Name: Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die Perfusionsfixierung für Nagetiere mit physiologischem Druck zur optimalen Konservierung von Rattenhirngewebe. Diese Methode ermöglicht präzise Immunhistochemie-Analysen.

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Diese Arbeit wurde vom Center for Neural Kommunikationstechnologie (CNCT), eine P41 Resource Center des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) gefördert und unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) finanziert.

1. Bereiten Sie Fixativ (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 2. Bereiten Perfusion Puffer (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 3. Bereiten Apparate-und Anästhesie <ol><li> Mit dem Wasserbad warm Perfusionspuffer bis 37 ° C. Auslaßventil Platz in einem Becherglas mit Puffer gefüllt. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Puffer und heften sich an Fixativ Schlauch. Flush Schlauch wiederholt durch Austreiben und Aberkennung der Puffer. </li><li> Deaktivieren der Linie mit Puffer, bis alle Luftblasen in dem Schlauch entfernt sind. Es ist entscheidend für den Erfolg eines Perfusion um keine Luftblasen zu einem der Linien haben. </li><li> Entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die 4% Paraformaldehyd-Fixativ (Raumtemperatur) Behälter. Um Luftblasen am Rohrende zu vermeiden, drücken das Rohr während der Positionierung des Rohrs in den Behälter, so dass ein Tropfen Puffer von dem Ende to an der Oberfläche der Flüssigkeit in dem Behälter. </li><li> Schließen der Auslaßöffnung (Nadelende). Drehen Puffer Ventil (blau) auf der gleichen Position wie das Fixiermittel Ventil (weiß). Dies ermöglicht Flow aus dem Puffer Linie nur. </li><li> Öffnen Sie die Auslassöffnung und wiederholen Sie Schritt A1 bis A3 zum Füllen des Puffers Linie. Nachdem alle Luftblasen nahe der Auslassöffnung eliminiert werden, entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Pufferbehälter, dabei nicht um Luftblasen in den Schlauch einführen. </li><li> Testsystem zur Fähigkeit, Druck durch Pumpen mit der Gummi-Manometer blub halten. Es ist normalerweise ein Widerstand durch die Kompression der Luft in dem System. </li><li> Richten Chirurgie Werkzeuge, damit leicht zugänglich. Füllen Perfusion Nadel mit Puffer, um die Möglichkeit von Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Vor der Operation wird ein Ketamin / Xylazin-Mischung (bis zu 80 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 Gauge Nadel und 1 ml-Spritze) verabreicht. Zusätzliche der Anästhesie falls erforderlich, wird im Verlauf jeder Operation, um ein chirurgisches Ebene Anästhesie beizubehalten durchgeführt werden. </li></ol> 4. Perfusion Chirurgie <ol><li> Sobald das Tier einen chirurgischen Ebene der Anästhesie erreicht hat, setzt sie auf die flache Schale mit Crushed Ice gefüllt. (Verwenden Sie Zeh Pinch-Response-Verfahren, um Narkosetiefe zu bestimmen. Tier darf nicht ansprechbar sein, bevor Sie fortfahren). </li><li> Machen Sie eine 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Sie vorsichtig die Leber von der Membran. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit den gebogenen, stumpfen Schere. Die Position und der Druck des dem Finger in der Fähigkeit, um die Membran geschnitten zu unterstützen. </li><li> Fahren Sie mit der Membran Einschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle aussetzen. </li><li> Legen gebogen, stumpf Scheren entlang einer Seite der Rippen, sorgfältig Verschieben der Lunge, und einen cut durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite. </li><li> Heben Sie das Brustbein entfernt, schneiden Sie aufmerksam alle Gewebe Anschluss an das Herz. Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. Wenn man es richtig macht, hebt die Thymusdrüse entfernt vom Herzen zusammen mit dem Brustbein und bietet einen freien Blick auf den großen Schiffen. </li><li> Einen kleinen Schnitt mit dem hinteren Ende des linken Ventrikels mit Iris Schere. </li></ol><img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol start="8"><li> Übergeben Sie eine 15-Gauge-stumpf-oder Olivenöl-bestückte Perfusion Nadel durch den Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. Die Spitze sichtbar sein soll durch die Wand der Aorta, und sollte nicht erreichen den Aortenbogen, wo die Arm-und Halsschlagadern divergieren. </li><li> Mit einer Klemme, um das Herz zu klemmen, sichert dies die Nadel und ein Auslaufen verhindert. Falls gewünscht, kann das modifizierte Gefäßklemme verwendet, um die Aorta um die Nadelspitze Klemme (diese Hämostaten werden bis zum Dissektion beginnt, wird aber von künftigen Abbildungen aus Gründen der Klarheit weggelassen werden). </li><li> Schließlich einen Einschnitt machen, um das Tier rechten Vorhof mit Iris-Schere, um so groß wie möglich einen Ausgang ohne Beschädigung der absteigenden Aorta zu schaffen. An diesem Punkt ist das Tier