Name: Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Transplantation von Spermatogonien-Stammzellen und Hodengewebe-Xenografting bei Mäusen. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung der Spermatogenese und die Identifizierung funktioneller Stammzellen.

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Arbeiten Sie auf der Autoren Labor wurde von USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) unterstützt worden; NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) und Alberta Innovates - Health Solutions.

TEIL A. Germ-Transplantation bei Mäusen 1. Herstellung von Empfängermäuse <ol><li> Die Empfänger sollten immunologisch tolerant (entweder genetisch an die Spender oder immundefizienten abgestimmt) an die Spender Hoden-Zellen. </li><li> Die Empfänger sollten entweder von Natur aus frei von Spermatogenese (zB W / W v Mäuse) oder abgereichertes endogener Keimzellen. Germ Zell-Depletion kann durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan erreicht werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung von Empfängermäuse mit Busulfan. </li><li> Gönnen Empfänger bei 4-6 Wochen alt durch ip-Injektion von Busulfan. Die optimale Dosis von Busulfan ist Belastung abhängig. In häufigsten verwendeten Rezipientenstämme, ist eine Dosis von 40-50 mg / kg ausreichend ist, um endogenen Keimzellen (zB 44 mg / kg für Nacktmäuse, 50 mg / kg für B6/129 F1 Empfänger). Führen </li><li> Pulver auflösen Busulfan in DMSO und fügen Sie dann ein gleiches Volumen an sterilem destilliertem Wasser to tätigt eine abschließende Konzentration von 4 mg / ml. Halten Sie warme Lösung bei 35-40 ° C zu verwenden, um vor Fällung von Busulfan zu vermeiden. Entsorgen Lösung, wenn Niederschläge zu beobachten ist. </li><li> Nach Busulfan Behandlung, mindestens einen Monat vor der Verwendung die Empfänger zu ermöglichen. Die Empfänger können zwischen 1 Monat und 3 Monate nach der Busulfan Behandlung verwendet werden. </li></ol> 2. Herstellung von Mikroinjektion Pipetten <ol><li> Wählen Sie Borosilikatglas Pipetten (Kapillarröhrchen) mit einem 1,0 mm Außendurchmesser, einer 0,75 mm Innendurchmesser, und einer Länge von 3 Zoll. </li><li> Silikonisieren Glaspipetten mit Sigmacote gründlich Pipetten mit Methanol und trocken blasen. </li><li> Ziehen Sie die Pipette mit einer Pipette Abzieher. Verschiedene Pipette Abzieher Maschinen haben unterschiedliche Einstellungen, daher ein paar Einstellungen zu testen. Im Allgemeinen kann ein Setting ähnlich dem, dass zur Herstellung Enukleation verwendeten Pipetten arbeiten. </li><li> Brechen Sie die Pipettenspitzen unter Seziermikroskop vor dem Gebrauch auf einen Durchmesser von etwa 50 um zu erreichenan der Spitze. </li></ol> 3. Herstellung von Spenderzellen für die Transplantation <ol><li> Choise von Donor-Stamm ist abhängig von der experimentellen Frage und untersucht. Wenn Quantifizierung der Spermatogenese als Endpunkt benutzt wird, muss der Spender mit einem leicht identifizierbaren genetischen Marker wie Lac-Z (zB B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J vom Jackson Laboratory) oder GFP (zB C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J vom Jackson Laboratory). </li><li> Planen Sie 7 ml Collagenase in DMEM bei 1 mg / ml, 4 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin zzgl. 1 mM EDTA), und 2 ml DNase in DMEM bei 7 mg / ml. Dieser Betrag ist für die Verdauung von 2 Spender Mäusehoden. </li><li> Sammle Hoden aseptisch und entfernen Sie die Tunica albuginea. Spread-Hodenkanälchen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um enzymatische Verdauung zu erleichtern. </li><li> Transfer-Tubuli in Kollagenase, bei 37 ° C für 5-10 min, und häufig schütteln inkubieren. </li><li> Waschen Sie Tubuli zweimal durch Spinnen (200-300 g für 3 min) und Resuspendieren in PBS w / o Ca 2 + + </li><li> Resuspendieren Tubuli in Trypsin-EDTA und schütteln, bis sie klebrig und trübe geworden. Überwachen Sie die Verdauung von Tubuli bei 37 ° C, da sollte in 1-2 min auftreten. </li><li> Fügen Sie DNase und gut schütteln. Inkubieren Sie für 1-2 min. </li><li> Zusatz von 3 ml FBS, um die Aktion von Enzymen zu stoppen. </li><li> Einschränken Zellsuspension unter Verwendung eines Nylon Netzkappe mit 40-70 &amp;mgr; m Porengröße zu Zelle / Gewebe Brocken zu entfernen. </li><li> Collect-Zellen bei 600 g für 5 min und erneut zu suspendieren Zellen in einem kleinen Menge von DMEM (&lt;100 ul). </li><li> Zählen von Zellen und die Lautstärke auf einen gewünschten Endkonzentration (in der Regel 100 x 10 6). Halten Sie Zellsuspension auf Eis vor der Verwendung. </li><li> Jeder Busulfan-behandelten Maus Hoden wird mit nur 10-15 ul Zellsuspension gefüllt werden. Aufgrund möglicher Abfall-und Auslaufen, zielen darauf ab, 30-50 ul pro Hoden haben. </li></ol> 4. Transplantation Verfahren (Abbildung 1) <ol><li> Betäuben Empfänger nach genehmigten Protokollen. </li><li> Platz in RückenlageLiegen und chirurgisch bereiten den Bauchbereich. Machen Sie einen ~ 1cm Mittellinie Bauchschnitt, um die Bauchdecke entlarven. Heben Sie Bauchdecke mit Hilfe von kleinen Zangen an der Stelle der weißen Linie zu vermeiden, versehentlich verletzt Bauchorgane, und fahren Sie mit einem ~ 0,5 cm lange Inzision in der Mittellinie der Bauchwand, die Bauchhöhle aussetzen zu machen. