Name: Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie schnelle Calciumsignale in lebenden Kardiomyozyten mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie isolieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener Calciumfluss-Zeitskalen.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt 2R01 GM53132 und P50 GM071558 unterstützt.

1. Loading-Zellen mit Calcium-Indikatoren <ol><li> Platte Zellen in 35mm Glasboden MatTek Gerichte (oder irgendeine andere Glasboden betrachten Kammern). </li><li> Bei der Verwendung von primären Myozyten Mantel der Kammern 1 Tag vor mit 10μg/ml Laminin. Platte Herzmuskelzellen (isoliert aus erwachsenen Hunden neugeborenen Ratten oder anderen Organismus) in KB-Puffer (K-Umkehr Tyrode Puffer 35 mmol / l HEPES, 140 mmol / l KCl, 8 mmol / l KHCO 3, 2 mmol / L MgCl 2 und 0,4 mmol / l KH 2 PO 4, pH 7,5) und ändern Sie es nach und nach M199-Medium mit 15% fötalem Rinderserum und 1% streptamycin und 0,5% Gentamicin und bei 37 ergänzt ° C in 5% CO 2. </li><li> Inkubieren Zellen mit Calcium-grünen AM (1-5 uM; Molecular Probes) oder beliebige Kalzium Indikator für 30-45 min bei Raumtemperatur. Bedecken Sie die Form mit Alufolie zu vermeiden Bleichen des Farbstoffs. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit Leibovitz15 Medium mit 14mm EGTA (wenn die Durchführung von Experimenten in niedrigen Kalzium) oder eine entsprechende Anzeige Medien. </li><li> Inkubieren für weitere 30-45 Minuten in Leibovitz15 Medium containing14mM EGTA. </li><li> Wenn der Test Auswirkungen von Inhibitoren (z. B. 10 um U73122 PLC-Inhibitor) fügen Sie diese in einem zweiten. </li></ol> 2. Mikroinjektion Zellen <ol><li> Kultur Kardiomyozyten in Glasboden MatTek Gerichte (oder eine andere Betrachtung Kammern) für 24 Stunden. </li><li> Ändern Sie die mittel-bis Phenol-free Leibovitz-15 mit 14 mM EGTA (Kardiomyozyten haben in Calcium-freiem Medium injiziert werden, können auch andere Zellen in Medium mit Kalzium gespritzt werden). </li><li> Bereiten Mikroinjektion Lösung - unsere Studien verwendeten ein Peptid, das Gα q eliminiert - Caveolae Wechselwirkungen. Beachten Sie, dass nur eine kleine Menge des Volumens in die Zelle (~ fL) injiziert wurden, und so angemessen konzentrierten Beständen verwendet werden muss. Wir haben 2 uM dieses Peptids, CAV3-Gerüst, mit DAPI in Calcium-freiem Medium. DAPI ist ein blue Farbstoff, der Flecken den Zellkern und ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die mikroinjiziert haben. DAPI nicht mit der Fluoreszenz von vielen Calcium-Indikatoren stören. Die Höhe des DAPI ist variabel und wir in der Regel genug zu verwenden, um den Kern zu visualisieren (0,5 und 2 M) </li><li> Bereiten Sie Control-Lösung mit DAPI - die Farbtracer allein. </li><li> Für microinjections umluftunabhängiges gezogen oder im Handel erhältlichen Nadeln. Üben Sie mit Farbstoff Injektion, um eine ordnungsgemäße Nadel Parameter zu bestimmen. Wir stellen fest, dass verschiedene Zellen können unterschiedliche Nadeldurchmesser und Mikroinjektion Drücke erfordern. </li><li> Verwenden Sie automatisierte Mikroinjektionssystems, zum Beispiel ein InjectMan NI2 mit einem