Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Ziel dieses Verfahrens ist es, sympathische Neuronen so zu kultivieren, dass sie ihr dendritisches Wachstum manipulieren können. Dies wird erreicht, indem zunächst die oberen Zervixganglien unter sterilen Bedingungen von den perinatalen Nagetierbabys isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Ganglien zu dissoziieren, um eine einzellige Suspension zu bilden, die auf den vorbereiteten Substraten plattiert wird.

Inde definiertes Medium. Nachdem Sie die Kulturen mit einem Antimitotikum behandelt haben, um die nicht-neuronalen Zellen zu eliminieren, behandeln Sie die Kulturen mit BMPs oder Matrigel, um das dendritische Wachstum zu induzieren. Letztendlich wird Karte zwei der Immunreaktivität verwendet, um die erweiterten Dendriten der kultivierten sympathischen Neuronen zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Primärkultur von Hippocampus-Neuronen besteht darin, dass es möglich ist, den morphologischen Zustand von DYS-Neuronen so zu manipulieren, dass weniger als 5 % der Neuronen in Kultur Dendriten oder mehr als 95 % der Neuronen in Kultur einen robusten ntischen Auswuchs aufweisen. Um die assoziierten Kulturen des SCG aus den pränatalen Rattenbabys im Alter von 19 bis 21 Embryonaltagen vorzubereiten, Rasieren Sie zuerst den Bauch einer eingeschläferten trächtigen Ratte, reinigen Sie das hautlose 70%Ethanol, entfernen Sie dann die Gebärmutterhörner unter sterilen Bedingungen und vermeiden Sie eine Beschädigung des Darms oder anderer innerer Organe. Legen Sie die Gebärmutterhörner in eine sterile 150 Millimeter Petrischale. Als nächstes gibst du die Petrischale auf eine Pfanne mit Eis.

Um die embryonalen Welpen zu betäuben, um den Welpen einzuschläfern, durchtrennen Sie das Rückenmark entlang der Mittellinie unter seiner Schulter. Dadurch wird auch der Schwellkörper durchtrennt, was die Blutung aus der Halsschlagader reduzieren würde. Bei der Dissektion des SCG werden die Embryonen in steriles Leibovitz L 15-Medium gelegt, das mit Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Übertragen Sie dann die Embryonen in eine 150 Millimeter große Petrischale, die zur Hälfte mit Sil Guard gefüllt ist, und legen Sie sie auf den Rücken.

Verwenden Sie die sterilen 20-Gauge-Nadeln, um den Thorax und den Kopf zu fixieren und den Hals sanft zu überdehnen, um die Dissektion des SCG unter dem Mikroskop zu erleichtern. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie entlang des Halses auf Höhe der Schlüsselbeine, um die Unterkieferdrüsen freizulegen. Entfernen Sie die Drüsen mit einer feinen Pinzette, um die Muskelschicht freizulegen.

Schneiden Sie dann den M. sternocleidomastoideus in der Nähe des Schlüsselbeins ab und heben Sie den Musculus omohyoidus neben der Luftröhre vorsichtig an. Dieser Muskel ist sehr dünn, vermeiden Sie also zu tiefe Schnitte, da dies die darunter liegende Halsschlagader und die SCG reißen würde. Sind diese Muskelschichten entfernt, sollten die Halsschlagader und der Vagusnerv deutlich sichtbar sein.

Das SCG liegt knapp unterhalb der Bifurkation des Blunts der Halsschlagader. Präparieren Sie das Gewebe von beiden Seiten der Halsschlagader mit der feinen Pinzette, um das Ganglion freizulegen. Fassen Sie dann mit zwei feinen Zangen die Halsschlagader direkt über bzw. unter der rostralen bzw. kordalen Linse des SCG.

Um den über dem SCG liegenden Abschnitt der Halsschlagader zu entfernen, ist es wahrscheinlich, dass in diesem Schritt auch das Schlingenganglion entfernt wird, das in diesem Entwicklungsstadium neben dem SCG liegt. Das präparierte Gewebe wird in eine sterile 35-Millimeter-Kulturschale gegeben, die L-15-Medium und Antibiotika enthält. Entfernen Sie danach das SCG von allen Welpen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.

Trennen Sie als Nächstes das SCG vorsichtig von der Halsschlagader und allen anderen Geweben. Während der Dissektion entfernen. Entferne die Kapsel aus den Ganglien.

Übertragen Sie dann die Ganglien in eine andere sterile 35-Millimeter-Schale, die L 15 Medium enthält. Um das SCG zu dissoziieren, entfernen Sie L 15 Medium. Ersetzen Sie es durch Kollagenase dys basing calcium und magnesium free hanks balance sort solution.