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris Bauchdecke halten, und verwenden Sie ein anderes Paar von Iris Zange für die Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden in der Bauchhöhle zu suchen. Ziehen Sie das Fettpolster heraus, bis der Hoden wird entäußert und die Hoden und Nebenhoden Arterie sind deutlich sichtbar. Arbeit an einem Hoden auf einmal. </li><li> Legen Sie eine dünne sterile Abdeckung von autoklavierten Karteikarten unter dem Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (optional) gemacht. Der Faltenwurf funktioniert auch, um Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Einen Tropfen Trypanblau in die Zellsuspension vorsichtig und laden Sie die Zellsuspension in das Polyethylenlene einen Schlauch mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Befestigen Sie die gezogen Pipette in der Rohrleitung und sanft zwingen die Zelle Suspension in der Pipette durch Aufbringen von Druck auf die Spritze auf. </li><li> Identifizieren Sie die Ausführungsgänge (die die Hoden auf den Nebenhoden verbinden) und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Arbeiten Sie sorgfältig, wie die Kanäle und die Membran um sie durchscheinend sind. </li><li> Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden. </li><li> Während Vermeidung von bewegten die Injektionspipette, für die Spritze zu erreichen, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze um sicherzustellen, dass die Suspension in den Rete testis und Tubuli seminiferi strömt anfangen zu füllen. </li><li> Die Injektionsrate und den Fluss von Zellsuspension wird mit dem Daumen Druck reguliert wird. Vermeiden Sie plötzliche Erhöhung des Drucks; Kontrolle der Beförderung Suspension in Tubuli. </li><li> Stoppen Sie die Injektion wenn fast alle Oberflächen Tubuli gefüllt wurden, bevor die Hoden beginnt become ischämischen. </li><li> Bringen Sie den Hoden in die Bauchhöhle. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Nähen Sie die Bauchdecke mit 6-0 Seidenfaden und schließen Sie die Haut mit Metall Wundklammern. Überwachen Mäuse auf einem Pad Erwärmung bis zur vollständigen Genesung. </li></ol> 5. Die Analyse der Empfänger Hoden <ol><li> Erlauben Sie 2-4 Monate nach der Transplantation vor der Analyse. </li><li> Einschläfern den Empfänger Maus nach Tier in Pflege und Gebrauch Richtlinien und sammeln die Hoden und Nebenhoden in PBS. Wenn ein Lac-Z-transgenen Donor-Stamm verwendet worden ist, kann der Nebenhoden als positive Färbung Kontrolle verwendet werden, da es endogene Beta-Galactosidase-Aktivität aufweist. </li><li> Für den Nachweis von Spenderzellen durch Lac-Z-Färbung, beheben den Hoden für 1-2 Stunde bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Spülen Sie 3 x 30 min bei Raumtemperatur in lacZ Pufferspülgang. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in LacZ-Färbung Lösung. Hoden kann als Ganzes oder nach dem Dispergieren gefärbt werdendie Tubuli. </li><li> Fix und lagern in 10% neutral gepuffertem Formalin. Sofern Teile benötigt werden, verwenden neutrale schnell rot als Gegenfärbung. </li></ol> TEIL B. ektopische Xenografting bei Mäusen (Von Dobrinski und Rathi 2008 15, und Rodriguez-Sosa et al. 2011 16). 1. Sammlung von Spendergewebe <ol><li> Erhalten Hodengewebe durch Kastration oder Biopsie von einem Spender männlich. </li><li> Ort Hoden in PBS oder Biopsien in Kulturmedium, die Aufrechterhaltung sterilen Bedingungen. </li><li> Halten Sie das gesammelte Gewebe auf Eis und Transport ins Labor. </li></ol> 2. Herstellung von Spendergewebe <ol><li> Führen Sie in der Gewebekulturabzug zur Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Waschen Sie jeden Hoden in eiskaltem PBS mit Antibiotika zwei bis drei Mal vor der Übertragung in eine Kultur-Schale mit PBS. Im Falle von Biopsien, waschen Hoden Fragmente zwei-bis dreimal mit eiskaltem Kultur medium die Antibiotika enthalten, durch Drehen bei 150g für 2 min und Resuspendieren in frischem eiskaltem Kulturmedium. </li><li> Für intakte Hoden entfernen Tunica vaginalis durch einen Einschnitt entlang der Oberfläche und extrudieren die Hoden. Entfernen von Hoden aller Anhang Strukturen (Samenstrang, Nebenhoden, Bindegewebe). Waschen Hoden einmal in kaltem PBS und Überführung in eine Kultur-Schale mit PBS. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Tunica albuginea des Hodens mit einem Skalpell und eine Schere. Wenn der Hoden sehr klein ist, kann die Tunica durch Zusammendrücken des Hodengewebe Stelle von der Tunica durch einen kleinen Einschnitt verfügt am einen Ende, während die Tunica mit einem Paar von kleinen Pinzette am anderen Ende entfernt werden. </li><li> Je nach Größe des Hodens entweder die gesamte Hodengewebe können in kleine Stücke von der Umgebung von 1 zugeschnitten - 2 mm 3 in der Größe unter Verwendung einer gebogenen Pinzette und ein Skalpell-Klinge, oder große Stücke von Hodengewebe kann zunächst aus dem Hoden entfernt werden und dann schneiden in kleinereStück. All dies sollte in eiskaltem Kulturmedium und unter sterilen Bedingungen in einem kleinen Kulturschale (60 x15 mm) erfolgen. </li><li> Übertragen Sie die vorbereiteten Gewebestücke zu eiskaltem Kulturmedium in kleinen Kultur-Gerichte auf Eis, bis Pfropfen. </li></ol> 3. Kastration von Empfängermaus <ol><li> Betäuben Maus wie oben vorbereiten und sterile OP-Feld durch Schneiden der Haare (nicht notwendig in Nacktmäusen), Abreiben mit 70% Ethanol und Betadine Lösung. </li><li> Machen Sie einen 0,5 -1 cm ventralen Mittellinie Hautschnitt, um die Bauchdecke entlarven. </li><li> Sorgfältig Setzen Sie den Hoden, die Hoden und Nebenhoden Arterie wie in TeilA, 4,2-4,3 beschrieben. </li><li> Nehmen Sie den Schwanz der epidydimis aus dem Gubernaculum durch stumpfe Präparation. </li><li> Ligieren der A. testicularis und der Samenleiter gemeinsam mit dem Blutgefäß mit Seide, und Abschnitt die ligierten Strukturen durch Schneiden zwischen den Hoden und der Ligatur. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für das secoND Hoden. </li><li> Nähen Sie die Bauchdecke mit einem oder zwei chirurgischen Nähten. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit einem oder zwei Michel-Clips. </li></ol> 4. Ektopische Xenografting <ol><li> Positionieren Sie die Maus im ventralen Liegen und bereiten einen sterilen OP-Feld auf dem Rücken wie oben. </li><li> Je nachdem wie viele Transplantate werden ausschliesslich zum eingefügt (in der Regel 4-8/mouse) werden, machen ~ 0,5 cm lange Hautschnitte auf jeder Seite der Mittellinie der Rückseite der Maus. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um einen Rand der Hautschnitt zu halten, und machen einen Hohlraum, der durch subkutane Hänseleien auseinander das Bindegewebe mit einer Schere. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette Iris Ort ein Stück Hodengewebe tief in das subkutane Hohlraum, hält die Grenze der Hautschnitt mit einem anderen Iris Zange. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit einem Michel-Clip und halten der Maus auf Heizkissen, bis er aus der Narkose zu erholen beginnt. </li><li> Übertragen Sie die Maus an einem Käfig mit zusätzlicher Dämmung und CoVer-und Monitor, bis Mäuse werden vollständig erholt. </li></ol> 5. Sammlung von Hoden Xenotransplantate für Analyse-und Samenzellen der Ernte <ol><li> Einschläfern den Host-Maus nach Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung, und machen eine Mittellinie Hautschnitt an der Rückseite der Haut ab dem Schwanz an den Hals und offene Haut. Dies macht die Transplantate, die entweder auf dem subkutanen Gewebe lokalisiert werden kann oder an der Haut befestigt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Transplantate unter Verwendung eines Paares Zange und eine Schere. </li><li> Rekordzahl von Transplantaten erholt, Größe und Gewicht der einzelnen Transplantate. </li><li> Herumführen Samenblasen aus dem Bauch der Maus und aufzeichnen ihr Gewicht als Hinweis auf Testosteron-Produktion durch die transplantierten Gewebes. </li><li> Für die histologische Analyse <ol class="lalpha"><li> Suspend-Xenotransplantaten in Probenfläschchen mit Bouin-Lösung (oder andere Fixativ) in einem Volumen ~~~V dass der Xenograft-10x, und Etikett Fläschchen angemessen. </li><li> Bebrütenüber Nacht im Kühlschrank durch Waschen mindestens 3-mal in 70% Ethanol in Abständen von 24 Stunden vorzugsweise gefolgt. </li><li> Gehen Sie für die Bearbeitung und Einbettung in Paraffin. </li></ol></li><li> Für Spermien Ernte <ol class="lalpha"><li> Waschen Sie Xenotransplantate durch Spinnen sie sich an 300g für 1 min und Resuspendieren sie in Kulturmedium mit Antibiotika