Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unsere Perfusionsfixationstechnik zu demonstrieren, bei der besonderer Wert auf die Verwendung physiologischer Druckverhältnisse gelegt wird, um das Rattenhirngewebe für immunhistochemische Verfahren angemessen zu konservieren. Zunächst wird die Verwendung und Einrichtung der Perfusionsapparatur gezeigt. Anschließend werden die Werkzeuge, die sowohl für die Perfusionsoperation als auch für die Entnahme des Gehirns benötigt werden, zusammengestellt, und das tief anästhesierte Tier wird in ein flaches Tablett mit zerstoßenem Eis gelegt.

Ein fünf bis sechs Zentimeter langer lateraler Einschnitt durch Integument und Bauchwand wird knapp unterhalb des Rippenbogens angelegt. Das Herz wird freigelegt und das Tier perfundiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gehirn zu entnehmen und in ein Gefäß mit Fixierflüssigkeit zu geben, deren Volumen mindestens das Zehnfache des Gehirnvolumens beträgt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unsere Perfusionsfixationstechnik zu demonstrieren, bei der physiologische Druckverhältnisse betont werden, um das Rattenhirngewebe für die Immunhistochemie korrekt zu konservieren. Wir beginnen mit der Vorbereitung der Perfusionsapparatur. Dies dauert etwa 10 Minuten. Spülen und reinigen Sie die Fixativleitung mithilfe einer 50-Milliliter-Spritze wiederholt mit Puffer, bis alle Luftblasen entfernt sind.

Es ist entscheidend für den Erfolg einer Perfusion, dass sich in keiner der Leitungen Luftblasen befinden. Dies wird erreicht, indem das Auslassventil in einen mit Puffer gefüllten Becher gestellt wird. Schalten Sie nun das Ablaufventil aus.

Entfernen Sie dann das Röhrchen von der Spritze, während Sie es zusammendrücken, sodass ein Tropfen Puffer an der Spitze hängen bleibt. Stecken Sie das gefüllte Schlauchstück, das Fixativzulaufstück, in eine Flasche mit 200 Milliliter Paraldehyd-Fixansatz pro Tier. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschleusen.

Ziehen Sie die Kappe fest, und stellen Sie sicher, dass die Dichtung richtig sitzt. Wenn die Dichtung nicht korrekt sitzt, wird der Druck im geschlossenen System nicht gehalten. Stellen Sie die Flasche in die Perfusionsvorrichtung.

Stellen Sie den Fluss ausschließlich über die Pufferleitung ein, indem Sie den Auslasshahn schließen und das Pufferventil in dieselbe Position wie das Fixativventil drehen. Öffnen Sie den Auslasshahn und spülen Sie die Pufferleitung, wie zuvor bei der Fixativleitung beschrieben. Sobald die Leitung gespült ist, platzieren Sie das Rohr in die Pufferflasche.

Als Nächstes testen Sie die Fähigkeit des Systems, Druck zu halten. Durch das Betätigen des Gummimanometerbalgs wird ein Widerstand spürbar. Als letzte Vorbereitungsmaßnahme.

Füllen Sie die Perfusionsnadel mit Puffer, um die Einführung von Luft zu verhindern. Das System ist nun bereit für die Perfusion. Nach Verabreichung eines Ketamin-Xylazin-Gemischs, das mittels der Zehenquetschmethode ungeprüft auf eine chirurgische Anästhesietiefe überprüft wurde, legen Sie die vollständig anästhesierte Ratte auf ein flaches Tablett, das mit zerstoßenem Eis gefüllt ist.

Setzen Sie den Eingriff nicht fort, es sei denn, das Tier ist vollständig anästhesiert. Beginnen Sie die Operation mit einem lateralen Schnitt von fünf bis sechs Zentimeter Länge durch das Integument und die Bauchwand direkt unterhalb des Rippenbogens. Lösen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell.

Erstellen Sie mit der gebogenen stumpfen Schere einen kleinen Schnitt im Zwerchfell. Die Position und der Druck Ihres Fingers können dabei helfen, das Zwerchfell zu durchtrennen. Setzen Sie den Schnitt im Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Rippenbogens fort, um die Pleurahöhle freizulegen.

Platzieren Sie eine gebogene stumpfe Schere entlang einer Seite der Rippen, schieben Sie die Lunge vorsichtig beiseite und schneiden Sie durch den Rippenkorb bis zum Schlüsselbein. Führen Sie dann einen ähnlichen Schnitt auf der kontralateralen Seite durch. Heben Sie nun das Brustbein an und schneiden Sie vorsichtig das daran befestigte Gewebe, das es mit dem Herzen verbindet, ab.

