Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Einblicke in die anatomische Organisation sowie in die Expressions- und Lokalisierungsmuster spezifischer Proteine in peripheren Nervenfasern zu erhalten, die Gewebe wie Haut und Knochen innervieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Ganztier-Perfusion mit Fixierungsmittel durchgeführt wird, gefolgt von der Dissektion oder Entfernung des interessierenden Gewebes. Anschließend werden die isolierten Gewebe nachfixiert und die Knochen entkalkt; mithilfe eines Kryostaten werden dünne Schnitte von Haut- und Knochengewebe angefertigt und auf Objektträger aufgebracht.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine ein- oder mehrfache Markierungs-Immunfärbung dieser Gewebeschnitte mit Antikörpern gegen Proteine durchzuführen, die spezifisch in peripheren Nervenfasern exprimiert und lokalisiert sind. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Verteilungsmuster bestimmter Typen peripherer Nervenfasern sowie den Expressions- und/oder Lokalisierungsmuster spezifischer Proteine in peripheren Nervenfasern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen, wobei entweder ein Epi-Fluoreszenz- oder ein konfokales Mikroskop verwendet wird. Mit diesem Ansatz können zentrale Fragen zum peripheren Nervensystem beantwortet werden, beispielsweise, wie die Innervationsmuster in Geweben wie Haut und Knochen aussehen.

Dieser Ansatz kann auch auf innere Organe und andere Gewebe ausgedehnt werden. Er kann uns zudem Aufschluss geben über Veränderungen in der Expression von Proteinen innerhalb dieser Untertypen sensorischer Nervenfasern sowie über mögliche Veränderungen in der Expression dieser Proteine während pathologischer oder entwicklungsbedingter Prozesse. Platziere ein Tier, das mit 4 % PFA perfundiert wurde, auf eine Schneidematte oder eine andere stabile Unterlage, um Gewebeproben aus der Hinterpfote zu entnehmen.

Halten Sie den Fuß mit der plantaren Fläche nach oben und drücken Sie fest mit einem dreimillimetergroßen Stanzbiopsiegerät, das in der Mitte des Fußes positioniert ist. Drehen Sie das Biopsiegerät um 180 Grad hin und her, um sicherzustellen, dass das gesamte Fußgewebe durchtrennt wurde. Entfernen Sie das Biopsiegerät vorsichtig vom Fuß und geben Sie das Gewebe in ein steriles 2-Milliliter-Gefäß, das ein Milliliter 4 %iger PFA- oder 5 %iger PA-Lösung enthält, um in diesem Fall Knochenproben aus dem Femur zu sammeln.

Führen Sie einen seitlichen Schnitt entlang des Rückens des Tieres auf Höhe des Beckens durch, der entlang beider Hintergliedmaßen nach unten verläuft. Schneiden Sie in das Becken und das umgebende Muskelgewebe, um den Femur vom Becken zu trennen, wobei der proximale Kopf des Femurs erhalten bleiben soll. Schneiden Sie anschließend in die Tibia oder Fibula, um den distalen Kopf intakt zu lassen, und entfernen Sie das umgebende Muskelgewebe und das Periost vom Knochenkörper.

Legen Sie den Femur in ein 2-mL-Gefäß, das 1 mL einer 4 %igen PFA- oder 5 %igen PA-Lösung enthält, und lassen Sie beide Proben anschließend 16 bis 18 Stunden bei 4 °C mit sanftem Mischen auf einem Rocker nachfixieren. Nach der Nachfixierung decalcifizieren Sie beide Proben, indem Sie sie in sterile 2-mL-Gefäße mit jeweils 1,5 mL Decalcifizierungslösung überführen. Lassen Sie die plantare Biopsie 16 bis 18 Stunden bei 4 °C mit sanftem Schütteln rocken, den Femur hingegen sechs bis sieben Tage lang.

Ändern Sie die Lösung alle 24 Stunden und überwachen Sie das Knochengewebe mit einer Pinzette auf Verlust der Steifigkeit nach der Entkalkung. Überführen Sie die Gewebeproben in ein steriles 2-Milliliter-Gefäß mit 1,5 Milliliter Kryoprotektionslösung und stellen Sie das Gefäß erneut auf den Schüttler, um eine sanfte Durchmischung über 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius durchzuführen. Um das Gewebe für das Schneiden vorzubereiten, geben Sie eine Trägermenge der optimalen Schneidetemperatur-Verbindung (OCT) auf einen Gewebemontageblock des Kryostaten und lassen Sie diese im Kryostatchamber bei minus 20 Grad Celsius gefrieren.

Sprühen Sie bei Bedarf OCT mit einem kryogenen Aerosol ein, um den Gefrierprozess zu beschleunigen. Positionieren Sie die Gewebeprobe auf der OCT-Basis für pflanzliche Stanzgewebe. Positionieren Sie die Proben so, dass für Knochengewebe gleichmäßige Querschnitte erhalten werden können.

Positionieren Sie die Probe so, dass Schnitte entlang der Längsachse des Knochens entstehen. Bedecken Sie beide Proben mit einer zusätzlichen dünnen Schicht OCT und besprühen Sie diese dann vorsichtig mit einem kryogenen Aerosol, bis das Gewebe gefroren ist.

Legen Sie die Probe auf den Schneidkopf in der Kryostatkammer und lassen Sie den Gewebeprobenblock mindestens eine Stunde lang auf die Schneidtemperatur einstellen, um spröde Schnitte zu vermeiden. Sobald das Gewebe die optimale Temperatur erreicht hat, beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe, um 40 µm dicke Schnitte für das plantare Gewebeprobenstück zu erzeugen. Sammeln Sie die Kryoschnitte in 12-Loch-Zellkulturplatten, die 0,1 M PB mit 10 mmol/L Natriumazid enthalten.

