Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, unsere Perfusionsfixationstechnik zu demonstrieren, bei der physiologischer Druck zur ordnungsgemäßen Konservierung von Rattenhirngewebe für immunhistochemische Verfahren im Vordergrund steht. Zunächst wird die Verwendung und der Aufbau des Perfusionsapparates demonstriert. Dann werden die Werkzeuge zusammengebaut, die für die Durchführung der Perfusionsoperation und der Gehirnentfernung benötigt werden, und das tief betäubte Tier wird in die flache Schale gelegt, die mit zerstoßenem Eis gefüllt ist.

Ein fünf bis sechs Zentimeter langer seitlicher Schnitt durch das Integument und die Bauchdecke wird direkt unter dem Brustkorb gesetzt. Das Herz wird freigelegt und das Tier durchblutet. Der letzte Schritt besteht darin, das Gehirn zu entfernen und es in ein Fläschchen mit Fixiermittel zu legen, das Flüssigkeit enthält, die mindestens das 10-fache des Volumens des Gehirns selbst beträgt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, unsere Profusionsfixationstechnik zu demonstrieren, die die Verwendung physiologischen Drucks betont, um das Gehirngewebe von Ratten für die Immunhistochemie richtig zu konservieren. Wir beginnen mit der Vorbereitung des Perfusions-Rigs. Dies dauert ca. 10 Minuten. Spülen Sie mit einer 50-Milliliter-Spritze die Fixiermittelleitung wiederholt mit Puffer und reinigen Sie sie, bis alle Luftblasen entfernt sind.

Entscheidend für den Erfolg einer Perfusion ist, dass sich in keiner der Leitungen Luftblasen befinden. Dies wird erreicht, indem das Auslassventil in ein mit Puffer gefülltes Becherglas eingesetzt wird. Schalten Sie nun das Auslassventil aus.

Entfernen Sie dann den Schlauch von der Spritze, während Sie ihn zusammendrücken, so dass ein Tropfen Puffer am Ende hängt. Geben Sie den gefüllten Schlauch, den Einlass des Fixiermittels, in eine Flasche mit 200 Millilitern Paraldehyd-Fixiermittel pro Tier. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu bilden.

Ziehen Sie die Kappe fest und stellen Sie sicher, dass die Dichtung richtig sitzt. Wenn es nicht richtig sitzt, hält der Druck innerhalb des geschlossenen Systems nicht stand. Setze die Flasche in die Perfusions-Rig ein.

Stellen Sie den Durchfluss nur von der Pufferleitung ein, indem Sie die Auslassöffnung schließen und das Pufferventil in die gleiche Position wie das Fixierventil drehen. Öffnen Sie den Auslassanschluss und löschen Sie die Pufferleitung, wie Sie es zuvor für die Fixierleitung getan haben. Sobald die Leitung frei ist, legen Sie das Röhrchen in die Pufferflasche.

Testen Sie als Nächstes die Fähigkeit des Systems, Druck zu halten. Durch das Pumpen der Gummimanometerbirne entsteht Widerstand. Als letzte Vorbereitung.

Füllen Sie die Perfusionsnadel mit Puffer, um das Eindringen von Luft zu verhindern. Das System ist nun bereit für die Perfusion. Nachdem Sie eine Ketamin-Xylazin-Mischung ungeprüft für eine chirurgische Anästhesieebene mit der Zehenkneifmethode verabreicht haben, legen Sie die vollständig anästhesierte Ratte auf ein flaches Tablett, das mit zerstoßenem Eis gefüllt ist.

Fahren Sie nicht fort, es sei denn, das Tier ist vollständig betäubt. Beginnen Sie die Operation mit einem fünf bis sechs Zentimeter langen seitlichen Schnitt durch das Integument und die Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Trenne die Leber vorsichtig vom Zwerchfell.

Machen Sie mit der gebogenen stumpfen Schere einen kleinen Schnitt in das Zwerchfell. Die Position und der Druck Ihres Fingers können dazu beitragen, das Zwerchfell zu durchtrennen. Setzen Sie den Zwerchfellschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs fort, um die Pleurahöhle freizulegen.

Platzieren Sie eine gebogene stumpfe Schere entlang einer Seite der Rippen, verschieben Sie vorsichtig die Lunge und machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie dann einen ähnlichen Schnitt auf der kontralateralen Seite. Hebe nun das Brustbein weg und schneide vorsichtig das Gewebe ab, um es mit dem Herzen zu verbinden.

Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit dem Blutstillstand fest und platzieren Sie den Blutstillstand über dem Kopf. Die Thur sollte abheben und eine klare Sicht auf die großen Schiffe bieten. Machen Sie mit einer Irisschere einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels.

Führen Sie eine 15-Gauge-Perfusionsnadel mit stumpfer oder olivfarbener Spitze durch den geschnittenen Ventrikel in die aufsteigende Aorta. Die Spitze sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein und nicht den Aortenbogen erreichen, wo die Arteria brachialis und die Halsschlagader auseinandergehen. Um die Nadel zu sichern und ein Auslaufen zu verhindern, klemmen Sie das Herz mit einem Hämostaten fest.

Zum Schluss machst du mit der Irisschere einen großen Auslass im rechten Vorhof. Achten Sie darauf, die absteigende Aorta nicht zu beschädigen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Tier bereit, durchblutet zu werden.

Befestigen Sie die Perfusionsnadel im rechten Vorhof an der Outlook-Öffnung, ohne dass Luftblasen entstehen, und öffnen Sie die Outlook-Öffnung. Pumpen Sie dann die Manometerbirne schnell und gleichmäßig auf einen Druck von 80 Millimetern Quecksilbersäule auf. Halten Sie diesen Druck während der gesamten Pufferinfusionszeit aufrecht.

Starten Sie nun einen Timer. Stellen Sie den Nadelwinkel so ein, dass der Durchfluss am stärksten ist, und schalten Sie das Pufferventil um, wenn der Puffer fast fertig ist. Die Flüssigkeit beginnt klar zu werden, wenn die Leber durchblutet wird.

Dies ist ein Hinweis auf eine gute Durchblutung und der Zeitpunkt der Leberreinigung sollte sehr schnell notiert werden. Nach diesem Ereignis wird ein Fixationszittern beobachtet. Gib dies als die Zeit der wahren Fixierung an. Um eine konstante Durchflussrate aufrechtzuerhalten, kann der Druck schrittweise auf maximal 130 Millimeter Quecksilbersäule erhöht werden.

Wenn das Fixiermittel fast fertig ist, schließen Sie das Auslassventil und notieren Sie sich die Uhrzeit. Die Ratte sollte nun steif sein. Die Organe der Ratte können nun entnommen werden Um das Gehirn zu entfernen, beginnen Sie mit der Dissektion der fixierten Ratte, indem Sie den Kopf mit einer Guillotine entfernen.

Machen Sie als nächstes einen Mittellinienschnitt entlang des Integuments vom Hals bis zur Nase und legen Sie den Schädel mit einer Schere frei. Schneiden Sie den verbleibenden Nackenmuskel ab, so dass die Schädelbasis freiliegt. Stecken Sie das scharfe Ende einer Irisschere in die Blende und die Magnum auf einer Seite und schieben Sie die Schere vorsichtig an der Innenseite des Schädels entlang.

Machen Sie als nächstes einen Schnitt, der sich bis zum distalen Rand der hinteren Schädeloberfläche erstreckt. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der kontralateralen Seite. Verwenden Sie dann Theros, um den Schädel um das Kleinhirn herum zu entfernen.

Schieben Sie die Spitze der Schere vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels von der dorsalen distalen hinteren Ecke zur distalen Stirnleiste. Vermeiden Sie eine Schädigung des Gehirns, indem Sie die Spitze der Klinge anheben. Wiederholen Sie dies während dieses Vorgangs und schneiden Sie auf der gegenüberliegenden Seite.

Schälen Sie dann mit rohen Stoffen die dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn weg. Schneide auch die Seiten des Schädels mit rohen Schädeln ab. Trennen Sie nun mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der Bauchoberfläche des Gehirns und ziehen Sie das Gehirn vorsichtig vom Kopf weg.

Schneiden Sie mit einer Irisschere die Dura ab, die das Gehirn mit dem Schädel verbindet. Sobald das Gehirn entfernt ist, legen Sie es in ein Fläschchen mit Fixiermittel, das mindestens das 10-fache des Volumens des Gehirns selbst hat. Lagern Sie das Fläschchen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie das Gehirn nach 24 Stunden mit PB S3 mal unter sanftem Schwenken. Das Gehirn kann dann in PBS oder heis Hanks gespeichert werden. Mit Natriumazid bei vier Grad Celsius können Gehirne drei Monate lang gelagert werden.

Nicht unterteilt. Einmal gemeistert, konnte die gesamte Perfusion zwischen fünf und acht Minuten abgeschlossen werden.