Name: Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zur Quantifizierung der Lipid-Raft-Partitionierung lebender Zellen. Diese Methode ermöglicht dynamische Beobachtung von Membranmikrodomänen und zellulärer Signalübertragung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) unterstützt. Wir sind auch dankbar, dass der Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) für ihre finanzielle Unterstützung.

1. Die Kalibrierung des FCS-Setup <ol><li> Starten Sie den konfokalen Mikroskop, Laser, Computer, Inkubator für Temperatur und CO 2-Steuerung. </li><li> Sicherstellen, dass die SPAD (Single Photon Avalanche Diode) ist und die Fluoreszenz-Filter innerhalb des SPAD ist gut, dass Ihre Probe geeignet. Prüfen, ob die SPAD in der Zeit synchronisiert wird. Vorsicht vor, um nur starten Sie Ihre FCS-Software, sobald Ihr SPAD Einstellungen bereit für den Erwerb sind. </li><li> Eine frische Lösung von Cholera-Toxin-Alexa488, verdünnt in PBS auf eine Konzentration von 1 pg / ml (17,5 nM) zu erreichen. </li><li> Optimieren konfokale Bildgebung der Lösung unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops. </li><li> Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Lösung Probe. Achten Sie darauf, die Dauer der Laser-Beleuchtung ist lang genug, um Ihre FCS Akquisitionen durchführen (&gt; 5 Minuten). </li><li> Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS-Software. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenz-Signal und stellen Sie sicher, es ist gut suiTed auf die SPAD (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen. </li><li> Erwerben Sie 10 Sets von 30 Sekunden-Messungen. Acquisition Zeit sollte für Ihre Probe optimiert werden (am besten Kompromiss zwischen der Probenahme und Ausbleichen Probleme). </li><li> Analysieren Sie Ihre Daten (siehe Schritt 4), um sicherzustellen, dass Sie eine Auto-Korrelation Kurve entsprechend einer fluoreszierenden Spezies diffundieren in Lösung (Gleichung in Abb. 2) haben und dass die Diffusion der Zeit nach der Montage erhalten korrekt ist (ca. 0,2 ms) (Abb. . 3). </li></ol> 2. Die Färbung von lebenden Zellen mit Lipid Rafts Marker <ol><li> Platte HEK293-Zellen auf 8-Well-Labteks mit Poly-L-Lysin (1mg/ml) am Tag zuvor Bildgebung, um sicherzustellen, dass ihre Haftung korrekt ist beschichtet. Verwendung Medium ohne Phenolrot, um sicherzustellen, dass keine Störung des Fluoreszenzsignals. </li><li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung). </li><li> In Choleratoxin-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 ul HBSS zu den Zellen für 30 Minuten bei 37 ° C Das Cholera-Toxin wird an Gangliosid GM1, bekannt, um vorzugsweise in Lipid Rafts partitioniert werden, zu binden. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung). </li></ol> 3. FCS Data Acquisition an lebenden Zellen <ol><li> Legen Sie die gefärbten Zellen auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, Temperatur und CO 2-Bedingungen sind optimal, da es sonst zu Artefakten in Diffusionszeiten führen. </li><li> Optimieren konfokale Bildgebung von einer Zelle von Interesse unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops (Abb. 4). </li><li> Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Plasmamembran der Zelle von Interesse. Führen Sie 1-2 Live-Bilder der Zelle, um sicherzustellen, dass die Zelle sich nicht bewegt, während der Akquisition. </li><li> Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS weichenware. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenzsignal und sicherzustellen, dass es gut ist mit dem SPAD geeignet (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen. Ist dies nicht genug ist, können Sie in Erwägung ziehen Färbungsbedingungen. </li><li> Erwerben 10 Proben von 30 Sekunden Messungen. Da die meisten Zellen autofluoreszierende sind, können Sie eine Abnahme der Fluoreszenz in den ersten Akquisitionen zu sehen, durch Auto-Fluoreszenz Fading. </li></ol> 4. FCS Data Analysis <ol><li> Stellen Sie die Korrelation Intervall und erzeugen Autokorrelation Kurven mit dem FCS-Software. Die Korrelation Intervall wird in der Regel von der kürzeste auflösbare Zeitverzögerung bis die längste Zeit möglich ist (wie die Statistik der Messung wird mehr und mehr unzureichend, wenn maximale Korrelation Zeit nähert gesamte Messzeit, die maximale Zeitverzögerung wird zu 80% der begrenzten Reichweite Erfassungszeit auf der PicoquaNT-Software). </li><li> Für jede Probe Exportieren von Dateien entsprechend Fluoreszenzfluktuationen und Auto-Korrelation als eine Funktion der Zeit. </li><li> Verwenden Sie eine Datenanalyse und Anpass-Software, wie zum Beispiel Origin Pro, um die Dateien zu importieren. </li><li> Für jede Probe stellen Sie sicher, es gibt keine Ausbleichen während der Akquisition, dh die Fluoreszenz bleibt während der 30 Sekunden stabil. Entsorgen Sie alle Maßnahmen, die Anzeige Photobleaching als diese künstliche Diffusion mal mehr verursachen können. </li><li> Prüfen Sie, ob die Form des verbleibenden FCS Kurven korrekt ist (siehe Abb. 5). Bestimmen Sie die mittlere FCS-Kurve. </li><li> Setzen Sie die Kurve mit den entsprechenden mathematischen Modells (Abb. 2). Diese Passform wird Ihnen die Diffusionszeit (n) und den Anteil der Moleküle diffundieren mit diesem (ESE) Diffusionszeit (n). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für ein FCS-Kalibrierung mit einem Cholera-Toxin-Alexa488-Lösung wird in 3 gezeigt (3A), individuellen und durchschnittlichen FCS Kurven wurden berechnet. Mittlere FCS-Kurven wurden mit Gleichungen, die den verschiedenen Diffusionsmodelle (Beispiele in 2) angebracht ist. Der Parameter klassisch als die Qualität der Passung zu bestimmen, ist der Koeffizient der Bestimmung R 2. Je näher R 2 Anspruch 1, desto besser ist die Anpassung. In diesem Fall ist die genaueste Modell, um die mittlere FCS Kurvenanpassung die eine Beschreibung einer Population von fluoreszierenden Moleküle diffundieren frei in drei Dimensionen (Gleichung 1 in 2 und 3B). Die Diffusionszeit von der Passung abgeleitet beträgt 0,32 ms. Rückstände aus Kurvenanpassung (3C) und R 2-Faktor (0,99906) eine Schätzung der Qualität der Anpassung. Ein Beispiel für FCS-Analyse für Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt HEK293 Zellen ist in 5 gezeigt. Die mehrphasige FCS mittlere Kurvenverlauf zeigt die Existenz von Populationen von fluoreszierenden Molekülen mit verschiedenen Diffusionszeiten. Die beste Anpassung für diese Kurve entspricht einem Modell mit drei Populationen von fluoreszierenden Sonden: zwei mit einem gehinderten Diffusion (Diffusion in zwei Dimensionen, wie in der Membran-Ebene) und ein frei diffundierenden in drei Dimensionen (Gleichung 2 in Abbildung 2 und Abbildung 5) . Diese letztere Bevölkerung entspricht fluoreszierende Moleküle sich außerhalb der Ebene der Membran, dh entweder Bindung oder Übermittlungsentgelt ihre Membrantargets, erreicht die Membran durch die Sekretion oder Recycling-Weg, oder aus der Membran durch Endozytose. Die beiden Diffusionszeiten an der Membran, entsprechend Choleratoxin gebunden an GM1, wurden 2 ms (25% der Moleküle), entsprechend der Diffusion außerhalb von Lipidflößen und 75 ms (50% der Moleküle), entsprechend der Diffusion in Lipidflößen . Bitte beachten Sie, dass jede PhotobleichmittelsIng. während der Akquisition wird die künstliche Diffusion mal länger damit möglicherweise die Schaffung eine Neigung zur Lokalisierung von GM1 in Lipid Rafts führen. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des FCS Set-up (Bild aus Marquer et al modifiziert. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiel der Diffusion Modellen und entsprechenden Gleichungen verwendet werden, um Autokorrelationskurven passen. Die Struktur des Parameters S als S = z 0 / w 0 mit z 0 der effektiven Brennweite Radius entlang der optischen Achse bei 1 / e 2-Intensität und w0 die effektive la geschrieben werdenTeral Fokusradius bei 1 / e 2-Intensität. Diese Werte können von einem klassischen Point Spread Function (PSF) Messung extrahiert werden. