Propagierung und Erkennen einer ansteckenden Molecular Clone von Maedi-Visna Virus, das Green Fluorescent Protein exprimiert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen infektiösen Klon von Mildy vs. No Virus zu vermehren und nachzuweisen, der grün fluoreszierendes Protein exprimiert. Dieses grün fluoreszierende Protein wurde in das Hüllgen für D utp Ace im Myy Ner-Virusgenom eingeklont.

Der infektiöse Klon ist in zwei Plasmiden enthalten. Zunächst werden die beiden Plasmide, die die myy Ner-Sequenzen tragen, mit dem xpa1-Restriktionsenzym geschnitten und ligiert. Anschließend werden Schaf-Choroidplexuszellen mit dem Konstrukt transfiziert.

Schließlich werden myy-Vinovirus-infizierte Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen. Hallo, ich bin Stefano Neron am TER-Institut für experimentelle Pathologie der Universität Island. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vermehrung und Detektion eines infektiösen molekularen Klons des my vaskulären Virus, das das grün fluoreszierende Protein exprimiert.

Der molekulare Klon ist in den Plasmiden P acht XSP fünf EGFP und P sechs sieben oder mit 12 Kilobasen bzw. 4,5 Kilobasen enthalten. Schneiden Sie äquimolare Mengen der beiden Plasmide, nämlich 4,4 Mikrogramm von P acht XSP fünf EGFP und 1,6 Mikrogramm von P sechs sieben oder, mit XPA ein und ligieren Sie diese vor der Transfektion. Sobald die Ligierung abgeschlossen ist, inkubieren Sie das Ligationsgemisch zwei Tage vor der Transfektion 15 Minuten bei 65 Grad Celsius. Säen Sie 10 hoch sechs SCP-Zellen in einem T-25-Zellkulturgefäß und kultivieren Sie die Zellen zwei Tage lang in fünf Milliliter DMEM mit 10 % Lammserum und zwei Millimolar Glutamin ohne Antibiotika bis zu einer Konfluenz von 90 %.

Wenn die Zellen nach zwei Tagen noch nicht 90 % CO erreicht haben, lassen Sie die Zellen einen zusätzlichen Tag wachsen. Das Lammserum kann durch fetalen Kälberserum (FBS) ersetzt werden. Wir verwenden routinemäßig Lammserum, da einige Stämme von MVV durch FBS gehemmt werden.

Dieser MVV-Stamm wird jedoch nicht durch FBS gehemmt. Wenn die Zellen zur Transfektion bereit sind, wechseln Sie das Medium zu DMEM mit 1 % Lammserum oder FBS ohne Antibiotika. Wir verwenden Lipofectamine 2000 für die Transfektion, verdünnen die DNA in 500 µL Opti-MEM-Medium und verdünnen 20 µL Lipofectamine 2000 in 500 µL Opti-MEM-Medium und lassen dies fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Nach der fünfminütigen Inkubation das verdünnte DNA mit verdünntem Lipofectamin 2000 zu einem Gesamtvolumen von 1000 Mikrolitern kombinieren. Vorsichtig mischen und 22–30 Minuten inkubieren. Die Transfektionsmischung bei Raumtemperatur zu dem T-25-Fläschchen mit SCP-Zellen und Medium geben und durch vorsichtiges Schaukeln mischen.

Übernachtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am folgenden Tag das Medium wechseln zu DMEM mit 1 % Serum, zwei Millimolar Glutamin, 100 IE pro Milliliter Penicillin und 100 IE pro Milliliter Streptomycin. Die Produktion von GFP in den SCP-Zellen mittels invertierter Fluoreszenzmikroskopie überwachen.

Bei diesen primären Zellen ist eine geringe Transfektionsrate zu erwarten, üblicherweise fünf bis 15 %. Inkubieren Sie weitere Tage bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, um die Ausbreitung des Virus im Kolben zu ermöglichen. Für eine vollständige Infektion sind gewöhnlich sieben bis 14 Tage erforderlich. Gewinnen Sie das Virus durch Ali, indem Sie das Überstand in Einmaltuben abfüllen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 3000 × g, um Zelltrümmer zu entfernen. Überführen Sie das Überstand enthaltende Virus in neue Röhrchen.

Lagern Sie dreimal 10 hoch 4 SCP-Zellen bei minus 80 Grad Celsius in 100 Mikroliter DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % Serum, zwei Millimolar Glutamin, 100 IE pro Milliliter Penicillin und 100 IE pro Milliliter Streptomycin pro Mulde.

In einer 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Falls die Zellen am folgenden Tag konfluent sind, wechseln Sie das Medium auf DMEM mit 1 % Serum. Mit jeweils 100 Mikrolitern pro Well verdünnen Sie das Virus auf die folgende Weise.

Fügen Sie 180 Mikroliter DMEM mit 1 % Serum pro Vertiefung zu viermal 10 Vertiefungen in einer 96-Vertiefungs-Rundboden- oder V-Boden-Platte für eine serielle zehnfache Verdünnung im Vierfachduplikat hinzu. Geben Sie 20 Mikroliter Virus in jede der vier Vertiefungen der ersten Spalte der Platte. Und mischen Sie mithilfe einer Vierkanalpipette mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass die Proben gründlich vermischt sind.

Wechseln Sie die Pipettenspitzen und übertragen Sie 20 Mikroliter in die nächsten vier Vertiefungen und so weiter. Lassen Sie die letzten Vertiefungen ohne Virus für eine negative Kontrolle. Geben Sie 100 Mikroliter der Virusverdünnung zu den SEP-Zellen und dem Mediuminkubator hinzu.

37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Beobachten Sie zwei Wochen lang die GFP-Fluoreszenz und zytopathische Effekte. Zytopathische Effekte bestehen darin, dass die Zellen sich runden und weniger transparent werden als normale Zellen, wobei Fortsätze ausgebildet werden; am Ende erscheinen mehrkernige Zellen und es kommt zum Zelltod.

Berechnen Sie die Virus-Titer mithilfe der Reid-Münch-Methode zur schnellen Überwachung der Virusreplikation. Infizierte Zellen können mittels Durchflusszytometrie und Trypsin untersucht werden. Augen etwa 10 hoch fünf infizierte Zellen.

Einmal mit PBS waschen und in 500 Mikrolitern PBS resuspendieren. 500 Mikroliter einer 4 %igen Paraformaldehyd-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen, und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Zellen bei 3000 × g oder PMM fünf Minuten lang zentrifugieren.

Zweimal mit PBS waschen, jeweils fünf Minuten, und an einem Fact-Scan-Analysator analysieren. 10.000 Ereignisse zählen. Der hier vorgestellte molekulare Klon meines Virus mit GFP-Expression kann nützlich sein, um Virus-Wirt-Interaktionen und die Pathogenität meines Neurovirus sowohl in vivo als auch in vitro zu analysieren.

Obwohl noch nicht gezeigt wurde, dass mein Neurovirus menschliche Zellen beeinflussen kann, ist es wichtig, alle Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe einzuhalten; sowohl Zellen als auch das Plasmid können von unserem Labor bezogen werden. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.