bereit, perfundiert werden. </li></ol> 5. Perfusion <ol><li> Öffnen und schließen Auslassöffnung zu Nadelgrundteils kümmert sich nicht um mögliche Luftblasen einzuführen. </li><li> Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg schnell &amp; gleichmäßig. Halten Sie diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. Starten Sie den Timer. </li><li> Passen Sie die Nadel Winkel. Der Winkel der Nadel ist entscheidend für die Erreichung eines maximalen Durchfluss (man beachte die Strömung Veränderung mit Winkelverstellung). </li><li> Schalten Sie den Buffer Ventil (blau), wenn Puffer ist fast fertig (200 ml). Die Flüssigkeit sollte ausgeführt werden, klar. Die Räumung der Leber ist ein Indikator für eine gute Durchblutung. Die Leber sollte an dieser Stelle klar. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Fixation Zittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden, dies sollte in Betracht gezogen der wahre Zeitpunkt der Fixierung werden. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Der Druck kann schrittweise auf bis zu einem Maximum von 130 mm Hg 2, um eine konstante Durchflussrate zu halten. </li><li> Schließen Sie das Auslassventil einmal das Fixativ fast fertig ist. Geben Sie die Endzeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Die Ratte sollte in dieser Phase steif. </li><li> Das verwendete Paraformaldehyd müssen gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden gemäß den Vorschriften Ihrer Institution. </li></ol> 6. Dissection 4,11 <ol><li> Nehmen Sie den Kopf mit einer Schere. </li><li> Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang der Haut vom Hals bis zur Nase und setzen dieSchädel. </li><li> Schneiden Sie die verbleibenden Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels freigelegt wird; entfernen Restmuskelfunktionen mit Schere oder Rongeure. </li><li> Platzieren Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, sorgfältig Verschieben der Schere entlang der Innenfläche des Schädels. </li><li> Als nächstes erstellen Sie ein Schnitt Verlängerung bis zum äußeren Rand des hinteren Schädel Oberfläche. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. </li><li> Vorsichtig die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels, während die Spitze bewegt sich von der dorsalen distalen hinteren Ecke des distalen Vorderkante des Schädels, Anheben der Schaufel, wie Sie schneiden, um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern. Der gegenüberliegenden Seite wiederholen. </li><li> Mit Rongeure peel der dorsalen Oberfläche des Schädels entfernt vom Gehirn. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit Rongeure ebenso. </li><li> Mit einem Spatel, trennen Sie die Riechkolben und nervöse Verbindunggen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns. </li><li> Sie vorsichtig in das Gehirn vom Kopf weg, Trimmen jedes Dura noch verbindet das Gehirn mit dem Schädel mittels Blende Schere. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem Fläschchen von Fixativ haltigen Flüssigkeit mindestens 10x das Volumen des Gehirns selber. Schwenken Sie die Durchstechflasche gelegentlich. </li></ol> 7. Post-Fixierung und Lagerung <ol><li> Halten Sie das Gehirn in Fixierungsmittel für 24 Stunden bei 4 ° C, gelegentlich wirbeln. </li><li> Nach 24 Stunden Waschen des Gehirns mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung durch den Austausch der Medien 3 Mal und Verwirbelung jeweils. </li><li> Gehirne können dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung aufbewahrt werden oder HBHS mit Natriumazid und bei 4 ° C </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein erster Indikator für den Erfolg der Perfusion ist die Rodung von Extremitäten wie Nase, Ohren und Pfoten und innere Organe wie der Thymusdrüse und der Leber (IHC World).Gross Inspektion des Gehirns zeigt das Blutgefäß Leere des Blutes (weiße bis hellgelbe Aussehen). Das wird auch in Gewebeschnitten Destine für die Färbung und Immunhistochemie wahr. Der letzte Indikator des Ergebnisses der Perfusion ist der Zustand der Ultrastruktur im Gewebe. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Bereiten Sie Fixativ: </td></tr><tr><td> Bereiten 8% Paraformaldehyd Lager </td></tr><tr><td><ol><li> Fügen Sie 40 g Paraformaldehyd in 500 ml dH 2 O. Erhitzen Sie die Lösung auf 60 - 65 ° C unter Rühren (nicht mehr als 65 ° C, dabei kann sich negativ auf den Erfolg der immunhistochemischen Verfahren). </li><li> Um die Lösung klar, Hitze reduzieren und 2-3 ml von 1,0 M NaOH mit einer Pipette. </li><li> Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li></ol></td></tr><tr><td> Planen 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Für die Mononatriumphosphat Lager, fügen 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O auf 1 L dH 2 O. </li><li> Für die Dinatriumhydrogenphosphat Lager, hinzuzufügen 28,4 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O </li><li> Fügen Sie 810 ml des einbasischen Lager bis 190 ml des zweibasischen Lager. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd-Fixativ </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> In gleichen Teilen 8% Paraformaldehyd Lager zu 0,2 M Natriumphosphat-Puffer </li><li> Hinweis: dieses Update wird am besten frisch zubereitet, nicht mehr als 72 Stunden im Voraus. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Perfusion und Lagerung Puffer: </td></tr><tr><td> Bereiten Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 l dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES-gepufferter Hanks Solution (HBHS) mit Natriumazid pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7,5 g NaCl, </li><li> 0,3 g KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Dextrose / Glucose </li><li> 2,4 g 10 mM Hepes </li><li> 0,1 g MgCl 2 6 Teile dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 Teile dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 Teile dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vorbereitung der Fixierlösung und Puffer. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Abbildung 1. </strong&gt; Perfusionsapparatur mit markierten Komponenten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vorbereitung des Perfusionsapparatur I. mit dem Fixativ Zeile beginnen. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer in die Spritze und durch die Leitung. Schließen Sie das Ventil auf der Nadel Ende aus. Legen Sie die Leitung in den Fixativ Fixativ Flasche ohne Einbringen von Luftblasen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 3. Herstellung der Vorrichtung Perfusion II. 1. Ventil öffnen auf dem Nadelende. 2. Schalten Puffer Ventil (blau) bis zum Fluss zu positionieren. 3. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer mit der Spritze. 4. Ventil schließen auf dem Nadelende. Setzen Sie das Rohr in die Flasche Puffer. Prüfdruck um sicherzustellen, dass das System versiegelt ist richtigly durch das Aufpumpen des Manometer Glühbirne und beobachtete die Spurweite. Die Vorrichtung ist jetzt bereit für die Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 4. Perfusion Vorrichtung in Position für den Puffer Lieferung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Abbildung 5. Perfusion Chirurgie I. a) Machen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchwand. b) Einen Einschnitt in der Membran geschnitten und an der Membran Aussetzen des Herzens. Machen parallele Schnitte auf beiden Seiten der Rippen bis zum Schlüsselbein. c) klemmen die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Abbildung 6. Perfusion Chirurgie II. a) Führen Sie die Nadel durch die Perfusion Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. b) Sichern Sie diePerfusion Nadel Verwendung eines Satzes von Hämostaten, um das Herz zu klemmen. Ein zweiter Satz von einem modifizierten Gefäßklemme kann auch verwendet werden, um die Aorta um die Nadelspitze um ein Auslaufen verhindert festzuklemmen. Mit Iris Schere einen kleinen Einschnitt zu dem hinteren Ende des linken Ventrikels. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Abbildung 7. Perfusion mit Pufferpumpe das Manometer Glühbirne zu Druck in der Leitung zu schaffen. Öffnen Sie das Ventil (1) und heften sich an der Nadel-Hub. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg und pflegen diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Abbildung 8. Perfusion mit Fixativ Sobald Puffer ist fast fertig (200 ml) schalten Sie den Puffer Ventil (1), um für das Fixativ fließen zu lassen. Der Druck kann allmählich bis zu einem erhöht werdenmaximal 130 mm Hg beträgt. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Abbildung 9. Dissection I. a) entfernen Sie den Kopf mit einem Paar Scheren. b) Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase und setzen den Schädel. c) schneiden Sie die restlichen Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels ausgesetzt ist. Halten Sie den Kopf, so dass die große Öffnung in der Schädeldecke Oberfläche (Foramen magnum) zugänglich ist. Schieben Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum und machen einen Schnitt. Wiederholen Sie das gleiche Manöver für die Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Abbildung 10. Dissection II. a) Schieben Sie die Schere entlang der Innenfläche des Schädels. Heben Sie an der Spitze, wie Sie schneiden, um Schäden am Gehirn zu verhindern. Wiederholen Sie das gleiche fürgegenüberliegenden Seite. Verwenden Sie Rongeure schälen dem Schädel entfernt vom Gehirn. b) Illustration mit dem Schädel entfernt und das Gehirn ausgesetzt. c) Mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen an der vordersten Stelle des Gehirns zu trennen. Führen Sie das Spatelspitze entlang der Unterseite des Gehirns, um Verbindungen zu erleichtern entfernen zu trennen. Entfernen Sie das Gehirn und legen es in das Fläschchen mit Fixativ.