enthielt. </li><li> Schneiden Sie Transplantate in kleine Stücke hacken und vorsichtig mit der Pinzette in einem Gewebe Kulturschale mit 3 bis 5 ml Kulturmedium. </li><li> Filter zerkleinerte Gewebe durch die Zelle 40 um Sieb. </li></ol></li></ol> TEIL C. repräsentative Ergebnisse 1. Germ-Transplantation Wenn die transplantierten Spender-Zell-Suspension enthält Stammsamenzellen Tragen eines genetischen Markers wie des LacZ-Transgen, Kolonisierung der Spender SSCs in den Empfängerländern Hoden kann durch X-gal-Färbung sichtbar gemacht, wie markanten blauen Segmente des SEMiniferous Tubuli nach 2-3 Monate nach der Transplantation 3 (Abbildung 2A). Eine gut etablierte Kolonie sollte eine lange dunkelblaue Strecke komplett gefüllt Segmente mit zwei oder mehr Schichten von blauen Zellen näher an das Zentrum, und relativ schwächer gefärbte Bereiche an beiden Enden haben, wo ein Netzwerk von einzelnen, gepaart oder kleine Gruppen von blauen Zellen ist ersichtlich, 3 (Abbildung 2B). Ein Querschnitt des dunkelblauen Samenkanälchens Region zeigen sollte, gut etablierte und gut organisierte Spermatogenese mit blauen Keimzellen in verschiedenen Stadien Differenzierung (Abbildung 2C). 2. Hodengewebe Xenografting Die Lebensfähigkeit der Hodengewebe nach der Transplantation ist invers mit der Entwicklungsstufe des Spenders korreliert; das beste Ergebnis wird erzielt, wenn Gewebe von männlichen Neugeborenen verwendet wird, während die adulten Gewebe zeigt eine hohe Tendenz zu degenerieren und sterben 17-21. Im allgemeinen nimmt Xenograft Erfolg als Spendergewebe durchläuft michiosis von der ersten Welle der Spermatogenese. Zeit bis zur vollen Entwicklung der unreifen Spendergewebe und komplette Spermatogenese ist artspezifisch, und oft etwas kürzer im Vergleich mit Hoden in situ. Die Zahl der Hodenkanälchen mit vollständiger Spermatogenese ist variabel je nach Tierart. Während bei Schafen, Ziegen und Schweine, dass Teilnummer größer als 50% ist, in Rinder und Katzen ist es weniger als 15% 14 (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Keimzelle Transplantation Verfahren. Platz Empfänger in Rückenlage nach der Narkose und eine ~ 0,4-Zoll-Mittellinie Bauchschnitt (A). Expose Hoden durch die Rücknahme des Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden und legen Sie eine dünne sterile Abdeckung unterhalb des Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (B). Positionieren Sie den Hoden und Nebenhoden, so dass die Ausführungsgänge in das Fettpolster begraben erkennbar sind (C, D, E). IdentifikationUnternehmen die Ausführungsgänge und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Ein Stück farbiges Papier oder Kunststoff können unter die Kanäle für eine bessere Visualisierung (G) abgegeben werden. Break oder schleifen die Pipettenspitze nach Anspruch der hat eine Größe von den Kanälen und Last Zellsuspension in die Pipette (H). Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden (der Pfeil in H zeigt die Richtung der Pipette Injektion und Gewindeschneiden). Ein Hoden mit erfolgreichen Injektion in den Samenleiter wird (I) gezeigt. Ts: Hoden, EP: Nebenhoden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Keimzell-Transplantation A) einen injiziert Testis mit X-gal gefärbt. Die blauen Segmente der Samenleiter darstellen etablierten Kolonien aus transgenen Spenders SSCs (LacZ-Transgen). B) Stärkere Vergrößerung eines SSC Kolonie 3 Monate nach der Transplantation. The dunkelblau Region in der Mitte stellt komplette Spermatogenese und die hellblauen Regionen an den Enden repräsentieren wachsenden Ausdehnung der Kolonie. C) einem histologischen Schnitt des dunkelblauen Samenkanälchens (3 Monate nach der Transplantation) zeigt gut organisiert Spermatogenese. Maßstabsbalken in B und C sind 200 um und 30 um jeweils. (Zahlen aus Annu Rev Cell Dev. Biol. angepasst 2008;. 24:263-86 und Biol Reprod Juni 1999;. 60 (6) :1429-36). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ektopische Xenografting von unreifen Hodengewebe von Großtieren in immundefizienten Mäusen. Fragmente von unreifen Hoden Spender (~ 1 mm 3) unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen (A) transplantiert werden können, um zu überleben und reagieren auf Maus Gonadotropine. Als ein Ergebnis erfährt Testisgewebe komplette Entwicklung, einschließlich der Bildung der Befruchtung zuständigen Spermien (B). Sobald Hoden Xenotransplantate werden gesammelt (C)sie können für die Analyse oder zu Spermien (D) für ICSI (E) und Embryo-Erzeugungseinheiten (F) zu erhalten verwendet werden. Bars gleich 50 um (B, E und F) oder 10 um (D). (Geändert von Rodriguez-Sosa und Dobrinksi 2009 14).