FemtoJet Pumpe aus Eppendorf. Setzen Sie den Einspritzdruck P i bis 90 hPa, und die Kompensation Druck P c bis 45 hPa. Stellen Sie die Einspritzzeit t auf 0,7 s. Nachstellen Parameter der Injektion benötigen. </li><li> Führen microinjections auf einem inversen Mikroskop (zB Zeiss Axiovert 200M) mit großem Arbeitsabstand Phasenkontrast Ziel (z. B. Luft 40x Phase 2 Objektiv) ausgestattet. </li><li> Inject so viele Zellen wie möglich in eine schnelle Art und Weise. Untersuchen Sie injizierten Zellen mit der Phasenkontrast, um lebensfähige Zellen zu markieren. </li></ol> 3. Co-Immunfluoreszenz-Studien <ol><li> Wash Zellen zweimal mit PBS und fixieren mit 3,7% Paraformaldehyd für 30 Minuten. Falls erforderlich, können die Zellen vor der Fixierung stimuliert werden. </li><li> Wash fixierten Zellen dreimal mit PBS und Inkubation mit 0,2% NP40 in PBS für 5 Minuten. </li><li> Block mit PBS 4% Ziegenserum (oder andere geeignete Serum) für 1 Stunde. </li><li> Inkubieren Zellen mit primären Antikörper in entsprechender Verdünnung mit 1% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde. </li><li> Wash Zellen dreimal für 10 Minuten mit 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6, durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper, wie zB Alexa-Fluor-488-Anti-Kaninchen-oder Alexa-Fluor-647 anti-Maus-sekundären Antikörper verdünnt, gefolgt zu 1: 1000 1% Ziegenserum in PBS (beachten Sie, dass bei Sondierung für zwei verschiedene Proteine ​​der primäre Antikörper in verschiedenen Arten müssen erhöht werden und die sekundären muss gegen entsprechende Spezies). </li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde, dreimal mit TBS. </li><li> Anzeigen Zellen in TBS-Puffer oder ein anderes geeignetes Medium betrachten. </li></ol> 4. Schnelle Kalzium-Imaging <ol><li> Verwenden Sie Laser-Scanning-konfokalen Mikroskops (zum Beispiel FluoView 1000 Olympus). </li><li> Verwenden hoher numerischer Apertur Ziel. </li><li> Stellen Sie den Aufnahme-Parameter. Für Calcium grüne verwenden 488 nm Anregung und langen Pass 515 Sperrfilter. </li><li> Passen Sie die Pixel-Zeit - für schnelle Kalzium-Messungen stellen Sie es auf 2 us / Pixel. </li><li> Stellen Sie den Zoom auf Pixelgröße von 0,05 zu erreichen - 0,3 um. </li><li> Wählen Sie eine Linie aus einer Zelle der Wahl in einer bestimmten Region. </li><li> In der Zeit-Controller-Fenster wählen Sie Zeit Übernahme für mindestens 1500 Scans (die gewünschten Zeitrahmen zu bekommendie Antwort - 1,3 ms / Zeile ergäbe 2 Sekunden). </li><li> Rekord Hintergrund liest vor der Stimulation. </li><li> Stimulieren Sie Zellen mit 5 uM Carbachol und sofort mit der Aufnahme von Daten. Keep Zellen in 1 ml Leibovitz15 Medium, bereiten 10 uM Carbachol in Leibovitz15 und fügen vorsichtig 1 mL in die Schüssel </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Extrahieren Sie die Intensitäten für jedes Pixel aus aufgenommene Bild. Speichern Sie die Intensität Daten als eine Tabelle mit FluoView 1000 Software. </li><li> Import Intensität Daten in Sigmaplot oder ein ähnliches Datenanalyse-Programm und bin die Daten in ~ 9-40 Lagerplätze. Vergleichen Sie Experimente und elektronische Rauschen zu steuern. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir abgebildet Zellen auf Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop LSM510 (Zeiss, Jena, Deutschland) mit Multi-Line-Laser-Anregung und einem 40x/1.2 NA Apochromat Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet. In Abb.. 1 (rot) zeigen wir die Distribution der Caveolae in Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten, die behoben wurden und mit einem Antikörper gegen Caveolin-3, die die großen strukturellen Caveolae Protein in diesen Zellen 9 ist gefärbt. Caveolin-3 wurde mit Alexa-647 immunolabelled und aufgeregt mit dem 633-nm-Linie von einem Er: Ne-Laser. Bilder wurden mit LP650 nm-Emission-Filter. Die Verteilung von Caveolin-3 wurde Gα q, die mit Alexa-488 (grün) immunolabeled verglichen wurde. Alexa-488 wurde mit 488 nm Argon-Ionen-Laser-Linie begeistert und das Bild aufgenommen wurde mit BP505-530nm-Emission-Filter. In dieser Kolokalisation Messungen wurden die beiden Fluorophore in einer sequentiellen Weise mit Multi-Track-Übernahme aufgeregt. Diese Vorgehensweise minimiert Kanal cross-talk. Datenanalyse für Kolokalisation wurde mit AIM Software mit Zeiss LSM510-Meta zur Verfügung gestellt. Wie man sehen kann, sind die beiden Proteine ​​kolokalisiert. Um festzustellen, wie die Kopplung zwischen Caveolin-3 und Gα <sub q beeinflussen calcium-signale von uns durchgef kalzium-imaging-studien an einem konfokalen laser-scanning-mikroskop-system olympus tokyo japan gekoppelt mit inversen mikroskop numerische apertur obwohl diese messungen auch auf der zeis-systemen werden oben beschrieben. f wurden die zellen ca>2 + Grün geladen. Wir freuen uns den Farbstoff mit einem 488nm Argon-Ionen-Laser und sammelte Bilder durch eine LP515 Emissionsfilter. Bild Frames wurden bei 500 ms-Abständen entnommen. Intensity-Werte für jedes Pixel extrahiert wurden mit Olympus-Software und ImageJ. Das Line-Scan-Modus wurde für die quantitative Analyse von schnelleren Ca 2 +-Transienten und Ca 2 + Funken verwendet. Die Pixelgröße in der vorliegenden Studie verwendet wurde, 0,1-0,3 um. Das Line-Scan-Rate wurde um mehrere hundert us pro Zeile. In Abb.. 2 zeigen wir eine Linie Scan eines Ca 2 + Green-beladenen Kardiomyozyten, wo die Pixel dgut betrug 2 us, war die Online-Zeit 142 us. Das Bild ist von 1200 Linien zusammen. Jede Zeile des Scans entspricht der Intensität Fluktuation der Ca 2 + Grün, bestehend aus 71 Punkten über ein 142 us Sortiment genommen, und kann als schnelles Auslesen für Calcium Reaktionen verwendet werden. Zum Beispiel in Abb.. 3 zeigen wir die Ca 2 +-Aktivität aus einer einzigen Zeile eines einzelnen Kardiomyozyten, wie Ca 2 + gemessen Grüne Fluoreszenz-Intensität als Funktion der Zeit in Sekunden vor (oben) und nach (unten) der Zusatz von 5 uM Carbachol, die verbessert der Ebene der intrazellulären Ca 2 + durch Gα q-PLCβ Aktivität. Wenn viele Zeilen gemittelt werden, produziert Carbachol Stimulation eine ~ 1,8 fachen Anstieg der Ca 2 + Grün Intensität. Aufgrund von Schwankungen in der experimentellen Bedingungen (Raumtemperatur, Laserleistung, Detektor-Response-, Farbstoff-Distributionen, etc), kann