<ol><li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li>
<li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zusätzliche Hinweise für eine erfolgreiche Operation: <ol><li> Sobald die Membran verletzt wird, vorausgehen schnell wie Hypoxie und Hyperkapnie wird irreversiblen physiologischen Veränderungen, die anschließende Analyse verfälschen können zu initiieren. </li><li> Wenn die Nadel eingeführt wird und eingespannt wird der Restdruck Blut der Basis der Nadel (Rückblende) zu drücken. In der Tat können größere Tiere zu vertreiben kräftig Blut. Es ist wichtig, dass Blut mindestens bis die Basis der Nadel zu vermeiden Einbringen von Luftblasen, die schädlich für Perfusion abzuschließen präsentieren. Wenn kein Blut an der Nadel Basis beobachtet wird, entfernen Sie die Nadel ab und füllen mit Puffer, indem Sie es mit der Auslassöffnung der Perfusion rig. Sobald Puffer hat durch die Spitze ausgeführt wurde, kann die Nadel in das Herz wieder eingesetzt werden. </li><li> Die richtige Platzierung der Nadel innerhalb der Aorta ist kritisch, sollte es nicht so weit wie der Aortenbogen erreichen. </li><li> Wenn mehrere Infusionen stattfinden ist es nicht notwendig to Einrichtung von Anfang an jedes Mal, wenn. Der Benutzer muss das richtige Volumen sowohl für den Puffer und Fixiermittel bei jeder Flasche (200 ml Tier / Lösung). Die Flaschen können auch wieder aufgefüllt, wenn nötig. Der wichtigste Aspekt ist Ausspülen der Perfusion Linie, die vom Setup für das Tier (Auslassventil) läuft. Nach dem Abschluss einer Perfusion, wird diese Zeile 4% Paraformaldehyd in ihm haben. Entfernen Sie den Schlauch von der Flasche Puffer und verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit Wasser gefüllt zu spülen, das Fixativ. Stellen Sie sicher, das Auslassventil in einem Becherglas Abfallsammlung für die ordnungsgemäße Entsorgung des Paraformaldehyd platziert wird. Wiederholen Sie dies dreimal. Refill mit Puffer mit der gleichen Methode in 2.3 dargestellt. </li><li> Dieses Verfahren zur Fixierung ist sehr anpassungsfähig mit der Fähigkeit, sowohl Puffer und Fixiermittel auch andere Fixierungsmittel (z. B. für EM verwendet) entsprechend den Anforderungen des Experiments zu ändern. </li><li> Das System wird auch häufig für die Extraktion von lebendem Gewebe verwendet. DazuVerfahren benutzt man einfach die Lieferung von Puffer nur (der Puffer Flasche, während immer noch auf ganze System angeschlossen ist in einem Eiskübel gestellt und das Fixativ Flasche ist leer, aber Setup als versiegelt). Dies gewährleistet eine kalte Perfusion Puffer an der optimalen Druck. Von hier aus kann das System zur Infusion von fixierbar Farbstoffe entweder durch Hinzufügen der Farbstoff direkt in den Zwischenspeicher (wenn die Menge kein Problem ist) oder eine Spritze mit einer minimalen Menge an Puffer / Farbstofflösung zwischen dem Puffer angepasst werden - Fixiermittel Schritt. </li><li> Bei vaskulären Gießen, ist die Drucküberwachung Puffer Schritt jedoch von entscheidender Bedeutung aufgrund der Viskosität und Verfestigen der Natur der Gießlösung entweder ein 50ml Spritze zur unmittelbaren Lieferung oder eine Einweg zweiten Befestigung der Vorrichtung verwendet werden (Schlauch, Ventil und hält Behälter) hat eine Schnittstelle mit dem aktuellen System verwendet werden. Unsere Labors &quot;vaskuläre Casting ging der Konstruktion und Fertigung des Perfusionsapparatur. Deshalb können wir nicht STgegessen, daß die Druckmessungen eine genaue Messung der Liefer-Site sein. Die Zahlen müssen eventuell angepasst, um eine erfolgreiche Bereitstellung von viskosen Flüssigkeiten zu erreichen. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Betäubungsmittel: </td></tr><tr><td> Ketamin / Xylazin-Mischung (Betäubungsmittel können je nach Labor / Institution variieren) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml Fläschchen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgie: </td></tr><tr><td> Nadelspitze, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Materiel Dienstleistungen </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Große stumpf / stumpf gebogenen Schere (~ 14,5 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Paar schöne (Graefe) Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 große Gefäßklemme Pinzette - gebogen oder gerade (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Standard Gefäßklemme Pinzette - gerade verzahnte (14 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 modifiziert Gefäßklemme (mit 15-Gauge-Loch durch die Spitze gestellt) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-Gauge-stumpf oder oliv-bestückte Nadel (Perfusion Nadel) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusion: </td></tr><tr><td> Hyperfusion System oder eine gleichwertige &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flache Schale aus Glas oder Kunststoff, ca. 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crushed Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Spritze </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair von Standard spitz / stumpf gerade Schere (~ 12 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Mittlere gebogen oder gerade Rongeure (14-16 cm) oder Schädelknochen Entfernung Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere (~ 9 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro-Spatel (Doppel 2 &quot;flachen Enden, ein abgerundet, abgeschrägt, um ein 1/8&quot;) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Postfixierung &amp; Lagerung: </td></tr><tr><td> 50 ml Glasfläschchen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES-gepufferte Hanks-Lösung (HBHS) mit Natriumazid (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

ganze tier perfusionsfixierung für nager

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Das Ziel der Fixierung ist es, schnell und gleichmäßig zu bewahren Gewebe in einem lebensbedrohlichen Zustand. Während die Platzierung direkt im Gewebe Fixativ eignet sich gut für kleine Gewebestücke, größere Exemplare wie die intakten Gehirn ein Problem darstellen, zum Eintauchen Fixierung, weil das Fixativ nicht erreicht, alle Regionen des Gewebes mit der gleichen Rate 5,7. Oft fangen sich in Reaktion auf Hypoxie, bevor das Gewebe 12 erhalten werden kann. Der Vorteil der direkt Perfusion Fixativ durch das Kreislaufsystem ist, dass die chemische lassen sich schnell erreichen jeden Winkel des Organismus mit dem natürlichen Kreislauf-Netz. Um den Kreislauf am besten zu nutzen, muss darauf geachtet werden, anzeigen lassen physiologischen Drücken 3. Es ist wichtig zu beachten, dass die physiologische Drücke abhängig von der verwendeten Art sind. Techniken für Perfusionsfixierung hängen von der zu fixierenden Gewebe abhängig und wie das Gewebe wird folgende Fixierung verarbeitet werden. In diesem Video, Beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns für die Immunhistochemie zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik (vs Schwerkraft-Systeme) ist, dass die Kreislauf-System am effektivsten genutzt wird.

Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

Das Ziel der Fixierung ist es, Gewebe schnell und gleichmäßig in einem lebensnahen Zustand zu konservieren. Während die direkte Platzierung von Gewebe in das Fixierungsmittel bei kleinen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unsere Perfusionsfixationstechnik zu demonstrieren, bei der besonderer Wert auf die Verwendung physiologischer Druckverhältnisse gelegt wird, um das Rattenhirngewebe für immunhistochemische Verfahren angemessen zu konservieren. Zunächst wird die Verwendung und Einrichtung der Perfusionsapparatur gezeigt. Anschließend werden die Werkzeuge, die sowohl für die Perfusionsoperation als auch für die Entnahme des Gehirns benötigt werden, zusammengestellt, und das tief anästhesierte Tier wird in ein flaches Tablett mit zerstoßenem Eis gelegt.Ein fünf bis sechs Zentimeter langer lateraler Einschnitt durch Integument und Bauchwand wird knapp unterhalb des Rippenbogens angelegt. Das Herz wird freigelegt und das Tier perfundiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gehirn zu entnehmen und in ein Gefäß mit Fixierflüssigkeit zu geben, deren Volumen mindestens das Zehnfache des Gehirnvolumens beträgt.Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unsere Perfusionsfixationstechnik zu demonstrieren, bei der physiologische Druckverhältnisse betont werden, um das Rattenhirngewebe für die Immunhistochemie korrekt zu konservieren. Wir beginnen mit der Vorbereitung der Perfusionsapparatur. Dies dauert etwa 10 Minuten. Spülen und reinigen Sie die Fixativleitung mithilfe einer 50-Milliliter-Spritze wiederholt mit Puffer, bis alle Luftblasen entfernt sind.Es ist entscheidend für den Erfolg einer Perfusion, dass sich in keiner der Leitungen Luftblasen befinden. Dies wird erreicht, indem das Auslassventil in einen mit Puffer gefüllten Becher gestellt wird. Schalten Sie nun das Ablaufventil aus.Entfernen Sie dann das Röhrchen von der Spritze, während Sie es zusammendrücken, sodass ein Tropfen Puffer an der Spitze hängen bleibt. Stecken Sie das gefüllte Schlauchstück, das Fixativzulaufstück, in eine Flasche mit 200 Milliliter Paraldehyd-Fixansatz pro Tier. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschleusen.Ziehen Sie die Kappe fest, und stellen Sie sicher, dass die Dichtung richtig sitzt. Wenn die Dichtung nicht korrekt sitzt, wird der Druck im geschlossenen System nicht gehalten. Stellen Sie die Flasche in die Perfusionsvorrichtung.Stellen Sie den Fluss ausschließlich über die Pufferleitung ein, indem Sie den Auslasshahn schließen und das Pufferventil in dieselbe Position wie das Fixativventil drehen. Öffnen Sie den Auslasshahn und spülen Sie die Pufferleitung, wie zuvor bei der Fixativleitung beschrieben. Sobald die Leitung gespült ist, platzieren Sie das Rohr in die Pufferflasche.Als Nächstes testen Sie die Fähigkeit des Systems, Druck zu halten. Durch das Betätigen des Gummimanometerbalgs wird ein Widerstand spürbar. Als letzte Vorbereitungsmaßnahme.Füllen Sie die Perfusionsnadel mit Puffer, um die Einführung von Luft zu verhindern. Das System ist nun bereit für die Perfusion. Nach Verabreichung eines Ketamin-Xylazin-Gemischs, das mittels der Zehenquetschmethode ungeprüft auf eine chirurgische Anästhesietiefe überprüft wurde, legen Sie die vollständig anästhesierte Ratte auf ein flaches Tablett, das mit zerstoßenem Eis gefüllt ist.Setzen Sie den Eingriff nicht fort, es sei denn, das Tier ist vollständig anästhesiert. Beginnen Sie die Operation mit einem lateralen Schnitt von fünf bis sechs Zentimeter Länge durch das Integument und die Bauchwand direkt unterhalb des Rippenbogens. Lösen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell. Erstellen Sie mit der gebogenen stumpfen Schere einen kleinen Schnitt im Zwerchfell. Die Position und der Druck Ihres Fingers können dabei helfen, das Zwerchfell zu durchtrennen. Setzen Sie den Schnitt im Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Rippenbogens fort, um die Pleurahöhle freizulegen.Platzieren Sie eine gebogene stumpfe Schere entlang einer Seite der Rippen, schieben Sie die Lunge vorsichtig beiseite und schneiden Sie durch den Rippenkorb bis zum Schlüsselbein. Führen Sie dann einen ähnlichen Schnitt auf der kontralateralen Seite durch. Heben Sie nun das Brustbein an und schneiden