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

1. Germ-Transplantation Keimzell-Transplantation bietet die einzig funktionierende Assay für eindeutige Bestätigung der Gegenwart von spermatogonialen Stammzellen (SSC) in einer Zellpopulation. Nur SSCs können nach Hause zu besiedeln und die SSC-Nische an der Basalmembran und initiieren Donor-derived Spermatogenese. Keimzelle der Transplantation war es möglich, zu studieren und zu manipulieren SSCs in beispielloser Weise. Die Technik wurde genutzt, um transgene Tiere durch genetische Manipulat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Collagenase (Typ IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypanblau-Färbung </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Nylon Mesh Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 (40 um) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> Dünnwand Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD Intramedic plyethylene Schlauch (PE 100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 Seidennaht </td><td> Ethicon </td><td> 706g </td></tr><tr><td> Wundklammern </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Kaliumferrocyanid </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Kaliumferricyanid </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ cell transplantation und hodengewebe in mäusen xenografting

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Keimzelle der Transplantation wurde von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania im Jahr 1994 1,2 entwickelt. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Mikroinjektion von Keimzellen von Mäusen fruchtbaren Spender in die Samenleiter des unfruchtbaren Empfängermäuse Ergebnisse in Donor abgeleitete Spermatogenese und Spermien durch den Empfänger Tier 2. Die Nutzung von Spender männlichen Trägern die bakterielle β-Galactosidase-Gen erlaubte die Identifizierung Donor abgeleitete Spermatogenese und Übermittlung des Donor Haplotyp an die Nachkommen durch den Empfänger Tiere 1. Überraschenderweise, nach der Transplantation in das Lumen der Tubuli seminiferi, waren transplantierten Keimzellen in der Lage, von der luminalen Kompartiment zu dem Basalmembran, wo Spermatogonien 3 angeordnet sind zu bewegen. Es ist allgemein anerkannt, dass nur SSCs der Lage, die Nische und wieder herzustellen Spermatogenese in den Hoden zu kolonisieren Empfänger sind. Daher KeimzelleTransplantation bietet einen funktionalen Ansatz, um die Stammzell-Nische in den Hoden zu studieren und zu vermeintlichen Stammsamenzellen charakterisieren. Bis heute ist Keimzelle Transplantation verwendet werden, um grundlegende Stammzellbiologie aufzuklären, um transgene Tiere durch genetische Manipulation der Keimzellen vor der Transplantation 4,5 zu produzieren, zu Sertoli-Zell-Interaktion Keimzelle 6,7, SSC Homing und Kolonisierung 3-Studie 8, sowie SSC Selbsterneuerung und Differenzierung 9,10. Germ-Transplantation ist auch in großen Spezies 11 machbar. In diesen sind die Hauptanwendungen Erhaltung der Fruchtbarkeit, die Verbreitung von Elite Genetik in Tierpopulationen, und die Erzeugung von transgenen Tieren, wie die Studie der Spermatogenese und SSC Biologie mit dieser Technik ist, logistisch schwieriger und teurer als bei Nagern. Die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten in die Samenleiter von Mäusen führt zu colonization von Spenderzellen und Spermatogonien Expansion, aber nicht in ihrer vollen Differenzierung vermutlich aufgrund der Inkompatibilität des Empfängers somatische Zell-Kompartiment mit den Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies 12. Ein alternativer Ansatz ist die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten zusammen mit den sie umgebenden somatischen Fach. Zunächst berichtete im Jahr 2002, dass kleine Fragmente von Hodengewebe aus unreifen Männchen unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen transplantiert in der Lage, zu überleben und zu unterziehen volle Entwicklung mit der Produktion von Spermien Befruchtung zuständig sind 13. Seitdem Hodengewebe Xenografting hat sich gezeigt, dass bei vielen Arten erfolgreich und entpuppte sich als wertvolle Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Tiere bei Mäusen 14 zu studieren.

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Die Keimzelltransplantation wurde 1994 von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania entwickelt1,2. Diese wegweisenden Studien ...