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Bewertung der Diffusionszeit von Cholera-Toxin-Alexa488 in Lösung für FCS-Kalibrierung. A) Fluoreszenz Schwankungen als Funktion der Zeit für ein repräsentatives Beispiel einer 30 Sekunden Aufnahmezeit. B) Die mittlere Kurve Autokorrelation aus 10 Proben von 30 Sekunden Erwerb Gleichung 1 eingesetzt (siehe Abbildung 2). C) Rückstände aus Kurvenanpassung erhalten. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. HEK-293 Zellen mit Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt. Die Zellen wurden auf einer SP5 konfokalen Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) mit dem internen 488nm Laser-Linie abgebildet. Fluoreszenz wurde mit einem x60 Plan Achromat Ölimmersionsobjektiv zwischen 500 gesammeltund 650 nm auf. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Bild 5. Bewertung der Diffusionszeit von Choleratoxin-Alexa488 an der Plasmamembran der HEK293-Zellen. A) Mittlere Autokorrelation Kurve mit der Gleichung 2 eingesetzt (siehe Abbildung 2). B) Residuen aus Kurvenanpassung. (Ab Marquer et al modifiziert. 12)

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalizing+membrane+rafts%3A+new+tools+and+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li>
<li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%2C+lipid+rafts%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li>
<li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+elusive+or+illusive%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li>
<li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+now+you+see+them%2C+now+you+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li>
<li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li>
<li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+lipid+rafts%3A+an+identity+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li>
<li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li>
<li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li>
<li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li>
<li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li>
<li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li>
<li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li>
<li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li>
<li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+correlation+spectroscopy%3A+measuring+number+densities%2C+aggregation+states%2C+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li>
<li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li>
<li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holin+triggering+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope%3A+exploiting+the+hidden+time+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der FCS hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sensitive und schnelle Analyse der Lipid Raft Partitionierung von fluoreszierenden Sonden von Interesse in lebenden Zellen. FCS kombiniert die Genauigkeit der Lokalisierung der konfokalen Mikroskopie mit der Empfindlichkeit des Einzelphotonenzählung. Der Hauptunterschied zwischen FCS und biochemischen Standardtechniken ist, dass die FCS absolute Bestimmung der Lipid-Rafts Partition des Ziels und nicht die relative Partition ermöglicht wie es der Fall für DRM-Systeme isol...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Das Cholera-Toxin Untereinheit B-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (Pentamer) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Konfokales Mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator für Temperatur und CO 2-Steuerung </td><td> Life Imaging Services </td><td> Der Cube und die Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM-Serie (100 um sensiblen Bereich) </td><td></td></tr><tr><td> High Pass Filter 488 nm </td><td> Semrock </td><td> 488 nm Sperrkante BrightLine Langpaßfilter Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS Detektionseinheit </td><td> PicoQuant </td><td> Picoharp 300-Baugruppe </td><td></td></tr><tr><td> Erwerb und Autokorrelation Software </td><td> PicoQuant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Anpass-Software </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der lipid raft partitionieren von fluoreszenz-markierten sonden in lebenden zellen mittels fluoreszenz-korrelations-spektroskopie (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In den letzten fünfzehn Jahren die Vorstellung, dass die Zellmembranen nicht homogen sind und sich auf Mikrodomänen, um ihre Funktionen ausüben, hat sich weitgehend akzeptiert. Lipid Rafts sind Mikrodomänen in Cholesterin und Sphingolipiden angereichert. Sie spielen eine Rolle bei der zellulären physiologischen Prozessen, wie Signal-, und Menschenhandel 1,2 sind aber auch gedacht, um wichtige Akteure in mehreren Krankheiten, darunter viralen oder bakteriellen Infektionen und neurodegenerativen Erkrankungen 3 sein. Doch ihre Existenz ist noch immer umstritten 4,5. In der Tat hat Lipidfloß Größe geschätzt auf rund 20 nm 6 sein, weit unter der Auflösungsgrenze des konventionellen Mikroskopie (ca. 200 nm) und somit kein Direct Imaging. Bis jetzt waren die wichtigsten Techniken verwendet, um die Partition von interessierenden Proteinen in Lipid Rafts beurteilen Waschmittel resistenten Membranen (DRM) Isolierung und Co-Patching mit Antikörpern. Obwohl weit verbreitet becaNutzung ihrer eher einfache Implementierung, waren diese Techniken anfällig für Artefakte und damit 7,8 kritisiert. Technische Verbesserungen seien daher notwendig, um diese Artefakte zu überwinden und in der Lage, Lipid Rafts-Partition in lebenden Zellen zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Methode für die empfindliche Analyse der Lipid Rafts Partition von fluoreszenz-markierte Proteine ​​oder Lipide in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Diese Methode, genannt Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), stützt sich auf die Unterschiede in der Diffusionszeit von fluoreszierenden Sonden innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. In der Tat, da in beiden künstlicher Membranen und Zellkulturen nachgewiesen, würde Sonden diffundieren viel schneller außen als von innen dichten Lipidflößen 9,10. Um die Diffusion Zeiten zu bestimmen, winzigen Fluoreszenzfluktuationen als Funktion der Zeit in einem Fokalvolumen (etwa 1 Femtoliter) gemessen wird, liegt an der Plasmamembran von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (Abb.1). Die Autokorrelation Kurven kann dann aus diesen Schwankungen gezogen werden und mit geeigneten mathematischen Modellen Diffusion 11. FCS kann die Lipidfloß Partitionierung der verschiedenen Sonden, solange sie fluoreszierend markiert sind zu bestimmen. Fluoreszenzmarkierung kann durch Expression von fluoreszierenden Fusionsproteine ​​oder durch Bindung von fluoreszierenden Liganden erreicht werden. Darüber hinaus kann nicht nur in FCS künstlicher Membranen und Zelllinien, sondern auch in primären Kulturen verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 12. Es kann auch verwendet werden, um die Dynamik des Lipidfloß Unterteilung nach Drogenabhängigkeit oder Membranlipid Änderung der Zusammensetzung 12 folgen werden.

Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In den letzten fünfzehn Jahren hat sich die Auffassung weitgehend etabliert, dass Zellmembranen nicht homogen sind und auf Mikrodomänen angewiesen sind, um ihre Funktionen auszuüben.