Sie vorsichtig das daran befestigte Gewebe, das es mit dem Herzen verbindet, ab.Die Sternumspitze mit der Hämstoppe festklemmen und die Hämstoppe über den Kopf legen. Der Thorax sollte sich dadurch anheben und eine klare Sicht auf die großen Gefäße ermöglichen. Mit Iris-Scheren eine kleine Inzision am hinteren Ende des linken Ventrikels vornehmen.Führen Sie eine Perfusionsnadel mit 15 Gauge und stumpfer oder olivenförmiger Spitze durch das durchtrennte Ventrikel in die aufsteigende Aorta ein. Die Spitze sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein, jedoch nicht bis zum Aortenbogen reichen, wo sich die Arteria brachialis und die Arteria carotis teilen. Um die Nadel zu fixieren und Leckagen zu verhindern, klemmen Sie das Herz mit einer Hämostaseklemme fest.Verwenden Sie abschließend die Iris-Schere, um eine große Ausflussöffnung im rechten Vorhof zu schaffen. Achten Sie darauf, die absteigende Aorta nicht zu beschädigen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Tier bereit zur Perfusion.Befestigen Sie die Perfusionsnadel im rechten Vorhof am Auslassanschluss, ohne Luftblasen einzuschließen, und öffnen Sie den Auslassanschluss. Pumpen Sie dann schnell und gleichmäßig den Manometerballon auf einen Druck von 80 Millimeter Quecksilbersäule auf. Halten Sie diesen Druck während des gesamten Pufferinfusionszeitraums aufrecht.Starten Sie nun eine Stoppuhr. Passen Sie den Nadelwinkel so an, dass der Fluss am stärksten ist, und wechseln Sie das Pufferventil, wenn der Puffer fast aufgebraucht ist. Die Flüssigkeit wird beginnen, klar zu laufen, wenn die Leber perfundiert ist.Dies ist ein Hinweis auf eine gute Perfusion, und der Zeitpunkt der Leberreinigung sollte sehr schnell notiert werden. Nach diesem Ereignis werden Fixationszitterungen beobachtet. Geben Sie dies als Zeitpunkt der echten Fixation an. Um eine konstante Flussrate aufrechtzuerhalten, kann der Druck schrittweise auf ein Maximum von 130 Millimetern Quecksilber erhöht werden.Wenn das Fixiermittel fast verbraucht ist, schließen Sie das Ablaufventil und notieren Sie die Zeit. Die Ratte sollte nun steif sein. Die Organe der Ratte können nun entnommen werden. Um das Gehirn zu entfernen, beginnen Sie die Sektion der fixierten Ratte, indem Sie den Kopf mit einer Gulaschschneider entfernen.Als Nächstes führen Sie einen medianen Schnitt entlang des Integuments vom Hals bis zur Nase durch und freilegen den Schädel mit einer Schere, orals. Entfernen Sie die restlichen Halsmuskeln, sodass die Schädelbasis freiliegt. Führen Sie das scharfe Ende einer Iris-Schere auf einer Seite in das Foramen magnum ein und schieben Sie die Schere vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels. Als Nächstes einen Schnitt bis zur distalen Kante der hinteren Schädeloberfläche führen. Einen identischen Schnitt auf der kontralateralen Seite anlegen. Anschließend mit dem Theros das Schädelmaterial um das Kleinhirn herum entfernen.Schieben Sie die Scheren Spitze vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels von der dorsalen distalen hinteren Ecke bis zur distalen frontalen Kante. Vermeiden Sie eine Beschädigung des Gehirns, indem Sie die Klingenspitze anheben. Wiederholen Sie während dieses Vorgangs den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite.Danach mit einer Pinzette die dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn ablösen. Die Seiten des Schädels ebenfalls mit einer Pinzette entfernen. Nun mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns durchtrennen und das Gehirn vorsichtig aus dem Kopf herauslösen.Unter Verwendung von Iris-Scheren schneiden Sie jegliche Dura durch, die das Gehirn mit dem Schädel verbindet. Sobald das Gehirn entfernt ist, legen Sie es in ein Gefäß mit Fixiermittel, das mindestens das 10-fache Volumen des Gehirns selbst aufweist. Bewahren Sie das Gefäß bei vier Grad Celsius 24 Stunden lang auf.Nach 24 Stunden das Gehirn dreimal mit PBS unter sanftem Schwenken waschen. Das Gehirn kann anschließend in PBS oder Hanks' HEPES aufbewahrt werden. Mit Natriumazid bei vier Grad Celsius können Gehirne bis zu drei Monate lang gelagert werden.Ungefärbt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die gesamte Perfusion zwischen fünf und acht Minuten abgeschlossen werden.

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