VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis

Die VisioTracker ist ein automatisiertes System für die quantitative Analyse der visuellen Leistung von Larven und kleine erwachsene Fische auf der Aufzeichnung von Augenbewegungen basieren. Es verfügt über die vollständige Kontrolle über visuelle Reiz Eigenschaften und Echtzeit-Analyse und ermöglicht High-Throughput-Forschung in Bereichen wie visuelle System Entwicklung und Funktion, Pharmakologie, neuronalen Schaltkreis Studien und sensomotorische Integration.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion des visuellen Systems bei Larven und adulten Zebrafischen zu bewerten, um mutierte Larven mit Defekten des visuellen Systems schnell zu identifizieren oder die Eigenschaften des visuellen Systems von Wildtyp- und mutierten oder morph behandelten Tieren zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Körperbewegungen des Versuchstieres zurückgehalten werden. Die Larven werden in Methylcellulose eingebettet und die erwachsenen Fische werden betäubt und in eine Immobilisierungsvorrichtung eingesetzt.

An der nächsten Stelle befindet sich das am Körper gefesselte Tier im Vizio-Tracker in der Mitte eines trommelförmigen Bildschirms. Vertikale schwarze und weiße Streifen werden mit Hilfe eines digitalen Lichtprojektors auf die Innenseite dieser Leinwand projiziert. Die Augenpositionen werden dann automatisch von dem Softwarepaket Vizio Tracker aufgezeichnet und analysiert, das auch die Augengeschwindigkeiten in Echtzeit berechnet.

Der letzte Schritt besteht darin, die erhaltenen Daten zu verarbeiten, die Augengeschwindigkeiten mit den Eigenschaften des visuellen Stimulus in Beziehung zu setzen und die durchschnittliche Augengeschwindigkeit und den Standardfehler für jede experimentelle Bedingung zu berechnen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Eigenschaften des visuellen Systems von Larven und erwachsenen Zebrafischen geben kann, kann sie auch auf andere Modellorganismen wie Medica, KPI und praktisch jede andere kleine T-Art angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als wir die optische kinetische Reaktion nutzten, um nach Pflanzenlarven zu suchen, und mich schnell für die Daten von Larven interessierten, die nicht völlig blind, sondern eher sehbehindert waren.

Solche Newton-Larven beeinflussen möglicherweise Aspekte der visuellen Verarbeitung. Das System umfasst eine Wegfahrsperre für kleine Fische, die unter einer hochwertigen Videokamera positioniert ist, die mit einem Zoomobjektiv ausgestattet ist. Der Fischbehälter ist von einem Trommelschirm umgeben, auf den computergenerierte Reizmuster projiziert werden.

Die Augenbewegungen werden mit der Kamera aufgezeichnet und von der Software Vizio Tracker automatisch in Echtzeit analysiert. Um Körperbewegungen während der Aufzeichnung zu verhindern, betten Sie die Fischlarven fünf Tage nach der Befruchtung in 3%ige Methylcellulose ein, die auf 28 Grad Celsius erwärmt wurde. Gießen Sie die warme Methylcellulose in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale und übertragen Sie die Larven dann mit einer Serumpipette mit einem großen Haken.

Mischen Sie die Larven in die Methylcellulose, dann verwenden Sie eine kleine Nadel, um Luftblasen zu entfernen und die Larve zu positionieren, bis zu acht Larven können gleichzeitig für Experimente vorbereitet werden. Sobald die Larven immobilisiert sind, stellen Sie die Zellkulturschale in ein Gestell für acht Schalen. Beginnen Sie dann, die Stimulusstreifen auf die umgebende Trommel zu projizieren, um erwachsene Fische bewegungsunfähig zu machen.

Betäuben Sie sie zunächst kurz mit 300 Milligramm pro Liter MS 2 22 in einem separaten Tank. Nach der Betäubung setzen Sie den Fisch in die Mobilisationsvorrichtung ein, indem Sie den Körper des Fisches vorsichtig zwischen zwei Stücke Schwamm richtig klemmen. Die Zurückhaltung der Körperbewegungen erwachsener Fische ist der schwierigste Schritt dieses Verfahrens.

Um das Einsetzen in die Immobilisierungsvorrichtung zu erleichtern, stabilisieren Sie den Schwamm mit zwei Wadenrohren aus Kunststoff. Sobald der Fisch bewegungsunfähig ist, setzen Sie das Gerät in den Vizio-Tracker ein und lassen Sie den Fisch sich vor der Aufnahme ein bis zwei Minuten lang erholen. Um einen Stimulus für das Augenbewegungsprojekt bereitzustellen, wird ein softwaregeneriertes Stimulusmuster bestehend aus vertikalen schwarzen und weißen Sinuswellenabstufungen auf den Trommelschirm übertragen.

Beleuchten Sie den Fisch mit dem digitalen Lichtprojektor, der im Vizio-Tracker enthalten ist, von unten mit Infrarotlicht und verwenden Sie dann das Softwarepaket, um die Augenbewegungen als Reaktion auf das Reizmuster aufzuzeichnen. Larvenstoßstangenmutanten haben eine reduzierte Linsengröße und ektopische Position der Linse, und diese morphologischen Veränderungen spiegeln sich in einer signifikanten Verringerung der Kontrastempfindlichkeit im Vergleich zum Wildtyp wider. Wie hier gezeigt, gelingt es Bumper-Mutanten zunehmend nicht, die Augengeschwindigkeit anzupassen, wenn der Stimuluskontrast abnimmt.

Wenn die Ortsfrequenz des Stimulus durch Verringerung der Breite des Stimulus erhöht wird, zeigen Stripe-Bumper-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Geschwistern auch eine verringerte Sehschärfe. Erwachsene Wildtyp-Zebrafische zeigen eine deutliche Verringerung der Kontrastempfindlichkeit, wenn sie vor der Aufzeichnung 30 Minuten lang in steigenden Alkoholkonzentrationen gehalten werden. Eine ähnliche dosisabhängige Verringerung der Gesamtaugengeschwindigkeit wird über einen breiten Bereich von Ortsfrequenzen beobachtet, wenn die Fische mit steigenden Alkoholkonzentrationen behandelt wurden.

Die Alkoholbehandlung reduziert auch dosisunabhängig die okulär-motorische Leistung bei anspruchsvolleren Aufgaben, wie hier als Reaktion auf erhöhte Reizgeschwindigkeiten nach seiner Entwicklung gezeigt. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Sehforschung, um die Entwicklung und Funktion des visuellen Systems bei Sbra-Fischen, medizinischen Goldfischen und anderen Modellorganismen sowohl anhand genetischer als auch pharmakologischer Modelle zu untersuchen.