dieser Anstieg nicht in einzelnen gesehen werdenLinien-Scans. Auch wenn die Intensität Werte (y-Achse Werte) ähnlich sind, ist es klar, dass die Carbachol-stimulierte Grundstück auf der Unterseite viel breiter Peaks, entsprechend länger anhaltende Kalziumspiegel, als die engen Schwankungsbreite Gipfel vor der Stimulation gesehen hat. Diese Verbreiterung und relativen Anstieg der Intensität verdeckt kleine, langsamere Schwingungen. Unser Ziel ist es besser, zwischen diesen verschiedenen Typen deutlich von Kalzium Schwankungen zu unterscheiden. Ein weiteres Beispiel für diese schnellen Calcium-Schwankungen ist in Abb. dargestellt. 4. Die obere Grafik zeigt raw line Daten zur stimulierten ventrikulären Kardiomyozyten (rot) und einem Durchschnitt von 3 line Spuren ist in schwarz dargestellt. Um zu bestimmen, soweit diese Kalzium-Schwankungen durch Gα q vermittelt wurden - caveoline3 Interaktionen, mikroinjiziert wir ein Peptid, das Caveolin-3 destabilisiert - Gα q Interaktionen (dh CAV3 Peptid), das mehr beseitigt Ca 2 + und diese Daten werden in blau dargestellt(Wir beachten Sie, dass wir 500 subtrahiert CAV3 Peptid Intensitäten, so dass die beiden Spuren besser erkennen können). Wir importierten die Spalten von Rohdaten aus unserer Excel-Dateien in Sigmaplot (Jandel, Inc.) und führte eine Histogramm-Analyse. In dieser Analyse wird die Anzahl der Ereignisse in eine gleiche Anzahl von Kisten (Bins), um ein Histogramm erzeugen gruppiert. Die Breite bin stellt eine gleiche Zeitspanne. Die Intensitäten sind in den verschiedenen Zeiten eingeführt bindet, so dass die Höhe eines bestimmten bin die Anzahl der Male, dass die Intensität tritt in der jeweiligen Zeitfenster darstellt. Da diese Art der Analyse hängt nur auf das Sammeln von Daten mit der gleichen Abtastrate, können viele Spuren gleichzeitig analysiert werden. Darüber hinaus ist diese Analyse nicht empfindlich auf Unterschiede in der Farbstoff-Ebenen, Laserleistung, etc., sowie die elektronische und Hintergrundgeräusche tritt an Zeitskalen sehr schnell und sind nur in den ersten 1-2 Behälter gesehen. Die entsprechenden histograms der Rohdaten in Abb.. 4 sind auf der unten auf der Seite angezeigt. Das Histogramm für die Kontroll-Zellen werden über eine große Anzahl von Behältern entsprechend einem breiten zeitlichen Verteilung, wie von der roten Linie (Linie ist für die Führung des Auges und kein Modell wird davon ausgegangen,) dargestellt zu verbreiten. Im Gegensatz dazu sind die Behälter für die Reaktion der Zellen, in denen die Gα q-CAV3 Interaktion von Peptid gestört wurde zu einem engen bin Verteilung darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von Peptid längere Flüsse beseitigt beschränkt. Mikroinjektion einer Kontrolle Peptid, das nicht stört Gα q-CAV3 erzeugt ein Histogramm ähnlich un-injizierten Zellen 8. In Abb.. 5 haben wir vergleichen die schnelle Intensitätsschwankungen Ca 2 + Grün bei erwachsenen Hunden ventrikuläre Kardiomyozyten (links) und frisch, unstimulierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten, dass Caveolae (rechts) fehlt. Hier wurden die entsprechenden Histogramme