Lipidrafts sind Mikrodomänen in der Plasmamembran, die als Organisationszentren für zelluläre Prozesse wie Signaltransduktion und Transport dienen. Hier wird die Partitionierung von Lipidrafts in der Plasmamembran lebender Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie quantifiziert, um die Lipidraft-Partitionierung des Gangliosids GM1 zu untersuchen. Säugetierzellen werden mit Alexa 488-markierten B-Untereinheiten von Choleratoxin untersucht.Die fluoreszierenden Proteine binden an das Gangliosid GM1, das mithilfe der konfokalen Mikroskopie bevorzugt in Lipidrafts angereichert wird. An der Plasmamembran werden minimale Fluoreszenzschwankungen gemessen. Es werden Autokorrelationskurven erstellt und mit geeigneten mathematischen Diffusionsmodellen angepasst, um die Diffusionszeiten von Fluor zu bestimmen.Da sich Sonden außerhalb dichter Lipidrafts viel schneller diffundieren als innerhalb, zeigen die erhaltenen Ergebnisse das Ausmaß der Phasentrennung an. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Isolierung detergentresistenter Membranen oder der Co-Patching mit Antikörpern besteht darin, dass die FCS die Bestimmung des absoluten und nicht nur des relativen Lipidverteilungsmusters des Zielmoleküls ermöglicht. Außerdem kann sie sowohl für Lipide als auch für Proteine eingesetzt werden, solange diese fluoreszenzmarkiert sind.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Alzheimer-Krankheit zu beantworten, beispielsweise welche Bedeutung Lipide für die Produktion von Amyloid-Beta haben. Dies wird zu wichtigen Entdeckungen führen, wie beispielsweise neuen Hemmstoffen, die gezielt an Lipid-Graft-Bestandteile binden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Kalibrierung des Systems der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie oder FCS.Der hier beschriebene FCS-Aufbau besteht aus einem konfokalen Mikroskop, das mit einer externen Detektionseinheit verbunden ist, die einen Detektionsfilter und eine Avalanche-Photodiode sowie ein zeitkorreliertes Einzelphotonenzählsystem umfasst. Schalten Sie die Laser des konfokalen Mikroskops, den Computer für die konfokale Bildgebung und den Computer zur FCS-Datenaufnahme ein. Anschließend schalten Sie den Inkubator ein und stellen ihn auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein.Stellen Sie sicher, dass die Single-Photonen-Avalanche-Diode oder SPAD eingeschaltet ist und der Fluoreszenzfilter innerhalb der SPAD gut zum Probenmaterial passt. Überprüfen Sie, ob die SPAD zeitlich synchronisiert ist. Sobald die SPAD-Einstellungen für die Aufnahme bereit sind, starten Sie die FCS PICO quant-Software.Bereiten Sie eine frische Lösung von Cholera-Toxin-Alexa-488 vor, die in PBS auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter verdünnt ist. Pipettieren Sie die Lösung auf einen Deckgläser. Stellen Sie anschließend die Z-Einstellungen am Mikroskop so ein, dass die Ebene gefunden wird, in der die Fluoreszenz am intensivsten ist.Um in den Punkt-Scanning-Modus zu wechseln, klicken Sie auf die Schaltfläche „Bleach Point“ und anschließend auf den Bildschirm, um einen punktförmigen interessierenden Bereich in der Probenlösung auszuwählen. Stellen Sie mithilfe der Software die Belichtungszeit auf mehr als fünf Minuten ein. Dadurch wird sichergestellt, dass die Laserbeleuchtung ausreichend lang ist, um die FCS-Aufnahmen durchzuführen.Danach mit der FCS-Software auf die externe Detektion durch die SPAD umschalten. Sicherstellen, dass das fluoreszierende Signal im Bereich von 10.000 bis 50.000 Zählungen pro Sekunde liegt. Ziel ist es, ein gutes Signal zu erhalten, jedoch keine Sättigung.Erwerben Sie 10 Sätze von 32. Messungen am selben Feld. Die Aufnahmezeit sollte für die Probe optimiert werden, sodass eine hochwertige Abtastung ohne Photobleichen erzielt wird. Sobald die optimierten Probendaten erfasst wurden, werden damit Autokorrelationskurven generiert, aus denen die Diffusionszeiten der fluoreszierenden Spezies bestimmt werden. Zuerst.Stellen Sie mithilfe der FCS-Software das Korrelationsintervall ein und erzeugen Sie eine Autokorrelationskurve, die der in Lösung diffundierenden fluoreszierenden Spezies entspricht. Für jede 32. Messung analysiert die Software jede 32. Probe unabhängig und erzeugt Autokorrelationskurven aus den Fluoreszenzintensitäten unter Verwendung einer klassischen mathematischen Funktion, die die Ähnlichkeit zwischen Beobachtungen als Funktion des zeitlichen Abstands zwischen ihnen angibt. Das Korrelationsintervall