In diesem Video werden zwei verwandte Techniken demonstriert. Die erste ist die Transplantation von Spermatogonien-Stammzellen, oder SSC-Transplantation, und die zweite ist die Xenotransplantation dieser Gewebe. Die SSC-Transplantation dient dazu, die Spermatogenese aus den SSCs eines Spenders in den Hoden eines Empfängers zu erzeugen.Dies wird erreicht, indem eine Zellsuspension aus Spenderhoden oder kultivierten Zellen hergestellt wird, die SSCs aus einem Spender mit einem identifizierbaren transgenen Marker wie GFP oder LAC Z enthalten. Anschließend werden die Hoden des empfängenden Männchens nach außen verlagert. Der Empfänger wurde so behandelt, dass seine Hoden keine Keimzellen enthalten. Danach werden die EENT-Enten des empfängenden Männchens isoliert und mit Spenderzellen injiziert, die mit Taan gemischt wurden.Blaufärbung. Letztendlich ist die Besiedlung des Keimdrüsenepithels des Empfängers durch keimzelleigene Zellen des Spenders zwei bis drei Monate nach der Transplantation erkennbar, wie in diesem Beispiel durch Xal-Färbung der Hoden des Empfängers gezeigt wird, die die Kolonisation durch lacZ-exprimierende Donorzellen nachweist.Die zweite in diesem Video demonstrierte Technik beinhaltet die Xenotransplantation von Hodengewebe. Beim Hodengewebe-Rafting wird die Entwicklung des Hodengewebes und die Spermatogenese einer Spenderart ermöglicht, indem Gewebefragmente aus den Hoden unreifer Spender in defiziente Mauswirte transplantiert werden. Dies geschieht, indem zunächst geeignete Gewebefragmente aus den Hoden einer großen Spenderart, wie beispielsweise einem Schwein wie im hier gezeigten Beispiel, für die Transplantation vorbereitet werden.Der nächste Schritt besteht darin, eine immundefiziente erwachsene Empfängertau zu kastrieren und anschließend die Spender-Testisfragmente unter die dorsale Haut der Empfängertau zu transplantieren. Die Empfängertaus fungieren als in-vivo-Inkubatoren, wodurch sich die Testis-Xenotransplantate innerhalb von sechs bis sieben Monaten vollständig entwickeln können, abhängig von der Spenderart. Die Transplantation von Spermatogonialstammzellen wurde erstmals von Ralph Brinster und seinen Kollegen an der University of Pennsylvania entwickelt und 1994 erstmals beschrieben.Seitdem hat es eine weite Verbreitung gefunden und stellt derzeit den Goldstandard-Bioassay im Bereich der Keimbahn-Stammzellbiologie dar, um zentrale Fragen dieses Forschungsgebiets zu beantworten, beispielsweise die Aufklärung von Signalwegen, die die Selbstvermehrung von Stammzellen steuern. Die Idee zur Xenotransplantation entstand, als wir erkannten, dass die Transplantation isolierter spermatogonialer Stammzellen von nicht-nagetierartigen Spendern – beispielsweise Schweinen, Primaten oder Menschen – in einen Maustestis keine vollständige, spenderspezifische Spermatogenese hervorrief. Wir konnten zeigen, dass die Erhaltung des Mikroumfelds des Testis durch die Transplantation kleiner Testisgewebefragmente anstelle isolierter Keimzellen diese Einschränkung überwinden und zu einer vollständigen, spenderspezifischen Spermatogenese einer phylogenetisch weit entfernten Art in einem Mauswirt führen kann.Dies wurde erstmals von uns im Jahr 2002 berichtet. Für das Protokoll zur Keimzelltransplantation ist die Herstellung der zu injizierenden Zellsuspension erforderlich. Einzelheiten zur Herstellung sind dem schriftlichen Manuskript zu entnehmen.Beginnen Sie den Transplantationsvorgang, indem Sie die Empfängermaus anästhesieren und eine ausreichende Anästhesietiefe sicherstellen, indem Sie überprüfen, ob keine Schmerzreflexe auftreten. Danach positionieren Sie das Tier in dorsaler Rückenlage und bereiten den Bauchbereich chirurgisch vor. Führen Sie einen etwa einen Zentimeter langen medianen Schnitt durch, um die Bauchwand freizulegen.Heben Sie die Bauchwand mit einer Pinzette an der Stelle der weißen Linie an, um Bauchorgane versehentlich zu schonen. Führen Sie dann einen halbzentimeterlangen Schnitt durch, um die Bauchhöhle mit Hilfe feiner Pinzetten freizulegen. Legen Sie den Hoden frei, indem Sie das am Hoden und Nebenhoden angeheftete Fettlager ziehen, und platzieren Sie diese Strukturen auf einer sterilen Karteikarte.Geben Sie nun Triangewärbefarbstoff zur Zellsuspension hinzu. Laden Sie anschließend die Zellsuspension in ein Polyethylenrohr, das mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist, und befestigen Sie die gezogene Pipette am Tubing. Drücken Sie die Zellsuspension vorsichtig durch Anlegen