Stellen Sie sicher, dass die Schnitte untergetaucht bleiben, und lagern Sie sie bis zur Immunfärbung für Knochengewebe bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die Kryoschnitte direkt auf mit Gelatine vorbeschichteten Objektträgern und lassen Sie sie vor der Lagerung bei minus 20 Grad Celsius eine Stunde lang an der Luft trocknen. Knochenschnitte auf Objektträgern, die auf diese Weise gelagert werden, können innerhalb von zwei bis drei Monaten für Immunfärbungen verwendet werden.

Schneiden Sie mithilfe eines Rasierklinge sechs bis sieben Millimeter vom Ende einer Ein-Milliliter-Mikropipettenspitze ab. Konditionieren Sie das Innere der Spitze, indem Sie mehrmals 1 % fetalen Kälberserum in 0,1 molarer PB ansaugen, um zu verhindern, dass die Gewebeschnitte an den Wänden der Spitze haften. Überführen Sie acht bis zehn plantare Stanzpräparate in jedes Loch einer 24-Loch-Zellkulturplatte. Waschen Sie diese anschließend dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern 0,1 molarer PB pro Loch über jeweils fünf Minuten bei kräftigem Mischen auf einem Rüttler bei Raumtemperatur.

Anschließend die Schnitte eine Stunde bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren in Blockierungslösung inkubieren und danach mit der Inkubation von primären und sekundären Antikörpern fortfahren. Nach einem abschließenden Waschschritt in PB die Schnitte mit einer frischen, mit FBS behandelten, abgeschnittenen Mikropipettenspitze auf Objektträger übertragen. Die Schnitte mit einem Pinsel anordnen und überschüssige Feuchtigkeit abnehmen, wobei eine Belichtung durch Licht vermieden werden sollte.

Die Objektträger bei Raumtemperatur inkubieren, um die Schnitte fünf bis 30 Minuten lang zum Trocknen auf die Oberfläche aufzubringen. Nach dem Trocknen mehrere Tropfen Eindeckmedium auftragen und langsam eine Glasdeckfolie über die Schnitte legen.

Lassen Sie die Objektträger fünf Minuten im Dunkeln stehen und verschließen Sie dann die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack. Vor der Bildgebung, nachdem die Objektträger auf Raumtemperatur aufgetaut wurden, umranden Sie mit einem hydrophoben Barrierestift den Bereich auf dem Objektträger, der die Knochenproben enthält, und lassen Sie diesen 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen. Geben Sie mithilfe einer Pipette 250 µL 0,1 molarer PB in den markierten Bereich und waschen Sie die Knochenproben fünf Minuten lang.

Entfernen Sie das PB, indem Sie die Objektträger kippen, und wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Geben Sie anschließend 250 Mikroliter Blockierungslösung auf und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Nach der Blockierung fahren Sie mit der Inkubation der primären und sekundären Antikörper fort und achten dabei darauf, die Objektträger für nächtliche Inkubationen in einer befeuchteten Kammer aufzubewahren.

Schließlich waschen Sie mit 500 µL 0,05 molarem PB für 15 Minuten. Tauchen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur kurz in destilliertes, deionisiertes Wasser, um sie zu spülen, und lassen Sie die Knochenproben anschließend fünf bis 30 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen, wobei eine längere Belichtung mit Licht vermieden werden sollte. Geben Sie Eindeckmedium auf und legen Sie einen Glasdeckel auf die Schnitte, nachdem die Objektträger fünf Minuten im Dunkeln gestanden haben.

Versiegeln Sie die Ränder der Deckglasobjekte mit Nagellack unter Verwendung der epifluoreszenten Mikroskopie. Zahlreiche CGRP- und NF 200-positive Fasern sind hier als rote Bereiche sichtbar, die sich über die Basalmembranen an der epidermalen Dermalschnittstelle in der plantaren Region verteilen, die mit Anti-Kollagen vier in Grün angefärbt wurden; sowohl CGRP- als auch NF 200-positive Fasern in der plantaren Region sind ebenfalls mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar, erneut in Rot dargestellt, wie durch die Pfeilspitzen angezeigt. Während der pan-neuronale Marker Beta-3-Tubulin in der plantaren Region weit verbreitet exprimiert wird.

Die TRPV1-Färbung beschränkt sich hauptsächlich auf dünne Fasern, die ebenfalls CGRP-positiv sind; sowohl CGRP- als auch NF200-positive Fasern können im Knochengewebe der Extremitäten nachgewiesen werden, wie hier im Bereich des schwammigen Kopfes des Mausfemurs durch epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Aufnahmen dargestellt, wobei sie im Knochenmatrix rot dargestellt sind. TRPV1 ist ebenfalls im Extremitätenknochengewebe vorhanden, hier in rot mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt, und kolokalisiert mit anti-CGRP in grün.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einblicke in die anatomischen Merkmale der peripheren sensorischen Innervation in Geweben wie Haut und Knochen erhält sowie die Expression und Lokalisation verschiedener Proteine innerhalb dieser sensorischen Nervenfasern untersucht. Der gesamte Prozess von der Dissektion bis zur mikroskopischen Analyse sollte etwa vier Tage für Haut und 11 Tage für Knochengewebe in Anspruch nehmen.