reicht typischerweise von der kürzesten auflösbaren LAC-Zeit bis zur längsten möglichen Zeit.Wie hier zu sehen ist, wird die Messung ungenauer, je mehr die maximale Korrelationszeit der gesamten Aufnahmedauer naht. Dabei ist die maximale Verzögerungszeit auf 80 % der Aufnahmedauer begrenzt. Als Nächstes exportieren Sie für jede Probe die Dateien, die den Fluoreszenzfluktuationen und der Autokorrelation als Funktion der Zeit entsprechen. Anschließend importieren Sie die Dateien in eine Software zur Datenanalyse und Kurvenanpassung, beispielsweise Origin Pro, um zu überprüfen, ob während der Aufnahme eine Photobleicheffekte aufgetreten sind.Untersuchen Sie die Datei mit den Fluoreszenzfluktuationen. Die Fluoreszenz sollte während der 30 Sekunden stabil sein und als flache Linie dargestellt werden. Wenn die Fluoreszenzmessungen eine Photobleiche anzeigen.Verwenden Sie die entsprechenden FCS-Kurven nicht für weitere Analysen, da dies künstlich längere Diffusionszeiten bei den verbleibenden FCS-Kurven verursachen kann. Bestimmen Sie die mittlere FCS-Kurve durch Mittelung der Autokorrelationswerte für jeden Zeitpunkt. Um die Kurve schließlich mit dem geeigneten mathematischen Modell zu analysieren, verwenden Sie das Anpassungsmodul von Origin Pro mit der entsprechenden Gleichung.Diese Anpassung liefert die Diffusionszeit von Molekülen und Lösung. In diesem Fall liegt nur eine Population vor, die sich frei diffundierend bewegt. Wenn die erhaltene Diffusionszeit korrekt ist, beträgt sie ungefähr 0,2 Millisekunden.Die Einrichtung ist gut kalibriert und kann für weitere Experimente verwendet werden. Nachdem die Einrichtung auf Kalibrierung überprüft wurde, kann das System verwendet werden, um die Verteilung der lipidhaltigen RAFs einer Flora zu messen. Vier lebende Zellen von Interesse entfernen HEC 2 93-Zellen aus dem Inkubator.Die Zellen sollten am Vortag auf acht Fach-Lab-Tech-Objektträgern, die mit Poly-L-Lysin beschichtet sind, ausgesät worden sein, damit sie Zeit haben, sich anzusiedeln, in Medium ohne Phenol. Rotes Medium sollte verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Fluoreszenzsignal nicht gestört wird. Mit einer Pipette vorsichtig den größten Teil des Mediums aus der Vertiefung entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Zellen nicht austrocknen.Dann vorsichtig HBSS zu der Vertiefung hinzufügen. Diesen Waschschritt einmal für jede Vertiefung wiederholen. Danach 500 Mikroliter verdünntes Cholera-Toxin, Alexa 488, zu den Zellen für 30 Minuten hinzufügen.Bei 37 Grad Celsius bindet Cholera-Toxin an Gangliosid GM1, das nach der Inkubation bekanntermaßen bevorzugt in Lipidrafts angereichert ist. Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS, wie zuvor beschrieben; danach sind die Zellen bereit für die FCS-Datenaufnahme. Stellen Sie die gefärbten Zellen auf den Mikroskoptisch und überprüfen Sie die Temperatur- und Kohlendioxidgebung.Optimieren Sie die konfokale Bildgebung einer Zelle von Interesse mithilfe der internen Detektion des Mikroskops. Suchen Sie eine Zelle mit gut angefärbter Membran. Wechseln Sie wie zuvor in den Punkt-Scanning-Modus und wählen Sie einen Punkt in der Plasmamembran der Zelle von Interesse. Nehmen Sie ein bis zwei Aufnahmen der Zelle auf, um sicherzustellen, dass sich die Zelle während der Erfassung nicht bewegt. Wechseln Sie wie zuvor zur externen Detektion mittels SPAD und zur FCS-Software, um ein geeignetes Signal zwischen 10.000 und 50.000 sicherzustellen. Passen Sie die Z-Position, die Verstärkung und/oder die Laserleistung an.Sammlen Sie 10 Proben mit 32. Messungen, da die meisten Zellen autofluoreszent sind. Während der ersten Aufnahmen kann es aufgrund des Verblassens der Autofluoreszenz zu einer Abnahme der Fluoreszenz kommen. Analysieren Sie die Fluoreszenzschwankungen wie zuvor, um die mittlere FCS-Kurve zu bestimmen.Danach die multiphasische mittlere FCS-Kurve mit dem geeigneten mathematischen Modell anpassen. Verwenden Sie das Anpassungsmodul von Origin Pro