von Druck an der Spritze in die Pipette.Nun werden wir den kritischsten Schritt für die SCC-Transplantation durchführen, nämlich die Identifizierung und Kanülierung der ENT-Gänge. Identifizieren Sie mithilfe eines Stereomikroskops die Ausführungsgänge zwischen den Hoden und den EPIs und entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe um die Gänge herum. Arbeiten Sie sorgfältig, da die Gänge und die sie umgebende Membran durchscheinend sind.Stabilisieren Sie die Ducti, indem Sie sie mit einem sterilen, dreieckigen Kunststoffstück umschließen. Führen Sie dann vorsichtig die Injektionspipette in einen Ductus innerhalb des Bündels von Ferrenducti ein. Schieben Sie die Pipette behutsam einige Millimeter in Richtung Hoden vor. Halten Sie die Injektionspipette ruhig und injizieren Sie langsam die Zellen, während der Ductus deferens und die Samenkanälchen sich füllen; halten Sie einen gleichmäßigen Fluss aufrecht, bis fast alle an der Oberfläche sichtbaren Kanälchen gefüllt sind. Überfüllen Sie nicht, da sonst das Hodengewebe ischämisch wird. Bringen Sie nun den Hoden in die Bauchhöhle zurück und wiederholen Sie den Vorgang am kontralateralen Hoden.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, schließen Sie die Bauchdecke mit einer Seidennaht 6-0 und die Haut mit metallischen Wundclips. Überwachen Sie die Maus nach der Operation auf einer Wärmematte, bis sie sich aus der Narkose ausreichend erholt hat, um in ihren Heimkäfig zurückgebracht zu werden. Das zweite zu demonstrierende Verfahren, die xenotransplantative Gewebepflanzung von Hodengewebe, beinhaltet die Verwendung von Hodenbiopsien oder intakten Hoden von Spendern.Im Fall von Biopsien waschen Sie die Hodenfragmente zwei- oder dreimal in eiskaltem Kulturmedium mit Antibiotika. Nach jedem Waschschritt zentrifugieren Sie die Suspension und resuspendieren das Pellet. Überführen Sie das gewaschene Gewebe in frische Lösung, übertragen es in eine saubere Schale und schneiden die Biopsien in kleinere Fragmente für die Transplantation. Mit gebogenen Pinzetten und einem Skalpell erfordern intakte Hoden eine aufwändigere Vorbereitung. Spülen Sie zunächst jeden Hoden zwei- oder dreimal mit eiskalter PBS, die Antibiotika enthält. Überführen Sie dann die gereinigten Hoden in eine saubere Schale mit PBS.Entfernen Sie anschließend die Tunica vaginalis, indem Sie einen Schnitt entlang der Oberfläche machen und die Hoden herauspräparieren. Entfernen Sie alle anhängenden Strukturen wie Samenstrang, Nebenhoden und Bindegewebe. Waschen Sie die gewonnenen Hoden einmal in kaltem PBS und überführen Sie sie in eine Kulturschale mit PBS.Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Tunica albuginea mit einer Skalpellklinge in Scherenform. Falls der Hoden sehr klein ist, kann die Tunica entfernt werden, indem das Hodengewebe durch eine kleine Einritzung in einer kleinen Kulturschale, die mit Eis und kaltem Medium gefüllt ist, herausgedrückt wird. Zerkleinern Sie den Hoden dann, wie zuvor beschrieben, allmählich in kleine Stücke. Wählen Sie abschließend Gewebefragmente für das Xenotransplantat aus, und isolieren Sie sie in Kulturschalen mit eiskaltem Kulturmedium, bis sie benötigt werden. Betäuben Sie eine Maus wie zuvor beschrieben. Anschließend platzieren Sie die Maus auf einer Wärmematte.Bereiten Sie das sterile Operationsfeld vor, indem Sie das Haar am Bauch und Rücken abschneiden. Wischen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol und Betadine-Lösung ab. Um die Kastration durchzuführen, machen Sie einen halb bis einen Zentimeter langen ventralen medianen Hautschnitt, um die Bauchwand freizulegen.Danach die Bauchdecke durchschneiden, um die Bauchhöhle freizulegen. Anschließend den Hoden, die Hodenarterie und den Nebenhoden vorsichtig wie zuvor beschrieben freilegen. Danach die Schwänze der Nebenhoden durch stumpfe Dissektion vom Hodenhalteband lösen.Als Nächstes ligieren Sie die Hodenarterie im Samenstrang zusammen mit dem Blutgefäß unter Verwendung von Seidenlitzen. Anschließend schneiden Sie die ligierten Strukturen zwischen den Hoden und der Ligatur durch. Nachdem Sie den Vorgang für den zweiten Hoden wiederholt haben, nähen Sie die Bauchwand mit ein oder zwei chirurgischen Nähten und verschließen den Hautschnitt mit ein oder zwei Micc-Clips, um die ektopischen Xenotransplantate zu implantieren.Platzieren Sie eine kastrierte, anästhesierte Maus in ventraler Rückenlage und bereiten Sie ein steriles Operationsfeld auf ihrem Rücken vor. Für jede zu implantierende