der Intensitäten über einen 3 Minuten Zeit binned bei 35 bis Ansicht langsamer Kalzium Veranstaltungen. Beachten Sie, dass die neonatale Kardiomyozyten schnelle Schwankungen Anzeige auf einem flachen Basislinie zeigt das Fehlen von langsameren Ca 2 +-Aktivität, während eine stärker strukturierte Basis für die erwachsenen Zellen zu sehen ist. Diese Unterschiede lassen sich am einfachsten in die Histogramme sehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Images of Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten zeigt die Verteilung der Gα q immunolabeled mit Alexa-488, wo Alexa-488 mit 488 nm Argon-Ionen-Laser-Linie und das Bild war aufgeregt wurde unter Anwendung BP505-530nm-Emission-Filter. Die oben rechts ist das gleiche Bild sehen die Lokalisation von Caveolin-3 mit Alexa-647 immunolabeled, mit der 633-nm-Linie von angeregten He: Ne-Laser und erfasst mit LP650 nm-Emission-Filter. Das fusionierte Bild, wo Kolokalisation in orange zu sehen ist, ist auf der Unterseite mit einem erweiterten Bild auf der rechten Seite. "Pdflinebreak"&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Calcium Imaging eines lebenden Hundes erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + Grün geladen. Das Bild wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop-System mit einem 40x-Objektiv mit einem 488 nm Argon-Ionen-Laser und einem LP515 Emissionsfilter genommen. Das Bild von 1200 Zeilen zusammengesetzt ist, wohnen die Pixel betrug 2 us, und die Pixelgröße betrug 0,1 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. TOP Intensitätsschwankungen eine Linie verfolgen von einem lebenden Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + Grün geladen und abgebildet, wie beschrieben, und BOTTOM derselben Zelle durch die Zugabe von 5 uM Carbachol stimuliert. / 3505fig4.jpg "/&gt; Abbildung 4. TOP Ein Beispiel für line Spuren von einem lebenden Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + geladen Green (rot) über 180 ms, wo der Mittelwert von 3 Spuren als schwarze Linie dargestellt ist, und im Vergleich zu einer Zelle, wurde mikroinjiziert genommen mit einem Peptid, das stört Gα q-Caveolin-3-Vereinigung (rot), wo durchschnittlich drei Spuren ist in schwarz. Wir nehmen zur Kenntnis, dass wir 400 Intensität zählt abgezogen von der unteren Reihe von Daten zur Ansicht. Die unteren Platten sind die entsprechenden Histogramme der klassierten Daten, wie im Text beschrieben, und wo die Zahl bin, ist willkürlich und die bin count (oder einfach count) entspricht dem Gesamtbetrag der Intensität in diesem speziellen bin. Wir stellen fest, dass die Linie roten und blauen Linien in der Kontrollgruppe (links) und Peptid (rechts) Histogramme erstellt, um eine leichtere Identifizierung und Vergleiche der Daten zu ermöglichen und kein Modell angenommen wird. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/&gt; Abbildung 5. Intensitätsschwankungen Ca 2 + Grün bei erwachsenen Hunden ventrikuläre Kardiomyozyten (links) und frisch, unstimulierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten, dass Caveolae (rechts) und ihre entsprechenden Histogramme fehlt, sind unten dargestellt.