Die Sternumspitze mit der Hämstoppe festklemmen und die Hämstoppe über den Kopf legen. Der Thorax sollte sich dadurch anheben und eine klare Sicht auf die großen Gefäße ermöglichen. Mit Iris-Scheren eine kleine Inzision am hinteren Ende des linken Ventrikels vornehmen.

Führen Sie eine Perfusionsnadel mit 15 Gauge und stumpfer oder olivenförmiger Spitze durch das durchtrennte Ventrikel in die aufsteigende Aorta ein. Die Spitze sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein, jedoch nicht bis zum Aortenbogen reichen, wo sich die Arteria brachialis und die Arteria carotis teilen. Um die Nadel zu fixieren und Leckagen zu verhindern, klemmen Sie das Herz mit einer Hämostaseklemme fest.

Verwenden Sie abschließend die Iris-Schere, um eine große Ausflussöffnung im rechten Vorhof zu schaffen. Achten Sie darauf, die absteigende Aorta nicht zu beschädigen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Tier bereit zur Perfusion.

Befestigen Sie die Perfusionsnadel im rechten Vorhof am Auslassanschluss, ohne Luftblasen einzuschließen, und öffnen Sie den Auslassanschluss. Pumpen Sie dann schnell und gleichmäßig den Manometerballon auf einen Druck von 80 Millimeter Quecksilbersäule auf. Halten Sie diesen Druck während des gesamten Pufferinfusionszeitraums aufrecht.

Starten Sie nun eine Stoppuhr. Passen Sie den Nadelwinkel so an, dass der Fluss am stärksten ist, und wechseln Sie das Pufferventil, wenn der Puffer fast aufgebraucht ist. Die Flüssigkeit wird beginnen, klar zu laufen, wenn die Leber perfundiert ist.

Dies ist ein Hinweis auf eine gute Perfusion, und der Zeitpunkt der Leberreinigung sollte sehr schnell notiert werden. Nach diesem Ereignis werden Fixationszitterungen beobachtet. Geben Sie dies als Zeitpunkt der echten Fixation an. Um eine konstante Flussrate aufrechtzuerhalten, kann der Druck schrittweise auf ein Maximum von 130 Millimetern Quecksilber erhöht werden.

Wenn das Fixiermittel fast verbraucht ist, schließen Sie das Ablaufventil und notieren Sie die Zeit. Die Ratte sollte nun steif sein. Die Organe der Ratte können nun entnommen werden. Um das Gehirn zu entfernen, beginnen Sie die Sektion der fixierten Ratte, indem Sie den Kopf mit einer Gulaschschneider entfernen.

Als Nächstes führen Sie einen medianen Schnitt entlang des Integuments vom Hals bis zur Nase durch und freilegen den Schädel mit einer Schere, orals. Entfernen Sie die restlichen Halsmuskeln, sodass die Schädelbasis freiliegt. Führen Sie das scharfe Ende einer Iris-Schere auf einer Seite in das Foramen magnum ein und schieben Sie die Schere vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels.

Als Nächstes einen Schnitt bis zur distalen Kante der hinteren Schädeloberfläche führen. Einen identischen Schnitt auf der kontralateralen Seite anlegen. Anschließend mit dem Theros das Schädelmaterial um das Kleinhirn herum entfernen.

Schieben Sie die Scheren Spitze vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels von der dorsalen distalen hinteren Ecke bis zur distalen frontalen Kante. Vermeiden Sie eine Beschädigung des Gehirns, indem Sie die Klingenspitze anheben. Wiederholen Sie während dieses Vorgangs den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite.

Danach mit einer Pinzette die dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn ablösen. Die Seiten des Schädels ebenfalls mit einer Pinzette entfernen. Nun mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns durchtrennen und das Gehirn vorsichtig aus dem Kopf herauslösen.

Unter Verwendung von Iris-Scheren schneiden Sie jegliche Dura durch, die das Gehirn mit dem Schädel verbindet. Sobald das Gehirn entfernt ist, legen Sie es in ein Gefäß mit Fixiermittel, das mindestens das 10-fache Volumen des Gehirns selbst aufweist. Bewahren Sie das Gefäß bei vier Grad Celsius 24 Stunden lang auf.

Nach 24 Stunden das Gehirn dreimal mit PBS unter sanftem Schwenken waschen. Das Gehirn kann anschließend in PBS oder Hanks' HEPES aufbewahrt werden. Mit Natriumazid bei vier Grad Celsius können Gehirne bis zu drei Monate lang gelagert werden.

Ungefärbt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die gesamte Perfusion zwischen fünf und acht Minuten abgeschlossen werden.