Transplantat machen Sie mit einer Pinzette, die einen Rand des Hautschnitts hält, einen etwa einen halben Zentimeter langen Hautschnitt auf jeder Seite der Mittellinie. Verwenden Sie eine Schere, um eine fünf bis zehn Millimeter tiefe subkutane Höhle zu schaffen.L&ouml;sen Sie das Bindegewebe vorsichtig, um einen tiefen Hohlraum zu schaffen, der f&uuml;r die Transplantatunterbringung ausreicht und verhindert, dass das Transplantat durch die Verschlussklemme erfasst wird. Verwenden Sie daf&uuml;r feine Pinzetten. Legen Sie ein St&uuml;ck Hodengewebe tief in den subkutanen Hohlraum, wobei Sie den Wundrand der Hautinzision mit einer Iris-Pinzette festhalten.Schließen Sie jeden Hautschnitt mit einem Mikroklemme. Anschließend lässt man die Maus auf einer Heizplatte von der Anästhesie aufwachen. Sobald die Maus wieder bei Bewusstsein ist, überführen Sie sie in ihren Heimkäfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat.Transplantierte Stammzellen von Spenderspermatogonien, die ein lae-Transgen exprimieren, besiedelten zwei bis drei Monate nach der Transplantation das Hodengewebe des Empfängers. Die Färbung zeigte deutlich hervortretende blaue Abschnitte der seminiferen Tubuli des Empfängers. Eine gut etablierte Kolonie weist einen langen, dunkelblauen Bereich vollständig gefüllter Segmente auf, wobei sich an beiden Enden der Kolonie zwei oder mehr Schichten blauer Zellen näher zur Mitte befinden.Eine Vernetzung einzelner gepaarter oder kleiner Zellgruppen ist ebenfalls erkennbar. Ein Querschnitt des dunkelblauen Bereichs der Samenkanälchen zeigte eine gut etablierte und gut organisierte Parato-Genese mit blauen Keimzellen in verschiedenen Differenzierungsstadien. Bei Hodengeweben wurden Xenotransplantat-Fragmente unreifer Spenderhoden unter die dorsale Haut immundefizienter Mäuse transplantiert und konnten überleben sowie auf gonadotrope Hormone der Maus reagieren.Als Ergebnis durchlief das Hodengewebe eine vollständige Entwicklung, einschließlich der Bildung von befruchtungsfähigen Spermien. Nachdem die Hodengenerftransplantate gewonnen wurden, wurden sie verwendet, um Spermien für die In-vitro-Befruchtung und Embryonenproduktion zu erhalten. Die Transplantation von Spermienstammzellen fördert das Fachgebiet der Stammzellbiologie durch die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und ihrer Nische im Hoden sowie durch die Entwicklung von Kulturbedingungen zur in-vitro-Vermehrung von Spermienstammzellen nach der Entwicklung von Hodengenerftransplantaten.Die Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der männlichen Fortpflanzungsbiologie, um Aspekte der Spermatogenese, reproduktiven Toxikologie sowie der Konservierung von genetischem Material von unreifen Männchen bei einer Vielzahl von Spenderarten – von Mäusen bis zum Menschen – zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Verfahren zur sicheren Pfropfen Luciferase-markierten menschlichen malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen in den Ischiasnerv von immundefizienten Mäusen beschrieben. Der Einsatz von Biolumineszenz-Bildgebung, um die ordnungsgemäße Errichtung von Tumor Transplantate und Kriterien für die zufällige Trennung der Tiere in Arbeitsgruppen zeigen, werden ebenfalls diskutiert.

Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Die etablierte Technik, um primäre invasive orthotopen Blasenkrebs Xenografts impfen erfordert Laparotomie und Mobilisierung der Blase. Dieses Verfahren verursacht eine signifikante Morbidität auf Mäuse, ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Wir haben deshalb eine hohe Präzision, die perkutane Ansatz verwendet Ultraschallkontrolle.

Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, die zur Erzeugung von von Prostatakrebspatienten abgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs) aus zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) verwendet wird. Die Generierung von PDX-Modellen aus CTCs bietet ein alternatives experimentelles Modell zur Untersuchung von Prostatakrebs; Der am häufigsten diagnostizierte Tumor und eine häufige Todesursache durch Krebs bei Männern.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Erfahren Sie die Transplantation von Spermatogonien-Stammzellen und Hodengewebe-Xenografting bei Mäusen. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung der Spermatogenese und die Identifizierung funktioneller Stammzellen.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

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