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<li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li>
<li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li>
<li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Methode zum Anzeigen und isolieren schnellen Calcium-Signale in lebenden Herzmuskelzellen entwickelt. Während die experimentellen Bedingungen dieser Messungen zuvor auf andere Zellsysteme 10 sowie Kardiomyozyten 11 angewendet wurde, erlaubt die Verwendung von Histogrammen und bin Analyse von Daten aus vielen Ca 2 + Veranstaltungen erworben werden. Schneller Ereignisse können leicht aus langsameren und Modelle angepasst, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

mess-fast-flux calcium in kardiomyozyten

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Kardiomyozyten mehrere Ca 2 + Ströme von unterschiedlicher Dauer, die zusammenarbeiten, um Funktion 1,2 zu optimieren. Änderungen in Ca 2 +-Aktivität in Reaktion auf extrazelluläre Substanzen wird überwiegend durch die Phospholipase Cb-Gα q Weg auf der Plasmamembran, die durch Mittel wie Acetylcholin stimuliert 3,4 lokalisiert ist geregelt. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Plasmamembran Proteindomänen genannt Caveolae 5,6 Gα q 7 aktiviert einzufangen. Dieser Einschluss hat den Effekt der Stabilisierung des aktivierten Zustand des Gα q und was zu einer verlängerten Ca 2 +-Signale in Kardiomyozyten und anderen Zelltypen 8. Wir deckten dieses überraschende Ergebnis durch die Messung dynamischer Kalzium Antworten auf eine schnelle Skalierung in lebenden Herzmuskelzellen. Kurz gesagt, werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator geladen. In unseren Studien haben wir Ca 2 + Green (Invitrogen, Inc.), die eine Zunahme der Fluoreszenzemission Intensität der Bindung von Kalzium-Ionen aufweist. Die Intensität der Fluoreszenz wird dann für ein Line-Scan-Modus eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop aufgenommen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Erfassung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz-Intensität in Pixel entlang einer ausgewählten Linie, produziert mehrere hundert Mal Spuren auf die Mikrosekunde Zeitskala. Diese sehr schnell Spuren in Excel und dann in Sigmaplot zur Analyse übertragen werden, und sind die Spuren für die elektronische Rauschen, freien Farbstoff und andere Bedienelemente, verglichen. Um sezieren Ca 2 + Antworten von verschiedenen Flussraten führten wir eine Histogramm-Analyse, dass Pixelintensitäten mit der Zeit klassierte. Binning ermöglicht es uns, Gruppe über 500 Spuren überprüft und visualisieren die erarbeiteten Ergebnisse räumlich und zeitlich in einer einzigen Kurve. So kann die langsame Ca 2 + Wellen, die schwer zu erkennen sind, wenn die Scans überlagert werden durch unterschiedliche Peak Platzierung und Lärm, ohne darin zu sehen,die klassierten Histogramme. Sehr schnelle Flüsse in der Zeitskala der Messung zeigen eine enge Verteilung der Intensitäten in der sehr kurzen Zeitintervallen während mehr Ca 2 + Wellen zeigen klassierten Daten mit einer breiten Verteilung über längere Zeit zu lagern. Diese unterschiedlichen Zeit-Distributionen ermöglichen es uns, das Timing der Ca 2 + Ströme in den Zellen zu zerlegen und deren Auswirkungen auf die verschiedenen zellulären Geschehen bestimmen.

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Kardiomyozyten weisen multiple Ca2+-Flüsse unterschiedlicher Dauer auf, die zusammenwirken, um die Funktion zu optimieren 1,2. Änderungen der Ca2+-Aktivität als Reaktion auf ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, schnelle Kalziumsignale unterschiedlicher Dauer zu analysieren. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst auf einem Objektträger oder in einer Vertiefung kultiviert werden, die eine Zelladhäsion und Bildgebung ermöglichen. Anschließend werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator beladen.Anschließend werden die Zellen mikroinjiziert mit einem Wirkstoff oder einem anderen Protein von Interesse. Der letzte Schritt besteht darin, schnelle Fluoreszenzbildgebung an einem konfokalen Mikroskop durchzuführen. Letztendlich können die Kalziumantworten unterschiedlicher Zeitskalen ausgewertet werden.Mein Name ist ULA Ska. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von Dr. Scar. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Zellsignaltransduktion zu beantworten, beispielsweise wie ein bestimmter Wirkstoff Calcium-mobilisierende Signalwege in Zellen verändern kann.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapien von Herzrhythmusstörungen. Da angenommen wird, dass Herzrhythmusstörungen auf einer Störung der basalen Kalziumströme beruhen, beschichten Sie am Tag vor Beginn des Verfahre

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Forschung

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Biology

Biologie

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Die vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, funktionelle wirksame kardiotropen Autoantikörpern im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erfassen, unabhängig von dem spezifischen Antigen, durch Analyse der Auswirkung der isolierten Immunglobulin Patienten auf zelluläre Backfett und intrazellulärem Calcium in isolierter Transienten Rattenkardiomyozyten.

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dieses Video beschreibt einen auf konfokaler Mikroskopie basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in kultivierten Zellen. Der Assay verwendet den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhod-2/AM zur Messung des mitochondrialen Calciums in permeabilisierten kultivierten Zellen.

Calcium-Influx-Assay zur Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme in kultivierten Zellen

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Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.

Optische Hochdurchsatzkontrolle und Aufzeichnung des Kalziumsignals in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für Toxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening

Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um Kontraktilitäts- und Kalziummessungen in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung einer optischen Plattform durchzuführen. Diese Plattform ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen von Mutationen und die Reaktion auf verschiedene Reize schnell und reproduzierbar zu untersuchen.

Echtzeitmessungen von Kalzium- und Kontraktilitätsparametern in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Erfahren Sie, wie Sie schnelle Calciumsignale in lebenden Kardiomyozyten mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie isolieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener Calciumfluss-Zeitskalen.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

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