Dann inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Übertragen Sie danach das SCG in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Erhöhen Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit L 15, ergänzt mit BSA, auf eine Endkonzentration von ein bis zwei Milligramm pro Milliliter.

Zentrifugieren Sie bei 200 μg bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Nach fünf Minuten wird das Supinat verworfen und nach dem zweiten Waschen erneut mit L 15 und BSA gewaschen. L 15 Medium entfernen und die Ganglien in zwei Millilitern Kultur zügeln.

Medium tri rate die Zellen etwa drei- bis viermal mit einer feuerpolierten Pipette mit gebogener Spitze. Stellen Sie sicher, dass die Pipette vor dem TRI mit BSAL 15 beschichtet ist, um das Anhaften der Zellen am Glas zu minimieren. Lassen Sie die großen Klumpen etwa eine Minute lang ruhen und geben Sie dann die Zellsuspension in einen konischen 15-Milliliter-Behälter.

Fügen Sie anschließend weitere Nährmedien zu den verbleibenden SCG und Tri rate hinzu. Nachdem sich die Klumpen abgesetzt haben, übertragen Sie die Zellsuspension vom zweiten Tri auf die nach dem ersten Tri gesammelte Suspension. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis die Ganglien größtenteils dissoziiert sind.

Verwerfen Sie alle verbleibenden Klumpen nach dem vierten Versuch für die Zellen, die von einem Liter Rattenbabys dissoziiert wurden, sollte das Gesamtvolumen des Mediums in der Zellsuspension auf acht bis 10 Milliliter gebracht werden. Durch Zugabe von zusätzlichem Kulturmedium können Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette resuspendieren. Sammeln Sie dann ein kleines Aliquot für die Bestimmung der Zelldichte.

Passen Sie das Volumen der Zellsuspension an, um die doppelte Zelldichte zu erreichen, die in der Kultur gewünscht ist. Als nächstes aliquotieren Sie 250 Mikroliter Zellsuspension pro Well. Für die morphometrischen Studien des dendritischen Wachstums beschichten wir typischerweise Zellen in 24, Well-Platten mit geringer Dichte, etwa fünfmal 10 der vier Zellen pro Well.

Legen Sie dann die SCG-Kulturen auf die Porzellan-Trockenplatte in das Glastrockenmittel mit sterilem Wasser. Injizieren Sie etwa 120 Milliliter Kohlendioxid in das Trockenmittel, bevor Sie es verschließen. Danach geben Sie das gesamte Trockenmittel in einen Inkubator und stellen es auf 35,5 Grad Celsius ein.

In diesem Verfahren. Füttern Sie die Kultur, indem Sie die Hälfte des Mediums 24 Stunden nach dem Plattieren austauschen und wiederholen Sie dies dreimal pro Woche, um nicht-neuronale Zellen aus der Kultur zu entfernen. Das Antimitotikum RRC in einer Konzentration von ein bis zwei Mikromolaren wird zu diesem Zeitpunkt typischerweise dem Kulturmedium zugesetzt.

Geben Sie dann das frische Kulturmedium mit RSC in jede Vertiefung und kultivieren Sie es 48 Stunden lang, um das dendritische Wachstum zu induzieren, nachdem die nicht-neuronalen Zellen eliminiert und der RSC-Spiegel signifikant reduziert wurde. Geben Sie am fünften Tag Matrigel oder BMP sieben in das Nährmedium. In vitro füttern Sie dann die Kultur, wie zuvor beschrieben, hier gezeigt, als ein Neuron, das unter den Kontrollbedingungen mit dem Fehlen von Dendriten gezüchtet wurde, wie durch das Fehlen von MAP zwei immunpositiven Prozessen belegt wird.

Im Gegensatz dazu weist dieses Neuron, das BMP sieben ausgesetzt war, mehrere verjüngte Karte zwei immunpositive Dendriten auf, die hier gezeigt werden. Ein kultiviertes sympathisches Neuron ist fünf bis sieben Tage in Kultur vor der Behandlung mit BMP 7 und nach der Behandlung mit BMP sieben bei 30 bis 50 Nanogramm pro Milliliter für zwei Tage. Beachten Sie, dass es sich um den Beginn des dendritischen Wachstums handelt.

Die Kultur wächst sieben bis 14 Tage lang ohne bmp. Sieben. Zeigen weiterhin nur axonales Wachstum, während Kulturen mit BMP behandelt werden. Sieben. Bei 30 bis 50 Nanogramm pro Milliliter für sieben bis 14 Tage.

Zeigen robustes dendritisches Wachstum. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie SCG isoliert wird. Vorbereitung der dissoziierten Kultur sympathischer Neuronen für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und experimentelle Manipulation des dendritischen Auswuchses.