mit der entsprechenden Gleichung. Diese Anpassung liefert die Diffusionszeiten und den Anteil der Moleküle, die mit diesen Diffusionszeiten diffundieren.Diese Abbildung zeigt ein Beispiel einer FCS-Kalibrierung mit einer Cholera-Toxin-Alexa-488-Lösung. Nach Überprüfung, ob die einzelnen Fluoreszenz-Messwerte als Funktion der Zeit keinen Photobleaching-Effekt zeigten, wurden die individuellen und mittleren FCS-Kurven berechnet. Die mittleren FCS-Kurven wurden mit Gleichungen angepasst, die verschiedenen Diffusionsmodellen entsprechen.Der klassisch herangezogene Parameter zur Bestimmung der Güte einer Anpassung ist das Bestimmtheitsmaß R quadrat. Je näher R quadrat bei eins liegt, desto besser ist die Anpassung, in diesem Fall das genauere Modell zur Anpassung. Die mittlere FCS-Kurve beschreibt eine Population fluoreszierender Moleküle, die frei in drei Dimensionen diffundieren.Die aus der Anpassung ermittelte Diffusionszeit beträgt 0,32 Millisekunden. Die Restwerte der Kurvenanpassung und der R-Quadrat-Faktor liefern hier eine Schätzung der Güte der Anpassung. Der R-Quadrat-Wert von 0,99906 weist auf eine gute Anpassung hin.Ein Beispiel der FCS-Analyse für mit Choleratoxin Alexa 488 markierte HC293-Zellen wird hier gezeigt. In diesem Beispiel beginnt das Toxin, endozytose zu werden, wie durch das Vorhandensein kleiner intrazellulärer fluoreszierender Punkte zur Beurteilung der Diffusion gezeigt wird. Zeitpunkt des Choleratoxins Alexa 488 an der Plasmamembran.Die Daten wurden wie in diesem Video beschrieben gesammelt und analysiert. Die multiphasische Form der mittleren FCS-Kurven zeigt das Vorhandensein von Populationen fluoreszierender Moleküle mit unterschiedlichen Diffusionszeiten auf. Die beste Anpassung an diese Kurve entspricht einem Modell mit drei Populationen fluoreszierender Sonden, wobei zwei davon eine behinderte Diffusion aufweisen.Diffusion in zwei Dimensionen, wie in der Membranebene, und eine weitere Population, die frei in drei Dimensionen diffundiert. Letztere Population entspricht fluoreszierenden Molekülen, die sich außerhalb der Membranebene bewegen. Mit anderen Worten binden oder lösen sich die fluoreszierenden Moleküle entweder an membranständige Zielstrukturen, erreichen die Membran über den Sekretions- oder Rezyklierungsweg oder verlassen die Membran durch Endozytose.An der Membran wurden zwei Diffusionszeiten beobachtet. 25 % der Moleküle wiesen eine Diffusionsrate von zwei Millisekunden auf, was einer Diffusion außerhalb von Lipidrafts entspricht. 50 % der Moleküle hatten Diffusionszeiten von 75 Millisekunden, was einer Diffusion innerhalb von Lipidrafts entspricht.Nach dieser Methode kann durch Kombination alternativer optischer Konfigurationen die Einzelmolekül-Detektion unterhalb der Beugungsgrenze durchgeführt werden, wodurch ein breiterer Bereich an Diffusionszeiten zugänglich wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Lipidrafts den Weg, krankheitsrelevante Dynamiken der Lipidraft-Partitionierung nach Veränderungen der Membranlipidzusammensetzung durch Medikamentengabe in Zelllinien und primären Kulturen zu untersuchen.

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Eine Methode zur Messung der Proteindiffusion in Membranen primärer Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wird beschrieben. In dieser Arbeit wird die Verwendung von Antikörpern für die Fluoreszenzmarkierung veranschaulicht.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein Protokoll zum Aufbau eines Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Mikroskops (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorzustellen.

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Lernen Sie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zur Quantifizierung der Lipid-Raft-Partitionierung lebender Zellen. Diese Methode ermöglicht dynamische Beobachtung von Membranmikrodomänen und zellulärer Signalübertragung.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

Weitere Videos entdecken