ist der quantitativste der drei Assays, da er sogar subtile Unterschiede in der Polyglutamin-Toxizität nachweisen kann.Bitte beachten Sie jedoch, es mit mindestens einem der beiden Überzugstests zu kombinieren, um Probleme mit spontanen Unterdrückungen der Polyglutamin-Toxizität zu vermeiden.

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Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm...

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zur Bewertung der neuroprotektiven Wirkung einer Testsubstanz, Astragalan, auf das neuronale Überleben bei Caenorhabditis elegans durch polyQ-vermittelte Neurotoxizität. Der Assay verwendet Caenorhabditis elegans, die die abnormal expandierten polyQ-Wiederholungen exprimieren, die mit GFP in ihren ASH-Neuronen fusioniert sind, um das neuronale Überleben nach der Behandlung mit der Testsubstanz zu messen.

Ein Assay zur Untersuchung der Wirkung der Testsubstanz gegen PolyQ-vermittelte Neurotoxizität bei Würmern

Hefeproteinopathie-Modelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Toxizität und Aggregation von Proteinen zu bewerten, die an Krankheiten beteiligt sind. In dieser Arbeit stellen wir Methoden zum Screening von Hsp104-Variantenbibliotheken auf Toxizitätssuppressoren vor. Dieses Protokoll könnte so angepasst werden, dass jede Proteinbibliothek auf Toxizitätssuppressoren von Proteinen untersucht wird, die in Hefe toxisch sind.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Dieser Artikel beschreibt Protokolle, um die Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf die Aggregation und Toxizität von fehlgefaltete Trinukleotiderkrankungen Erweiterung für die schnelle Bewertung eines neu Fußgelenkes fluoreszierenden Proteins im Rahmen des fluoreszierenden Reporter zu bewerten.

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der neuroprotektiven Aktivitäten von Testverbindungen in Caenorhabditis elegans vor, einschließlich Polyglutaminaggregation, neuronalem Tod und Chemovermeidungsverhalten, sowie eine beispielhafte Integration mehrerer Phänotypen.

Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Lernen Sie drei komplementäre Wachstums-Assays zur Beurteilung der Polyglutamin-Toxizität in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methoden ermöglichen quantitative Analysen von Proteinfehlfaltung und neurodegenerativen Mechanismen.

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

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